Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito

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1 Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito Ricerca di Helicobacter pylori su biopsie gastriche Emesso da Standards Unit, Microbiology Services, PHE Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data di emissione: Pagina: 1 di 23 Crown copyright 2015

2 Ringraziamenti Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità Pubblica del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito web Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i laboratori di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento. Si ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici. Per ulteriori informazioni contattare: Standards Unit Microbiology Services Public Health England 61 Colindale Avenue London NW9 5EQ standards@phe.gov.uk Website: Numero di accesso alle pubblicazioni PHE: Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la collaborazione di: loghi sono aggiornati al momento della pubblicazione Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data emissione: Pagina: 2 di 23

3 Contenuti RINGRAZIAMENTI... 2 TABELLA MODIFICHE... 4 SMI RU: SCOPO E OBIETTIVO... 6 SCOPO DEL DOCUMENTO... 8 INTRODUZIONE... 8 INFORMAZIONE TECNICA/LIMITAZIONI CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA PRELIEVO DEL CAMPIONE TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE PROCESSO/PROCEDURA SUL CAMPIONE PROCEDURA DI REFERTAZIONE NOTIFICA ALLA PHE O EQUIVALENTE APPENDICE: BIOPSIE GASTRICHE PER HELICOBACTE PULORI BIBLIOGRAFIA NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for Microbiology Investigations. L accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio Informazioni più dettagliate sull accreditamento possono essere consultate: Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: : Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data emissione: Pagina: 3 di 23

4 Tabella delle Modifiche Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il sistema locale di gestione della qualità. Modifica no/data. 9/ Emissione eliminata. no 5.2 Emissione inserita no. 6 Sezione(i) interessate Intero documento Pagina 2 Scopo Introduzione Informazione Tecnica/Limitazioni Trasporto e conservazione del campione Processo/procedura sul campione Procedura di refertazione Modifica. Collegamenti ipertestuali aggiornati a gov.uk. Aggiunti loghi aggiornati. Aggiunto collegamento a ID 26 Identificazione di specie Helicobacter. Aggiornato il significato del testo. Informazione sui metodi di prova riorganizzata in ordine di utilizzo. Le informazioni riguardanti il trattamento di prima istanza aggiornate per adattamento alla Linea Guida NICE 184. Incluse informazioni riguardanti l identificazione rapida. Aggiornate esigenze di crescita ottimali. Inclusione di informazioni riguardanti il test di sensibilità e contaminazione Rimozione del terreno di trasporto di Aimes Cambiati i ceppi NCTC. Incluso agar sangue (10% di sangue di cavallo). Biopsia ureasi sostituita con urea brodo di Christensen. Aggiornate informazioni per i test di sensibilità Tempi di consegna della refertazione della coltura modificati in: 'fino a 12 giorni (15 giorni per la microscopia. se è richiesta la prova di suscettibilità antimicrobica), ma sono di solito disponibili entro 10 giorni.' Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data emissione: Pagina: 4 di 23

5 Bibliografia Aggiornata parte della bibliografia Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data emissione: Pagina: 5 di 23

6 SMI del RU # : Scopo e Obiettivo Utilizzatori delle SMI Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai professionisti che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive. Le SMI forniscono ai clinici informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio riferibili alle ricerche per la diagnosi delle infezioni nei loro pazienti e le documentazioni forniscono indicazioni che facilitano la prenotazione elettronica di test appropriati. I documenti forniscono gli standard per le ricerche microbiologiche anche ai responsabili della sanità pubblica che devono considerarle come parte delle procedure da adottare per la salute sia clinica che pubblica per la propria popolazione Informazioni di base per le SMI Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti del processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche (prove di laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).gli algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la diagnosi differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note orientative descrivono metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad esempio la validazione della prova. La Standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di garantire in tutto il Regno Unito strategie d indagine equivalenti nei diversi laboratori ed è una condizione essenziale per interventi nel campo della sanità pubblica, ricerca e sviluppo delle attività. Collaborazione paritaria La preparazione e stesura delle SMI è effettuata mediante collaborazione paritaria fra PHE, NHS, Royal College of Pathologists e le organizzazioni professionali. L'elenco delle organizzazioni partecipanti può essere trovato su sito L'inclusione del logo di una organizzazione in una SMI implica il sostegno degli obiettivi e del processo di preparazione del documento. I rappresentanti delle organizzazioni professionali fanno parte del comitato direttivo e dei Gruppi di Lavoro che sviluppano le SMI. Le opinioni dei rappresentanti possono non essere rigorosamente conformi a quelle dei membri delle organizzazioni a cui appartengono né a quelle delle loro organizzazioni. I rappresentanti prescelti rappresentano uno strumento bidirezionale per la consultazione e dialogo. Le opinioni espresse sono ricercate con un processo di consultazione. Assicurazione di qualità Il NICE (National Institute for Health and Care Excellence) ha accreditato la procedura utilizzata dai Gruppi di Lavoro per produrre le SMI L accreditamento è applicabile a tutte le linee guida prodotte dall Ottobre del La procedura per lo sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO 9001:2008.Le SMI rappresentano una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si devono attenere # Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica riconosciute dal GMC (General Medical Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia) e la Virologia Medica. Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data emissione: Pagina: 6 di 23

7 per la propria attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità pubblica del Regno Unito. Le SMI sono accreditate dal NICE e non rappresentano gli standard minimi di attività, e neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio disponibili nel Regno Unito. Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti ell accreditamento con la promozione di procedure d elevata qualità che possono essere verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo. Queste stesse devono essere utilizzate in associazioni con altre SMI.Le prestazioni della SMI dipendono dal personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e delle attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo commerciale e quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e risultati idonei allo scopo. I laboratori devono partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative procedure del controllo di qualità interno. Coinvolgimento del paziente e della comunità Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il coinvolgimento dei pazienti e dell opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di operatori sanitari, ricercatori e organizzazioni di volontariato la SMI risultante sarà strutturalmente valida e atta a soddisfare le esigenze dell'utente. L opportunità di partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al pubblico con l accesso libero al nostro sito web Informazione della Gestione e dei Dati Sensibili La PHE è un organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza. Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza I Gruppi di Lavoro SMI sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace con gli appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti. Dichiarazione legale Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, PHE e ogni altra organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente, escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano modifiche a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali modifiche. Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel corso della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell ente accreditato NICE. I diritti d autore delle SMI sono della Crown e questi dovrebbero essere riconosciuti quando appropriato. Citazione suggerita per questo documento Public Health England. (2015). Investigation of gastric biopsies for Helicobacter pylori. UK Standards for Microbiology Investigations. B 55 Emissione 6. Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data emissione: Pagina: 7 di 23

8 Scopo del Documento Tipo di campione Biopsia gastrica Questa SMI descrive le procedure e la ricerca batteriologica nelle biopsie gastriche per Helicobacter pylori. Questa SMI dovrebbe essere usato con altre SMI inclusa la ID 26 Identification of Helicobacter species. Introduzione Nel 1984 Warren e Marshall per primi proposero l'associazione di H. pylori con l ulcera peptica, e da allora questa si è affermata come la specie di Helicobacter clinicamente più importante 1. Questo battere è riconosciuto come la principale agente eziologico per la malattia da ulcera peptica e il principale fattore di rischio del carcinoma gastrico 2. L infezione da H. pylori è anche un fattore di rischio indipendente per lo sviluppo di gastrite atrofica, ulcera gastrica, adenocarcinomi gastrici, e linfoma associato a tessuto linfoide della mucosa gastrica (MALT- mucosa-associated lymphoid tissue) 2. La specie determina un infezione cronica nella maggior parte delle persone infette, rappresentata da gastrite cronica. L ispessimento dovuto all infiammazione delle mucose è spesso evidente nell antro (gastrite antrale ispessita), che predispone a iperacidità e ulcera duodenale. Molti pazienti infettati da H. pylori presentano sintomi addominali ricorrenti (dispepsia non ulcerosa) senza malattia ulcerosa, e sembra che in questi pazienti si ottenga un beneficio clinico con l eradicazione di H. pylori 3. Possono manifestarsi sintomi di gastrite acuta e dolore epigastrico, nausea e vomito che di solito regrediscono, ma può persistere a lungo ipercloridria. Il riconoscimento e la diagnosi delle infezioni da H. pylori sono stati di grande interesse. Inizialmente per la diagnosi sono state utilizzate tecniche invasive (quali le biopsie tissutali). Tuttavia, con i progressi in campo diagnostico, (in particolare della biologia molecolare) sono ora abitualmente utilizzate tecniche non invasive, soprattutto nel laboratorio clinico per la diagnosi iniziale di infezione. Il National Institute of Clinical Excellence (NICE) e le linee guida sulla dispepsia della PHE affermano che, per i casi di dispepsia e sospetto di ulcera gastrica e duodenale che non siano stati precedentemente studiati, la strategia dovrebbe ricorrere a un accertamento e trattamento' 3-6. Gli accertamenti consigliati comprendono il test respiratorio dell'urea UBT (urea breath test test dell aria espirata) e SAT (stool antigen test test antigene fecale) 3-6. La sierologia è meno accurata del UBT o del SAT, i risultati sono variabili e questi test non dovrebbero essere usati negli anziani, nei bambini o dopo trattamento 5,6. Non sono raccomandati test sierologici eseguiti in point of care 5. In seguito ad un risultato positivo viene somministrata terapia di eradicazione per H. pylori, che consiste nella somministrazione per sette giorni di un inibitore della pompa protonica (PPI proton pump inhibitor) con amoxicillina e claritromicina o metronidazolo. E necessaria una prima linea di trattamento alternativa se il paziente è allergico alla penicillina; informazioni dettagliate riguardanti le opzioni di trattamento di prima e seconda linea possono essere trovate nella linea guida clinica 184 del NICE: Dispepsia e malattia da reflusso gastroesofageo 4. Dopo il primo fallimento del trattamento, se si esegue un'endoscopia, dovrebbero essere considerati l esame colturale e le prove di sensibilità per H. pylori su biopsie gastriche. A seguito di un secondo fallimento del trattamento, l esame colturale e i test di sensibilità devono essere effettuati in tutti i casi 7. La Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data emissione: Pagina: 8 di 23

9 relazione di consensus di Maastricht IV raccomanda anche che la cultura e i test di sensibilità siano eseguiti nelle in aree in cui la resistenza alla claritromicina è superiore al 20% 7,8. Nel Regno Unito H. pylori è frequentemente resistente al metronidazolo (da 20% a 80%). La resistenza alla claritromicina di solito è meno frequente nella popolazione generale (4% al 11%). La resistenza a Levofloxacin è rara (~ 15%), ma si verifica a causa dell ampio utilizzo di fluorochinoloni. H. pylori sono raramente resistenti a amoxicillina, rifampicina e tetraciclina (~ 3%). H. pylori può essere trattato con rifabutina, farmaco simile a rifampicina, ma con diverse sensibilità (la resistenza è estremamente rara <1%) 9. Tecniche non-invasive Le tecniche non invasive evitano di ricorrere alla costosa e invasiva endoscopia 10. Per l'indagine sui casi di dispepsia e sospetto di ulcera gastrica e duodenale che non sono stati precedentemente studiati si raccomandano i seguenti accertamenti i 3,5,6 : test dell aria espirata (UBT) test dell'antigene fecale (SAT) L'urea breath test e il test dell'antigene fecale hanno dimostrato accuratezza diagnostica equivalente; i test sierologici sono meno accurati e possono essere utilizzati solo in alcuni situazioni 7. Test dell aria espirata (UBT) I test UBT sono considerati standard di riferimento diagnostico 11. L Urea Breath Test utilizza o un isotopo radioattivo di carbonio ( 14 C) o un isotopo naturale non radioattivo ( 13 C), che sono ingeriti dal paziente. La CO 2 marcata è assorbita dal sangue ed esalata nell'aria espirata. Sono stati ampiamente rivedute la metodologia dei test e i fattori che influenzano il risultato, la standardizzazione e l'applicazione in diversi ambiti clinici 12. L'uso dell UBT comporta elevata accuratezza diagnostica (> 95%) e, se disponibile, è fortemente raccomandato per la diagnosi di H. pylori 13. Test all'antigene fecale (SAT) (HPStAg - H. pylori Stool Antigen) I test dell'antigene fecale con un ELISA forniscono un altro valido ausilio nella diagnosi di infezione attiva da H. pylori 14. Il test è di facile esecuzione e ha il vantaggio di non essere invasivo. Sono disponibili due tipi di test dell'antigene fecale; un metodo di laboratorio che si avvale del saggio immunoenzimatico (ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay) e un kit rapido (immunocromatografico) in point of care. Negli ultimi anni sono stati sviluppati saggi SAT ELISA che utilizzano anticorpi monoclonali invece che policlonali. Questi hanno elevata accuratezza sia per la diagnosi primaria che per la diagnosi post trattamento 7,15-17.I kit sierologici di tipo point of care (tipo test di gravidanza) sono meno affidabili 7,18. Gli Evidence-based studies suggeriscono che nella diagnosi di infezione da H. pylori l ELISA HPStAg è il mezzo diagnostico con miglior rapporto costo beneficio 19,20. Sierologia H. pylori è considerata un infezione cronica e pertanto sono considerate solo IgG nell esecuzione delle prove sierologiche per la diagnosi 7. Il metodo preferito è l ELISA standard. I saggi commerciali presentano precisione variabile e in teoria il test sierologico IgG validato può essere utilizzato solo nelle seguenti situazioni 7,8 : dopo uso recente di farmaci antimicrobici e antisecretori Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data emissione: Pagina: 9 di 23

10 dove è presente ulcera sanguinante, atrofia gastrica o neoplasie La sierologia basata su test di laboratorio dovrebbe essere utilizzata solo quando un particolare test sierologico è stato sufficientemente validato a livello locale e ha dimostrato di essere idoneo all'uso. Tecniche invasive (biopsie) La biopsia gastrica è il campione di scelta per la cultura di H. pylori. I tentativi di coltura di altri tipi di campioni hanno un ridotta percentuale di successo 21. Il prelievo di una biopsia è una procedura invasiva e non è un metodo con rapporto costo beneficio favorevole se impiegato come mezzo di diagnostico delle infezioni da H. pylori. Le tecniche invasive per l'esame delle biopsie gastriche prelevate con endoscopia includono 12,22,23 : coltura biopsia (test all'ureasi) microscopia istologia Né cultura né istologia forniscono una diagnosi rapida. Coltura La Coltura del microrganismo è il metodo più specifico e offre opportunità di eseguire il test convenzionale di sensibilità antimicrobica. Questo è importante per predire e valutare l'efficacia del trattamento, e per individuare re-infezioni. Con l'adozione della strategia del 'testare e trattare', come raccomandato dal NICE, la motivazione principale per ottenere una biopsia per la cultura è quella di stabilire la sensibilità dell'isolato. Biopsia (test all'ureasi) Il test dell'ureasi, noto anche come test rapido dell ureasi (RUT- rapid urease test) o il test per microrganismo simile a Campylobacter- (test CLO Campylobacter-like organism ), è rapido, sensibile, ed economico 8,22. I risultati positivi sono spesso disponibili in pochi minuti, ma il referto negativo può richiedere molto più tempo, in funzione delle istruzioni del fabbricante. E 'raccomandato per uso associato alla coltura o all accertamento istologico, secondo le disponibilità locali. Questo test è spesso eseguito nel settore di endoscopia. Sono disponibili kit commerciali estremamente precisi, ma anche costosi. Microscopia I microrganismi possono essere colorati con Giemsa o Gram in base alle preferenze. Se si esaminano due biopsie è stata segnalata sensibilità fino al 90%, ma questo metodo richiede esperienza tecnica 21. Istologia L esame istologico è sensibile come la coltura quando si ricerca H. pylori, e ha un elevato grado di specificità 12. E 'anche utile per rilevare culture resistenti delle specie Helicobacter quali Helicobacter heilmannii e specie simili, che possono essere causa insolita di gastrite e ulcera. Attualmente è più utilizzata la colorazione Giemsa, si può anche usare l immunocolorazione che aumenta la sensibilità e la specificità 8. Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data emissione: Pagina: 10 di 23

11 Identificazione rapida Tecniche di amplificazione dell'acido nucleico (NAAT) Le NAAT sono state utilizzate per il rilevamento di H. pylori in vari tipi di campioni tra cui biopsie gastriche, mucosa gastrica e campioni di feci 8,22. La PCR e la real-time PCR sono sempre più frequentemente utilizzate, ma il ruolo della PCR nella diagnosi di routine deve essere ancora definito 8,22. I saggi NAAT possono fornire un valore aggiunto nelle indagini gastriche di campioni bioptici con esame colturale negativo, in particolare in quelli provenienti da casi per i quali gli altri accertamenti clinici indicano un infezione da H. pylori 24.. Uno studio sistematico dei primer per il rilevamento di H. pylori ha evidenziato che ciascuno dei quattro saggi più performanti ha raggiunto un limite di rilevamento di <100 CFU/ml dal tessuto gastrico 25. Tuttavia, nessun di loro ha specificità o sensibilità del 100%, e tutti hanno prodotto falsi positivi 25,26. Spettrometria di massa MALDI-TOF Questa tecnologia è promettente per l'identificazione di batteri relativamente poco reattivi quali le specie Helicobacter. Sebbene sia probabilmente più utile per le specie di Helicobacter non pylori (fare riferimento a ID 26 - Identification of Helicobacter species) 27. Informazione Tecnica/Limitazioni Limitazioni delle SMi del RU Le raccomandazioni formulate nelle SMI del RU sono basate su prove (ad esempio sensibilità e specificità), se disponibili, opinioni degli esperti e pragmatismo, tenendo in considerazione anche le risorse disponibili. I laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali, se appropriato. Prima del loro uso, i laboratori devono assicurare che tutti i saggi commerciali e in-house siano stati validati e siano idonei allo scopo Contenitori per campioni 28,29 Le SMI usano Il termine '' contenitore a chiusura ermetica con marchiatura CE per descrivere quelli contrassegnati con la marchiatura CE per la raccolta e il trasporto dei campioni clinici. I requisiti per i contenitori dei campioni sono riportati nella Direttiva UE per i Dispositivi Sanitari Diagnostici in vitro (98/79/CE allegato 1 B 2.1) in cui si stabilisce:'' La progettazione deve consentire un'agevole manipolazione e, se necessario, ridurre per quanto possibile la contaminazione dei, e perdite dal dispositivo durante l'uso e, nel caso di recipienti per campioni, il rischio di contaminazione degli stessi. Le procedure di fabbricazione devono essere adatte a questi scopi''. Condizioni ottimali di crescita Terreni Non è disponibile il consenso su quale sia il terreno che ottiene il miglior isolamento per H. pylori, sebbene siano preferiti i terreni contenenti sangue. Sono stati segnalati alcuni di loro 23, I terreni privi di sangue, contenenti integratori alternativi, potrebbero non essere idonei per l'isolamento primario. Questo SMI consiglia l'uso di Agar Sangue Columbia (CBA - Columbia Blood Agar) con 10% di sangue di cavallo e agar selettivo di Dent (sono disponibili altri terreni selettivi) 33. Per inibire la sovracrescita di batteri contaminanti e funghi possono essere aggiunti antimicrobici ai Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data emissione: Pagina: 11 di 23

12 terreni 33. H. pylori è sensibile a clindamicina, cefalosporine e sodio desossicolato, nessuno di questi composti deve essere utilizzato nei terreni selettivi. Atmosfera Il requisito ottimale di crescita per l'isolamento di H. pylori è rappresentato da un atmosfera umida micro-aerobica (5-7% O 2 e 5-10% di CO 2 ) a C 23. Si deve notare che l isolamento di H. pylori è significativamente migliorato dalla presenza di idrogeno (3-5%), che è assente nei kits più diffusi sul mercato che generano atmosfera micro-aerobica 21,34. Sono disponibili confezioni che generano atmosfera micro-aerobica contenente idrogeno, in alternativa possono essere utilizzati altri metodi che introducono l'idrogeno nel sistema (ad esempio con disponibilità predefinita di gas) 21. Tutti i metodi devono essere validati prima dell'uso. Incubazione Le colture dovrebbero essere incubate per un minimo di 10 giorni, anche se le colonie possono essere visibili dopo 3-5 giorni 23. Non è buona pratica esporre le piastre all'aria troppo frequentemente, e una volta esaminate, devono essere reinserite il più rapidamente possibile nell incubatore o nella giara contente gas. Test di sensibilità La BSAC (British Society for Antimicrobial Chemotherapy) ha stabilito che il metodo di disco diffusione non è adatto per H. pylori, in quanto il microrganismo è a lenta crescita e i risultati potrebbero quindi essere inaccurati 35. Il metodo consigliato per la prova di sensibilità è una striscia con antibiotico distribuito con gradiente che valuti la concentrazione minima inibente (MIC )36. La gamma disponibile delle strisce con antibiotici varia e dipende dal produttore. I breakpoint per Helicobacter pylori si avvalgono di valori "cut-off" epidemiologici (ECOFFs), che contraddistinguono gli isolati "wild-type" (ceppo selvatico) da quelli con sensibilità ridotta, a queste informazioni si può accedere tramite il sito web della BSAC 35. Breakpoint alternativi sono stati raccomandati dal gruppo di studio europeo per l Helicobacter e sono inclusi nelle linee guida consensus di Maastricht IV 7,9. In alternativa, gli isolati possono essere inviati all appropriato laboratorio specializzato o di riferimento Contaminazione La contaminazione con muffe può essere ridotta con l'incorporazione nel terreno di un agente antifungino quale la cicloesimide (100mg / L) e con l accurata pulizia delle attrezzature prima e dopo il loro utilizzo. Si raccomanda la sterilizzazione in autoclave delle giare precedentemente contaminate da muffe (se condivisa con le istruzioni del produttore). In caso contrario, si raccomanda la decontaminazione completa,seguita da pulizia e accurato risciacquo. Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data emissione: Pagina: 12 di 23

13 1 Considerazioni sulla sicurezza 28,29,37-51 Ricerca di Helicobacter pylori in biopsie gastriche 1.1 Prelievo, trasporto e conservazione del campione 28,,29,37-40 Usare tecnica asettica Raccogliere i campioni in appropriati contenitori impermeabili con marchiatura CE e inserirli in sacchetti di plastica sigillati. E essenziale la conformità alle normative postali e dei trasporti. 1.2 Procedura sul Campione 28,29,37-51 Livello di Contenimento 2, Le procedure di laboratorio che possono generare aerosol devono essere condotte in cabina microbiologica di sicurezza 43. Fare riferimento alle attuali linee guida per la manipolazione dei microrganismi descritti in questa SMI Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con la valutazione del rischio. Prelievo del Campione 2.1 Tipo di campione Biopsia gastrica 2.2 Tempo ottimale e metodo di prelievo 52 Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.1 Prelevare i campioni prima della terapia antibiotica, quando possibile 52. In teoria le biopsie dovrebbero essere prelevate prima dell'inizio della somministrazione della terapia antimicrobica, ma la procedura consigliata dal NICE per la diagnosi di H.pylori è testare e curare' pertanto la maggior parte dei campioni inviati per la coltura sarà richiesta a causa del fallimento terapeutico 3-5,20. Dovrebbero trascorrere almeno due settimane dall'ultima dose di terapia antimicrobica prima del prelievo del campione 7. Le biopsie gastriche sono in genere prelevate dall antro gastrico in endoscopia, e talvolta dal corpo principale dello stomaco, in funzione della sede dell infiammazione. Nei casi di ulcera duodenale saranno prelevate biopsie da questa sede. 2.3 Quantità adeguata e numero appopriato di campioni 52 Numero e frequenza della raccolta del campione dipendono dalle condizioni cliniche del paziente a discrezione dell endoscopista in quanto dipende dal singolo paziente 3 Trasporto e conservazione dei campioni 28, Condizioni ottimali di trasporto e conservazione Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sessione1.1 l campioni dovrebbero deve essere trasportati e processati il più presto possibile preferibilmente entro 6 ore 3,52. Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data emissione: Pagina: 13 di 23

14 Durante il trasporto è importante conservare l atmosfera umida. Se la procedura è ritardata, la refrigerazione è preferita alla conservazione a temperatura ambiente 37. Quando i tempi di consegna sono inferiori a sei ore 23. La biopsia deve essere posta in un piccolo contenitore, con marchiatura CE, impermeabile, quale una piccola provetta contenente una scarsa quantità (approssimativamente 100µl) di soluzione fisiologica sterile per prevenire l essicazione. In alternativa, può essere utilizzato il terreno di trasporto di Dent 33. Nota: La sensibilità della microscopia può essere ridotta se la biopsia è immersa in fisiologica, si formano infatti globuli di muco e diviene difficile la preparazione di uno striscio soddisfacente. Quando l'esame colturale è eseguito dopo 6 ore 23,55 La biopsia dovrebbe essere ricoperta con circa 1 ml di infuso di brodo di cuore e cervello in un piccolo contenitore sterile, quale una piccola provetta, e conservata a 4 C fino a 48 ore. In alternativa può essere utilizzato il terreno di trasporto di Dent. Le biopsie possono essere conservate per più di 6 mesi a 70 C in brodo contenente glicerolo al 20-25%, sebbene la vitalità dei microrganismi risulti poi significativamente ridotta. 4: Processo/Procedura sul Campione 28, Selezione della prova La prova dell'ureasi sulla biopsia è spesso eseguita nella sezione di endoscopia e pertanto al laboratorio si possono richiedere solo l'esame colturale e microscopico. L'ordine con il quale qualcuna/tutte queste prove sono eseguite dovrà essere in accordo con il protocollo locale. 4.2 Aspetto N/D 4.3 Preparazione del campione Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sessione1.2. Biopsia sottilmente tagliata con un bisturi sterile. Può essere eseguita l omogeneizzazione, ma può essere controproducente in quanto richiede più tempo e richiedere l'uso di un macina sterile per tessuto (macina di Griffiths o alternativa infrangibile). 4.4 Microscopia Fare riferimento a TP 39 Staining procedures. La microscopia è eseguita usando la colorazione carbol fucsina o colorante di Sandiford Standard Raccogliere la biopsia (o frammento di biopsia tagliato sottile) con un tampone sterile e strisciare energicamente su un vetrino da microscopio pulito (è richiesto un vetrino sterile se l'esame microscopico è eseguito prima dell'esame colturale) Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data emissione: Pagina: 14 di 23

15 La colorazione e l esame del preparato colorato sono richieste solo se il risultato dell'esame colturale è negativo e la prova dell'ureasi sulla biopsia è positiva. Sono idonee la colorazione di Gram o di Giemsa. 4.5 Coltura e ricerca Pre-trattamento N/D Procedura sul campione Coltura Lo stesso tampone contenente la biopsia che viene utilizzato per l esame microscopico (se eseguito) dovrebbe essere usato per inoculare ciascuna piastra di agar (consultare Q 5 Inoculation of culture media for Bacteriology) Per l'isolamento di colonie isolate, diffondere l'inoculo utilizzando con ansa sterile. Nota: Si raccomanda di eseguire contemporaneamente la sottocultura di un ceppo di H. pylori di controllo noto, in modo particolare se deve essere eseguita la prova di sensibilità Devono essere usati i seguenti ceppi di controllo 9. Ceppo wild type NTC Ceppi sensibili a metronidazolo e claritromicina NCTC Ceppi resistenti a metronidazolo e claritromicina NCTC Prova dell'ureasi sulla biopsia Spremere nel brodo urea la biopsia posta sull'estremità del tampone dopo aver eseguito la coltura (e l esame microscopico, se effettuato). Il tampone dovrebbe essere rotto nel brodo e lasciato in situ durante la prova. Incubare il brodo contenente ureasi a temperatura ambiente fino a 24 ore. I risultati positivi sono spesso disponibili in pochi minuti, ma il referto negativo richiede più tempo (fino a 24 ore), in accordo con le istruzioni del produttore. Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data emissione: Pagina: 15 di 23

16 4.5.3 Terreni di coltura, condizione e microrganismi Aspetti clinici/ condizioni Campioni Terreni standard Incubazione Temp C Atmos Tem po Lettura colture Microrganismo(i) ricercati Gastrite Biopsia gastica Biopsia gastica Agar selettivo di Dent o in alternativa agar selettivo per H. pylori Microaerobica Camera umida, in teoria contenente idrogeno 10 g Ogni 48 ore H. pylori Agar sangue 10% sangue cavallo Microaerobica Camera umida, in teoria contenente idrogeno 10 g Ogni 48 ore Per queste situazioni aggiungere: Aspetti clinici/ condizioni Campione Terreni supplementari Incubazione Temp C Atmos Tem Lettura colture Microrganismo(i) ricercati Gastrite - Biopsia test urease se non già eseguito in sede di endoscopia Biopsia gastrica Brodo urea di Christenson Ambiente aria 24 ore Ogni ora fino a 6 ore e ancora a 24 ore H. pylori *In assenza di terreni per H. pylori può essere usato agar selettivo GC. 4.6 Identificazione Per l identificazione fare riferimento alle singole SMI Livello minimo di identificazione in laboratorio H. pylori Livello specie 4.7 Prova di sensibilità agli antimicrobici Non sono stati definiti criteri di valutazione della sensibilità per il test in disco diffusione per H. pylori, pertanto dovrebbe essere utilizzato un metodo MIC 35. Se si usa un metodo MIC commerciale, devono essere seguite le istruzioni del produttore. Fare riferimento alle linee guida.della British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) e/o EUCAST. In alternativa, gli isolati possono essere inviati a un appropriato laboratorio specializzato o di riferimento. Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data emissione: Pagina: 16 di 23

17 4.8 Invio per ricerche su focolaio epidemico N/D 4.9 Invio ai laboratori di riferimento Per informazioni sulle prove disponibili, tempi di risposta, procedure per il trasporto e altre richieste del laboratorio di riferimento, click here for user manuals and request forms. Microrganismi con resistenze insolite o inattese, o qualora sussista un problema clinico o di laboratorio, o anomalie che richiedano approfondimenti devono essere inviati agli appropriati laboratori di riferimento. Contattare l appropriato laboratorio nazionale di riferimento per informazioni sulle prove disponibili, tempi di consegna, procedure di trasporto ed eventuali altri richieste per invio del campione: Inghilterra e Galles Scozia Irlanda del Nord 5 Procedura di Refertazione 5.1 Microscopia Colorazione di Gram (se eseguita) Refertare presenza o assenza di microrganismi simili a H. pylori Tempo per referto microscopico Tutti i risultati dovrebbero essere rilasciati al medico richiedente non appena disponibili, tranne che siano intercorse coi richiedenti disposizioni alternative specifiche. I risultati urgenti devono essere comunicati per telefono o trasmessi elettronicamente in conformità con le procedure locali. 5.2 Coltura Come appropriato, quanto di seguito: Coltura Referto positivo: Isolato H. pylori. Referto negativo Non isolato H. pylori. Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data emissione: Pagina: 17 di 23

18 Biopsia (prova dell ureasi) se eseguita Refertare la prova dell ureasi sulla biopsia come positiva o negativa Tempo di refertazione della coltura Risultati intermedi o preliminari dovrebbero essere rilasciati sulla rilevazione degli isolati che possono essere potenzialmente clinicamente significativi non appena si rileva una crescita, tranne che con i richiedenti siano intercorse disposizioni alternative specifiche. I risultati urgenti devono essere comunicati per telefono o trasmessi elettronicamente in conformità con le procedure locali. I referti finali scritti o le relazioni generate dal computer dovrebbero seguire ai rapporti preliminari e verbali nel più breve tempo possibile. I risultati delle colture possono richiedere fino a 12 giorni (15 giorni se è necessario test di sensibilità antimicrobica), ma di solito sono disponibili entro 10 giorni. 5.3 Prova di sensibilità agli antibiotici Segnalare la sensibilità come clinicamente suggerito. Si raccomanda l'uso prudente degli antimicrobici secondo protocolli locali e nazionali 6 Notifica al PHE 56,57 o Equivalente Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s identificano gli agenti causali elencati nella Scheda 2 della Direttiva. Le denunce devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica, entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro sette giorni. Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l ufficio locale della PHE. Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d infezione imputabili ad agenti causali soggetti a tale disposizione. La denuncia secondo la Direttiva dell Health Protection (Notification) Regulations 2010 non sostituisce l informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala spontaneamente al PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici e molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di alcuni tipi d infezione. Queste iniziative devono continuare. Nota: La linea guida dell Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione per Human Immunodeficiency Virus HIV & Sexually Transmitted Infections STIs, Healthcare Associated Infections e HCAIs e Creutzfeldt Jakob disease CJD da includere nel Notification Duties of Registered Medical Practitioners, e non al Notification Duties of Diagnostic Laboratories. Esistono accordi diversi in Scotland 58,59, Wales 60 and Northern Ireland 61. Traduzione a cura di Roberto Rescaldani, già primario del Laboratorio di Microbiologia e Virologia A.O. San Gerardo dei Tintori Monza. Collaboratori: Roberto Rossetti, già Primario del Laboratorio di Microbiologia, Ospedale Civile di Pistoia ASL 3 Monica Raggi, Dirigente di primo livello del Laboratorio di Microbiologia e Virologia A.O. San Gerardo dei Tintori di Monza I testi originali e le traduzioni sono disponibili sul Web APSI Webmaster Sergio Malandrin, Dirigente di primo livello del Laboratorio di Microbiologia e Virologia A.O. San Gerardo dei Tintori di Monza Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data emissione: Pagina: 18 di 23

19 Appedice: Biopsie Gastriche per Helicobacter pylori Batteriologia B 55 Emissione no: 6 Data emissione: Pagina: 19 di 23

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