Update. Diagnostic DIAGNOSTICA DELL EMOSTASI. 1. Fisiologia. 2. Disturbi di coagulazione
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- Marcellina Riccio
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1 Diagnostic Update Settembre 14 DIAGNOSTICA DELL EMOSTASI 1. Fisiologia Per ridurre il più possibile le perdite ematiche, l organismo reagisce alle lesioni dei vasi sanguigni con l attivazione di processi complessi che portano alla cessazione dell emorragia ed alla riparazione delle pareti dei vasi. In questo processo sono coinvolti i seguenti meccanismi: vasocostrizione formazione di un aggregato trombocitario (emostasi primaria) cascata coagulativa (emostasi secondaria) fibrinolisi Questi meccanismi vengono attivati quando il sangue entra in contatto con strutture subendoteliali (fibre di collagene, membrana basale) o con tessuti (liberazione di tromboplastina tissutale, di fosfolipidi). Figura 1: emostasi primaria e secondaria trombocita inattivo fibrinogeno trombocita attivato intima subendotelio vwf collagene trombo primario trombo secondario 1.1. Emostasi primaria Al momento di una lesione dei vasi sanguigni si verifica di riflesso una vasocostrizione ed un aggregazione dei trombociti alle fibre di collagene libere. L adesione dei trombociti viene mediata dal fattore di von Willebrand (vwf), sintetizzato e secreto dalle cellule endoteliali. L aggregato trombocitario produce una prima chiusura labile della lesione Emostasi secondaria Con l avvio della produzione di fibrina, che va a depositarsi, formare intrecci ed aderire alle pareti dei vasi sanguigni, il coagulo instabile si evolve in un trombo di fibrina trombocitaria stabile. La formazione di fibrina a partire dal fibrinogeno è il risultato della cascata coagulativa del plasma, composta dal sistema estrinseco ed intrinseco nonché dalla via comune finale (cfr. figura 2). La divisione della cascata coagulativa in un sistema intrinseco ed uno estrinseco risulta molto utile per l interpretazione dei test di coagulazione in vitro. Nel frattempo è peraltro noto che l attivazione ed il mantenimento in vivo della cascata coagulativa sono molto più complessi. L attivazione del sistema estrinseco avviene tramite la tromboplastina tissutale liberata in seguito a lesioni dei tessuti, quella del sistema intrinseco invece attraverso il contatto del sangue con il collagene subendoteliale (superficie esogena). Una volta terminata la formazione del coagulo di fibrina, si verifica una retrazione dei filamenti fibrinici ed un ulteriore stabilizzazione del trombo piastrinico. 1.3 Inibitori della coagulazione Dopo che la coagulazione si è rivelata necessaria in un determinato punto dell organismo, occorre evitare che essa diventi un processo sistemico, limitandola al punto in cui si è verificato il trauma vascolare. Esistono diversi meccanismi in grado di inibire la coagulazione: la sostanza anticoagulante principale è l antitrombina III (AT III). Come si può già dedurre dal nome, l AT III (insieme all eparina) disattiva la trombina. Avendo quest ultima un ruolo decisivo nella produzione della fibrina, l AT III è in grado di arrestare una produzione eccessiva di fibrina Fibrinolisi Nell ultima fase dell emostasi ha luogo l eliminazione del trombo attraverso la scissione della fibrina con un enzima fibrinolitico: la plasmina. Esistono diversi attivatori che trasformano il plasminogeno in plasmina. Infine il tessuto di riparazione sostituisce il trombo. 2. Disturbi di coagulazione È più comune che siano i cani ad essere portati in ambulatorio per i sintomi di un disturbo della coagulazione rispetto ai gatti. I disturbi della coagulazione possono essere ereditari o acquisiti e si dividono nelle seguenti categorie:
2 2.1 Disturbi dell emolisi primaria trombocitopenie trombocitopatie malattia di von Willebrand vasopatie (rare) Le principali malattie caratterizzate da disturbi dell emolisi primaria sono le trombocitopenie, le trombocitopatie e la malattia di von Willebrand. La trombocitopenia è il disturbo emostatico più diffuso nei cani e nei gatti, dovuto alle cause più diverse (cfr. tabella 1). Le disfunzioni trombocitarie (trombocitopatie) possono essere ereditarie o acquisite. Dal momento che i test di funzionalità piastrinica sono difficili da eseguire, è probabile che tali patologie siano sottodiagnosticate. La rilevanza clinica delle trombocitopatie è molto variabile. Esistono numerosi farmaci che possono compromettere la funzionalità piastrinica: un esempio noto di farmaco con effetto antipiastrinico è l aspirina. La malattia di von Willebrand si presenta sotto tre forme diverse, che si differenziano tra loro per il tipo e la quantità dei vari multimeri presenti. Alcune razze sono più frequentemente colpite che non altre. I sintomi possono rimanere a livello subclinico o manifestarsi sotto forma emorragica. Per la diagnosi occorre determinare l antigene del vwf (da plasma citrato congelato). In alcune razze si conosce la localizzazione del difetto genetico, che può così venire diagnosticato tramite PCR (da sangue EDTA). Tabella 1: Cause di trombocitopenia 1. Diminuzione della produzione (rara, talvolta in combinazione con leucopenia ed anemia) tumori del midollo spinale (mieloma, leucosi) mielofibrosi ipoplasia o aplasia del midollo spinale (idiopatica) ehrlichiosi tossine, farmaci (estrogeni, sulfonamidi, cloramfenicoli, citostatici) indotta eventualmente da vaccino: rabbia, parvovirosi (cani), parvovirosi (gatti) FeLV, FIV 2. Aumento dell attività e del consumo emorragie gravi coagulazione intravasale disseminata (DIC) microangiopatia (emangioma/sarcoma) ipotermia infezioni 3. Aumento dell eliminazione (lisi) immunomediata (primaria o secondaria, incidenza maggiore nei: cocker spaniel, old english sheepdog (bobtail), pastore tedesco, barboncino) eventualmente indotta da vaccino (cimurro) farmaci (p.es. fenilbutazone) infezioni (FeLV, FIV, ehrlichiosi, anaplasmosi, leishmaniosi, babesiosi, dirofilariosi ecc.) Figura 2: cascata di coagulazione sistema intrinseco sistema estrinseco VII VII aptt tempo di trombina X V II protrombina I fibrinogeno PT (Quick) coagulo via finale comune
3 2.2 Disturbi dell emostasi secondaria I disturbi dell emostasi secondaria possono essere congeniti o acquisiti. Una carenza dei fattori coagulativi è il disturbo congenito più grave: la patologia più frequente è l emofilia A, in cui il fattore VIII è presente in quantità insufficiente. L emofilia B è invece caratterizzata da una carenza del fattore IX. Tra le cause più comuni di un disturbo acquisito dell emostasi secondaria vi sono le malattie epatiche, una carenza di vitamina K o neoplasie. Al fegato fanno capo diverse funzioni coagulative: qui avviene la sintesi tanto dei fattori quanto degli inibitori della coagulazione, oltre che della fibrinolisi. Inoltre il fegato influisce sull eliminazione dei fattori attivati ed è il luogo dell attivazione dei fattori II, VII, IX e X in dipendenza dalla vitamina K. Benché molti cani e gatti affetti da un epatopatia presentino valori anomali nei test di coagulazione, le emorragie spontanee sono molto rare. Più comuni in questi pazienti sono invece emorragie in seguito ad interventi chirurgici, a biopsie del fegato o ad ulcerazioni gastrointestinali. La vitamina K è una vitamina liposolubile, che viene riassorbita dal cibo nell intestino tenue e sintetizzata nell ileo e nel colon dalla flora batterica, per poi essere immagazzinata nel fegato. La causa più comune di una carenza di vitamina K nei cani e nei gatti è un intossicazione da cumarinici, ma essa può essere dovuta anche a gravi alterazioni infiammatorie dell intestino, ad un insufficienza pancreatica esocrina, ad un ostruzione completa dei condotti biliari o ad una terapia antibiotica cronica. Le neoplasie possono provocare disturbi della coagulazione per mezzo di diversi meccanismi. Nel cane sono soprattutto il linfosarcoma, la leucemia e l emangioma/sarcoma ad essere associati a disturbi della coagulazione. 2.3 Disturbi combinati dell emostasi primaria e secondaria Nella coagulazione intravasale disseminata (DIC) i fattori costituenti dell emostasi sia primaria che secondaria sono alterati. La DIC, denominata anche coagulopatia da consumo, è sempre una patologia secondaria. La malattia primaria produce una trombosi, a cui si devono sia il consumo dei fattori di coagulazione e dei trombociti sia l attivazione di una fibrinolisi incontrollata. Fra le conseguenze si possono avere forti emorragie, ipossia, blocco della funzionalità organica ed infine la morte. 3 Diagnosi dei disturbi dell emostasi 3.1 Indicazioni per l analisi del sistema emostatico verificarsi di emorragie spontanee in diverse parti del corpo (petecchie, ecchimosi, ematomi, emotorace, emoperitoneo, emartro) emorragie di origine traumatica, più forti di quanto la gravità del trauma non possa far prevedere (sospetta) assunzione di rodenticidi o altre tossine malattie che accompagnano i disturbi emostatici (epatopatie) sospetto di coagulopatia intravasale disseminata (DIC, p.es. in collegamento con una neoplasia, con anemia emolitica immunomediata, malattie infettive, shock, torsione dello stomaco, pancreatite, trauma) screening preoperatorio controllo di una terapia con anticoagulanti e di una terapia fibrinolitica 3.2 Descrizione, anamnesi e sintomi clinici Un anamnesi accurata può dare indicazioni sull eziologia: età dell animale (disturbo congenito più probabile negli animali giovani, disturbo acquisito invece negli animali adulti) razza (cfr. tabella 2) incidenza di fenomeni emorragici a livello familiare (indicativo di un disturbo congenito) problemi di coagulazione già noti in passato (ricambio dentale, interventi chirurgici) vaccinazioni nelle settimane precedenti (eventuale fattore scatenante di una trombocitopenia di carattere immunitario), somministrazione di determinati farmaci soggiorno in zone endemiche/infestazione da zecche (sospetto di ehrlichiosi, anaplasmosi, babesiosi, leishmaniosi ecc.) presenza contemporanea di altre malattie (epatopatie) possibilità di assunzione involontaria di rodenticidi Per un ulteriore chiarimento eziologico è utile osservare l esatta localizzazione dell emorragia: se si è in presenza di un disturbo dell emostasi primaria (trombocitopenia, trombocitopatia, malattia di von Willebrand), si hanno petecchie, ecchimosi e porpore. Raramente appaiono ematomi, mentre sono tipicamente più frequenti emorragie superficiali (delle gengive, del tratto gastrointestinale, della sclera e della retina). In seguito ad un prelievo di sangue l emorragia si manifesta immediatamente. In caso di difetto della coagulazione plasmatica (secondaria) pre-
4 valgono invece ematomi di grande estensione, con forti emorragie nella muscolatura, nelle articolazioni e nelle cavità corporee. Dopo un prelievo venoso l emorragia si manifesta con ritardo. In caso di epistassi la differenzia-zione è difficile, poiché tale sintomo è caratteristico di difetti emostatici sia primari che secondari. 3.3 Prelievo del sangue e fase preanalitica La determinazione del numero di trombociti per il chiarimento di disturbi dell emostasi primaria viene effettuata su sangue EDTA. Con il sistema IDEXX Coag Dx si possono determinare in ambulatorio i parametri PT e aptt da sangue intero o sangue citrato. Il risultato è disponibile nell arco di pochi minuti. Per la misurazione dei parametri di coagulazione nel laboratorio di referenza e per la determinazione dei vari fattori di coagulazione si richiede plasma citrato congelato. Si consiglia l uso di contenitori coibentati appositamente predisposti, ordinabili presso IDEXX Vet Med Lab. Le provette per la coagulazione contengono una soluzione di citrato di sodio di 0,11 mol/l e devono venire riempite fino alla marcatura indicata, in modo da ottenere esattamente una miscela composta da una parte di plasma citrato e da nove parti di sangue. Se non si dispone delle provette con citrato già pronte in commercio, utilizzare una siringa da 2 ml preparata con 0,2 ml di citrato di una soluzione di sodio citrato di 0,11 molare (= 3,8%), immettere 1,8 ml di sangue e miscelare quindi il contenuto della siringa. Ogni volta che si sospetta un disturbo di coagulazione, il prelievo va eseguito con Tabella 2: coagulopatie congenite Fattori di Malattie Razze PT coagulazione ereditarie aptt Fattori II carenza di cocker spaniel, PT protrombina boxer aptt Fattori VII carenza del beagle, PT fattore VII alaskan malamute Fattori VIII carenza di molte razze, p. es. aptt protrombina pastore tedesco, husky siberiano Fattori IX emofilia B molte razze, p. es. aptt pastore tedesco Fattori X carenza del cocker spaniel, jack PT fattore X russel terrier, springer aptt spaniel inglese, kerry blue terrier Fattori XI carenza del cane pastore dei aptt fattore XI pirenei, springer spaniel inglese, kerry blue terrier Fattori XII carenza del molti gatti senza aptt fattore XII manifestazioni cliniche particolari misure precauzionali. Esso deve avvenire nel modo meno traumatico possibile, evitando di bloccare le vene troppo a lungo con il laccio emostatico. Ciò allo scopo di evitare la liberazione di tromboplastina tissutale (che attiverebbe la coagulazione) e la conseguente attivazione dei trombociti ovvero della fibrinolisi, cosa che potrebbe ugualmente falsificare i parametri di coagulazione. Se possibile, le prime gocce di sangue devono essere usate per ottenere il siero oppure eliminate, utilizzando solo il secondo campione per i test di coagulazione. Non meno decisiva, per evitare di ottenere risultati falsi, è la corretta preparazione del campione: riempire la provetta con sodio citrato esattamente fino alla marcatura (i vacutainer vengono riempiti automaticamente fino alla marcatura) miscelare dolcemente ma rapidamente controllare il campione ematico. Campioni con coaguli non sono idonei. In ambulatorio il sangue ottenuto in questo modo può essere utilizzato per l analisi con Coag Dx. Se il campione viene spedito a IDEXX Vet Med Lab, bisogna ricorrere a plasma citrato da inviare congelato: centrifugazione il campione possibilmente subito dopo il prelievo (5 10 min. a 3500 giri/min.) togliere con pipetta il surnatante ( = plasma citrato) e trasferirlo in una provetta senza anticoagulante congelare il plasma e conservare fino alla spedizione a 20 C Per il trasporto di campioni congelati IDEXX Vet Med Lab mette a disposizione contenitori portaprovette speciali, che devono essere conservati nel congelatore per almeno 24 ore prima del trasporto affinché i campioni possano arrivare in laboratorio ancora congelati. Da non dimenticare che lipemia o emolisi possono falsificare i risultati Test di coagulazione Disturbi dell emostasi primaria Numero delle piastrine (PLT) Come primo test si deve eseguire una conta piastrinica. In casi di emergenza uno striscio ematico a colorazione rapida può risultare già utile per la valutazione di un eventuale trombocitopenia (in modo da escludere aggregati di trombociti e da avere una stima approssimativa del loro numero). Con olio di immersione (1000x) dovrebbero risultare visibili nel campo visivo trombociti nel cane e nel gatto. Generalmente un trombocita rappresenta circa trombociti per μl (numero dei trombociti/campo in olio di immersione x = trombociti/μl). In caso di trombocitopenie con < trombociti/μl possono verificarsi emorragie spontanee.
5 Tempo di sanguinamento della mucosa buccale (BMBT) Un test di screening praticabile in ambulatorio in caso di disturbi dell emostasi primaria è la determinazione del tempo di emorragia delle mucose. Esecuzione: Il labbro superiore del cane viene fissato in alto con una garza. Sulla superficie della mucosa viene fissato un Surgicutt (ditta Megacor) e attivato in modo da provocare un emorragia capillare superficiale. Il tempo che intercorre fino al termine del sanguinamento viene cronometrato, il sangue che fuoriesce viene aspirato ogni 10 secondi con carta assorbente, badando a non toccare il punto dell incisione. Nel cane un tempo normale di sanguinamento della mucosa buccale è inferiore ai 4 minuti. Nel gatto, in cui questo test è generalmente possibile soltanto sotto sedazione, è opportuno ricorrere ai piccoli kit ad uso pediatrico. Nei gatti il tempo normale di sanguinamento della mucosa buccale è inferiore a 1,5 2 minuti. Il tempo di sanguinamento della mucosa buccale dipende in modo determinante dalla velocità di formazione e dalla solidità del trombo piastrinico primario e rispecchia così soprattutto il numero di trombociti e la loro funzione. Un tempo di sanguinamento della mucosa buccale prolungato indica perciò una trombocitopenia, un disturbo della funzionalità dei trombociti oppure una sensibile diminuzione del fattore von Willebrand. Di queste la patologia più frequente è la trombocitopenia, le cui cause possibili sono indicate nella tabella 1. Se il numero di trombociti si trova nel range di normalità, la fase successiva consiste nella determinazione dell attività del fattore von Willebrand utilizzando plasma citrato (congelato). Le trombocitopatie si presentano raramente sotto forma di malattie congenite. Fra le cause di una trombocitopatia acquisita sono da menzionare le anemie (croniche-rigenerative o nonrigenerative), DIC, paraproteinemie (leucosi linfatica, mieloma multiplo), colestasi, shunt portosistemico, uremie e farmaci Disturbi dell emostasi secondaria Test di screening della coagulazione plasmatica Quick Test (sinonimi: tempo di protrombina (PT), tempo di tromboplastina) Il Quick Test rileva i disturbi del sistema estrinseco e della via finale comune, p.es. in caso di carenza del fattore VII, di avvelenamento da cumarinici, di epatopatie e di DIC. da cumarina, di epatopatie, di DIC, ma anche dopo somministrazione di eparina. Con questi due test si può eseguire una verifica dell intero sistema di coagulazione plasmatica. I test possono essere eseguiti in ambulatorio nell arco di pochi minuti con il sistema IDEXX Coag Dx. Tempo di trombina (TT), concentrazione di fibrinogeno Il tempo di trombina è un test di screening della concentrazione di fibrinogeno e della capacità da parte della trombina di trasformare il fibrinogeno in fibrina. Un prolungamento del tempo di trombina si verifica in caso di ipofibrinogenemia o di disturbi della formazione della fibrina. La concentrazione di fibrinogeno può subire una riduzione a causa di una diminuzione della produzione (p.es. in caso di epatopatie gravi) o a causa di un consumo aumentato (p.es. in caso di DIC). Si hanno p.es. disturbi di produzione della fibrina quando l azione della trombina viene inibita dall eparina o dalla presenza di prodotti di metabolizzazione della fibrina (in caso di DIC). Determinazione dei fattori di coagulazione Se sulla base dei test di screening della coagulazione plasmatica si sospetta una carenza ereditaria di singoli fattori (p.es. nel caso di un aptt selettivamente prolungato), si consiglia di procedere alla determinazione dell attività dei singoli fattori. La percentuale di un fattore specifico viene calcolata in rapporto alla percentuale di concentrazione del fattore negli animali sani, che rappresenta il 100 %. Affinché l aptt o il PT risultino prolungati, i fattori devono risultare inferiori al 30 % della concentrazione normale. Il vwf è una glicoproteina multimerica prodotta nelle cellule endoteliali e nei megacariociti, che circola nel sangue sotto forma di complesso insieme al fattore VIII. Per porre la diagnosi si può ricorrere alla determinazione dell antigene vwf. Se la concentrazione di vwf del paziente > 70 %, il risultato del test viene considerato normale. Una quantità pari al % si situa nella zona grigia. Se la quantità è inferiore al 50 %, si parla di vwf ridotto ed una quantità inferiore al 30 % indica una tendenza emorragica. In alcune razze si conosce la localizzazione del difetto genetico e tramite PCR si può rilevare se gli animali sono portatori della malattia. Quest aspetto è di grande rilevanza anche per gli allevatori. Tempo di tromboplastina parziale attivato (aptt) Il tempo di tromboplastina parziale attivato (aptt) controlla il sistema estrinseco e la via finale comune. Valori elevati sono frequenti p.es. in caso di emofilia (carenza del fattore VIII e del fattore IX), di avvelenamento
6 Diagnostic Update Tabella 3: interpretazione dei test di screening (N = normale) tempo di sanguinamento numero di PT aptt fibrinogeno tempo di della mucosa buccale trombociti trombina(tt) trombocitopenia N N N N trombocitopatia N N N N N carenza vwf N N / difetto del sistema intrinseco N N N N N (p.es emofilia A/B) difetto del sistema estrinseco N N N N N (p.es. carenza del fattore VII) carenza di vitamina K N N / ( ) N N (p.es.intossicazione da cumarina) epatopatie N / () N / ( ) N / N / N / DIC N / IDEXX Laboratorio di riferimento Via Guglielmo Silva, Milano Numero verde opz. 1 Numero verde fax italia@idexx.com IT
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