UNIVERSITA DEGLI STUDI di NAPOLI FEDERICO II

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1 UNIVERSITA DEGLI STUDI di NAPOLI FEDERICO II Laurea Magistrale in Biotecnologie del Farmaco Corso di Chimica Farmaceutica Biotecnologica Prof.ssa Elena Luraschi a.a

2 Biotecnolo gie Molecolari: Fattori di crescita emopoietici

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4 L emopoiesi si può definire come una complessa serie di eventi, che partecipa alla formazione, proliferazione (riproduzione di cellule simili), differenziazione (specializzazione o acquisizione di funzioni differenti da quelle della forma più primitiva della cellula o cellula staminale) ed attivazione/maturazione (mutamenti dovuti allo sviluppo che si concludono nella cellula funzionalmente attiva ) di GR, GB e PLT. Inoltre, anche la mobilizzazione delle cellule progenitrici, affinchè migrino dal midollo osseo al sangue periferico, è una funzione controllata dai fattori di crescita emopoietici. Le cellule ematiche sono di importanza fondamentale per l organismo: trasportano ossigeno, assicurano l immunità e coagulano il sangue. Il breve ciclo vitale di queste cellule mature ne impone un continuo avvicendamento e il processo emopoietico, per rispondere al fabbisogno basale, sostituisce le cellule quotidianamente nel corso delle attività fisiologiche. Lo stesso processo deve rispondere anche a situazioni di aumentata richiesta e riesce a produrre milioni di cellule per combattere un infezione, o per rimediare alle perdite causate da un emorragia.

5 Diversi fattori di crescita emopoietici sono stati identificati e caratterizzati e, con l avvento della tecnologia del DNA ricombinante, ne sono stati clonati i geni, ed è stato possibile produrli in quantità sufficienti per i procedimenti di sviluppo. A partire degli anni 80, sono stati isolati più di venti fattori di crescita emopoietici e il numero continua ad aumentare. Si possono individuare otto linee principali, o tipi di cellule ematiche, tutte derivanti da una piccola popolazione di cellule staminali nel midollo osseo. Il percorso mieloide dà origine a eritrociti, piastrine, macrofagi, monociti e granulociti (neutrofili, eosinofili e basofili); invece, il percorso linfoide dà origine ai linfociti (B e T) e NK. La denominazione di ciascun fattore di crescita emopoietico deriva dalla sua cellula bersaglio prevalente. Di seguito, sono riportati i fattori di crescita prodotti mediante la tecnologia del DNA ricombinante e reperibili in commercio, sia in Europa che negli Stati Uniti. L elenco comprende anche altri fattori di crescita non ancora in commercio, ma che sono stati già sperimentati dall uomo:

6 Fattore di stimolazione delle colonie di granulociti (G-CSF e rg-csf); Fattore di stimolazione delle colonie di granulociti e macrofagi (GM-CSF e rgm-csf); Eritropoietina o fattore di stimolazione degli eritrociti (EPO e repo); Fattore di stimolazione delle colonie di macrofagi (M-CSF); Interleuchina-3 (IL-3); Proteina di fusione IL-3/fattore di stimolazione delle colonie di granulociti e macrofagi (PIXY-321); Trombopoietina (TPO); Fattore di cellule staminali (SCF).

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8 Una serie di caratteristiche accomuna la maggior parte dei fattori di crescita emopoietici. Sono, per lo più, glicoproteine a catena singola, di PM compreso tra 14 e 34 kd. I ponti S-S tra i residui di cisteina determinano la configurazione tridimensionale, necessaria ai fini dell attività biologica. Elementi distintivi all interno della famiglia sono la sequenza amminoacidica e la glicosilazione. La porzione zuccherina varia a seconda del fattore di crescita e del metodo di produzione, ed influisce sul PM, ma non sull attività biologica. Ogni fattore di crescita emopoietico è codificato da un singolo gene, ottenibile da fonti, o linee cellulari diverse, ed esprimibile in vari sistemi biologici.

9 Fattori di stimolazione delle colonie di granulociti (G-CSF) e di granulociti e macrofagi (GM-CSF) I fattori di crescita mieloidi sono prodotti nell organismo da diversi tipi di cellule, tra i quali i macrofagi, i linfociti T, i fibroblasti e le cellule endoteliali. Essi stimolano la proliferazione e la differenziazione di una o più linee cellulari mieloidi e potenziano anche la funzione dei granulociti e dei monociti maturi. I fattori di crescita multilinea, quali GM-CSF, l IL-3 o il SCF, influiscono su più linee cellulari mieloidi e tendono ad agire sulle cellule progenitrici prima della loro differenziazione. Il GM-CSF agisce sinergicamente con altri fattori di crescita nelle prime tappe di differenziazione delle cellule staminali, le quali producono unità formanti aggregati ed unità formanti colonie (CFU, Colony Forming Units); inoltre, stimola le CFU ad aumentare la produzione di diversi tipi di cellule (granulociti, eritrociti, macrofagi, megacariociti). Il GM-CSF potenzia anche la migrazione, la fagocitosi, la produzione di anione superossido e la tossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente di neutrofili, monociti ed eosinofili (Tabella 2).

10 Tabella 2 Effetti in vitro dei fattori di crescita emopoietici sulle cellule emopoietiche mature MULTILINEA LINEA SPECIFICA TIPO di CELLULA GM CSF IL 3 G CSF M CSF EPO Neutrofili Monoci/ Basofili + Eosinofili + + Eritroci/ + + Piastrine +

11 I fattori di crescita specifici per linea, quali il G-CSF, l EPO o l M-CSF, influiscono principalmente su un solo tipo di cellula, in uno stadio più avanzato della differenziazione. L attività del G-CSF è focalizzata alla stimolazione della proliferazione, differenziazione e funzione delle linee granulocitarie, benché possa svolgere un ruolo sinergico con il GM-CSF e con l IL-3 nello stimolare altre linee cellulari. Esso potenzia, inoltre, le attività fagocitarie e citotossiche dei neutrofili, mentre ha uno scarso effetto sui monociti, macrofagi ed eosinofili ( a differenza del GM-CSF) (vedi tabella 2). Un altro effetto del G-CSF, legato all azione inibitoria che esercita sull IL-1, il TNF e l IFN-γ, è la riduzione dell infiammazione. Il legame dei fattori di crescita mieloidi ai recettori specifici sulla superficie delle cellule mature, ne regola l attività funzionale, con un meccanismo che può essere sia diretto che indiretto. Un esempio di tale duplice meccanismo è illustrato nella Figura 6.

12 Il legame di GM-CSF al recettore su un macrofago stimola quest ultimo sia a proliferare e a differenziarsi (meccanismo diretto), sia a produrre e secernere un certo numero di citochine (meccanismo indiretto), tra le quali G-CSF, IL-1 e TNF, che si allontanano, successivamente, dal macrofago e si fissano sulle cellule in possesso di recettori specifici, quali i neutrofili, i linfociti T, e i fibroblasti. Indirettamente, pertanto, i fattori di crescita mieloidi possono dare inizio alla cascata delle citochine

13 Per quanto riguarda il ruolo fisiologico, i due fattori di crescita mieloide, G-CSF e GM-CSF, svolgono ruoli complementari: G-CSF mantiene la produzione dei neutrofili in condizione di stato stazionario e provvede ad aumentarla nel corso di situazioni acute (ad es.: infezioni); GM-CSF rimane nel sito dell infezione per attivare e trattenere i neutrofili; esso aumenta, inoltre, il numero degli eosinofili e dei monociti circolanti, e la tossicità di questi ultimi.

14 Struttura Sono disponibili due prodotti ricombinanti a base di G-CSF: Filgrastim e Lenograstim, e due a base di GM-CSF: Molgramostim e Sargramostim, quest ultimo solo negli Stati Uniti. L ultima sillaba del nome proprio dei prodotti ricombinanti deriva dalla loro attitudine a stimolare le cellule emopoietiche. I due prodotti G-CSF ricombinanti, Filgrastim e Lenograstim, stimolano i granulociti; mentre i due prodotti GM-CSF ricombinanti, Molgramostim e Sargramostim, stimolano sia i granulociti che i monociti. Dal punto di vista strutturale, questi biofarmaci assomigliano molto alle proteine endogene, salvo per leggere modificazioni della sequenza amminoacidica, per l entità della glicosilazione, o per entrambe le cose, a seconda del metodo di produzione. Il G-CSF endogeno esiste in due forme: tipo A (meno attivo), costituito da 177 amminoacidi; tipo B (molto più attivo), costituito da 174 amminoacidi. La proteina è O-glicosilata ed ha PM di 20kD.

15 Struttura secondaria di G-CSF umano, ricavata da dati di diffrazione ai raggi X (classificazione strutturale: superfamiglia di citochine con 4 α-eliche antiparallele a lunga catena.

16 La versione ricombinante, Filgrastim, è una proteina a singola catena di 175 amminoacidi. Rispetto alla proteina umana endogena, il Filgrastim ricombinante, prodotto in E.coli, differisce per la presenza di una metionina in più all estremità N-terminale e per l assenza di glicosilazione, in quanto il sistema di espressione batterico (E.coli) manca di tale capacità.

17 L altra versione ricombinante del G-CSF, il Lenograstim, è una sequenza naturale. È una proteina a singola catena di 174 amminoacidi O-glicosilata, in quanto il sistema di espressione eucariote (cellule CHO) è dotato di tale capacità. Il GM-CSF endogeno è una glicoproteina di 127 amminoacidi, glicosilata sia all N che all O. il suo PM varia con l entità della glicosilazione ed è compreso tra 18 e 30 kd. Le versioni ricombinanti di GM-CSF, Molgramostim e Sargramostim, sono costituite rispettivamente da 128 e 127 amminoacidi. Il Molgramostim, prodotto da un ceppo di E.coli, non è glicosilato e differisce dalla proteina endogena per la presenza di un isoleucina in posizione 100: il PM è di 14 kd. Il Sargramostim, prodotta nel S. cervisiae, differisce dal GM-CSF endogeno umano per la presenza di una leucina in posizione 23 e per la glicosilazione (esso, infatti, è N-glicosilato, mentre la proteina endogena è sia N- che O-glicosilata). Da notare che le piccole differenze tra i prodotti ricombinanti e le glicoproteine endogene non si traducono in una diversità di azione biologica.

18 Prodotti farmaceutici Il G-CSF umano ricombinante non glicosilato (Filgrastim) è disponibile con i marchi GRANULOKINE 30 e NEUPOGEN 30. Le specialità contengono 30 milioni di UI di principio attivo e sono commercializzate, entrambe, sia come preparazioni iniettabili (fiale da 1 ml), che come siringhe preriempite (da 0.5 ml). La versione ricombinante glicosilata del G-CSF umano (Lenograstim) è disponibile con i marchi GRANOCYTE 34 e MYELOSTIM 34. Le formulazioni contengono 33.6 milioni di UI di principio attivo. La prima specialità è commercializzata sotto forma di polvere liofilizzata più solvente per soluzione iniettabile (fiale da 1 ml), la seconda come siringhe preriempite (da 1 ml). Tutte le preparazioni devono essere mantenute a 2-8 C. dopo la ricostituzione, sia il Filgrastim che il Lenograstim si conservano stabili a temperatura ambiente per 24 ore. La somministrazione si effettua per iniezione sottocutanea o infusione endovenosa. La distribuzione e la clearance del plasma sono simili per entrambe le vie di somministrazione ed entrambi i farmaci, forniscono [ ] crescenti con il dosaggio.

19 La somministrazione del G-CSF umano ricombinante dopo chemioterapia intensiva, o trapianto di midollo osseo, aumenta la produzione di granulociti e riduce il periodo di granulocitopenia grave. Lo schema posologico è funzione della risposta granulocitaria e la durata della terapia dipende dalla specifica applicazione. Quando l obiettivo è la mobilizzazione e la raccolta delle cellule progenitrici del sangue periferico, prima della chemioterapia e la loro successiva restituzione (trapianto per infusione autologa), è sufficiente una settimana circa di trattamento; lo stesso dicasi per la raccolta di cellule progenitrici da donatori (trapianto per infusione allogenica). Nel trapianto di midollo, o nei pazienti in chemioterapia intensiva, per correggere la neutropenia grave, può rendersi necessaria la somministrazione giornaliera continua di rg-csf per 2-3 settimane, o più; in caso di neutropenia persistente (ad es.: pazienti affetti da HIV), puo essere necessario un trattamento cronico.

20 È disponibile, anche in Italia, il pegfilgrastim (NEULASTA, NEUPOPEG ), una forma di filgrastim ad effetto prolungato, ottenuta per coniugazione del C-CSF umano ricombinante con una molecola di PEG. Le formulazioni, siringhe preriempite da 0.6 ml, contengono 6 mg di principio attivo. La conservazione ottimale è in frigorifero (2-8 C), ma può essere mantenuto a temperatura ambiente (non oltre i 30 C) per un periodo massimo di 72 ore. Dopo somministrazione di una singola dose sottocutanea in pazienti neutropenici, le [ ] plasmatiche massime di pegfilgrastim vengono raggiunte entro 72 ore e l emivita mediana è di circa 33 ore. L eliminazione non è lineare rispetto alla dose, ma la clearance sierica descresce con l aumentare della dose. L eliminazione di pegfilgrastim sembra avvenire attraverso una clearance neutrofilo-mediata, che viene saturata a dosi elevate. La forma pegilata di filgrastim presenta una minore flessibilità nella scelta della dose minima efficace rispetto al Filgrastim. È raccomandato un dosaggio di 6 mg per ogni ciclo di chemioterapia, somministrato come iniezione sottocutanea 24 ore dopo la chemioterapia citotossica.

21 Il GM-CSF umano ricombinante non glicosilato (Molgramostim) è disponibile come polvere liofilizzata sterile, da ricostituire con acqua per preparazioni iniettabili. Le specialità (LEUCOMAX, MIELOGEN ) contengono da 1.67 a 4.44 milioni di UI ( µg) di principio attivo. La conservazione ottimale è ad una temperatura di 2-8 C, al riparo dalla luce. Dopo ricostituzione, la soluzione può essere conservata (2-8 C) fino a 24 ore. La somministrazione è per via endovenosa o sottocutanea e, in entrambi i casi, per dosaggi crescenti, gli incrementi della area totale sotto la curva sono correlati alla dose. La [ ] massima sierica di Molgramostim si raggiunge entro 3-4 ore dalla somministrazione sottocutanea, con un emivita di eliminazione di 2-3 ore. Nei pazienti sottoposti a chemioterapia antineoplastica, per ridurre il rischio di infezioni conseguenti a neutropenia, il dosaggio raccomandato è di milioni di UI da somministrare, per via sottocutanea, un giorno dopo l ultima dose di chemioterapia, con trattamento continuato per 7-10 giorni.

22 La versione ricombinante glicosilata del GM-CSF, Sargramostim (LEUKINE, non disponibile in Italia), è commercializzata in fiale contenenti 250 e 500 µg di prodotto liofilizzato, da somministrare per iniezione sottocutanea, o infusione endovenosa lenta. Le fiale devono essere refrigerate (2-8 C), evitando congelamento ed agitazione. Una volta ricostituita con 1 ml di acqua per preparazioni iniettabili, la fiala va somministrata entro 6 ore. Il livello plasmatico di Sargramostim aumenta rapidamente dopo iniezione sottocutanea, quindi declina, con un emivita di 2-3 ore. Infondendo del 2 ore il farmaco per via endovenosa, le [ ] sieriche diminuiscono dapprima rapidamente, per poi declinare in modo più graduale. Se somministrato per via endovenosa, l infusione deve protrarsi per 3-6 ore. Dopo trapianto di midollo o chemioterapia intensiva, nel periodo di massima neutropenia, Sargramostim viene somministrato giornalmente (dose µg su m 2 di superficie corporea), fino a quando non si osserva un aumento significativo nella conta dei granulociti. Qualora la risposta non fosse sufficiente dopo 1-2 settimane di trattamento, la dose può essere aumentata.

23 Indicazioni terapeutiche I fattori di crescita emopoietici sono indicati per il trattamento di molti disturbi che interessano varie cellule ematiche. Un bersaglio terapeutico logico è costituito dalle malattie legate ai neutrofili e dalle malattie infettive, in quanto il risultato terapeutico, per la maggior parte delle infezioni, è direttamente collegato al rifornimento all esercizio delle cellule fagocitarie dell ospite. Un anomalo funzionamento dei leucociti neutrofili o un loro numero insufficiente (neutropenia) determinano nei pazienti una risposta immunitaria imperfetta e un maggiore rischio di infezione. I fattori di crescita mieloidi regolano l attività funzionale dei neutrofili maturi ed aiutano a combattere l infezione. Ai fini terapeutici, la principale azione del GM-CSF è l aumento della produzione di neutrofili, potenziandone la loro funzione fagocitaria e citotossica. Per quanto riguarda il GM-CSF, il suo effetto principale, ai fini terapeutici, è la stimolazione della mielopoiesi.

24 I prodotti ricombinanti a base di G-CSF (Filgrastim, Lenograstim) e a base di GM-CSF (Molgramostim, Sargramostim), sono indicati nel trattamento della neutropenia associata a chemioterapia anticancro mielosoppressiva, in modo da ridurre il rischio di infezioni. Nella Tabella 3 sono riportati i risultati di una sperimentazione di fase I circa l azione svolta, in vivo, da rg-csf e rgm-csf su pazienti affetti da cancro in fase avanzata. Entrambi i fattori causano leucopenia temporanea, seguita da un aumento dose-dipendente del numero di neutrofili. GM-CSF aumenta anche il numero degli eosinofili e dei monociti circolanti. Questi cambiamenti a carico del sangue si accompagnano ad aumento delle cellule del midollo osseo e del rapporto tra le cellule progenitrici mieloidi ed eritrociti. Entrambi i fattori di crescita mieloidi sono indicati anche nel trattamento di pazienti sottoposti a terapia mieloablativa in preparazione a trapianto di midollo osseo autologo, per la riduzione della durata della neutropenia. Anche la diminuzione patologica dei leucociti neutrofili nei pazienti portatori di HIV, in trattamento con farmaci antivirali o altri mielosoppressori, può essere parzialmente o completamente corretta dalla somministrazione di rg-csf, o rgm-csf.

25 Tabella 3 Effetti ematologici in vivo di rg-csf e rgm-csf su pazienti affetti da cancro in fase avanzata LINEA CELLULARE rg CSF rgm CSF Neutrofili Aumento di produzione e funzione Aumento di produzione e funzione Monoci//macrofagi Nessun effe>o Aumento di produzione e funzione Eosinofili Nessun effe>o Aumento di produzione Piastrine Nessun effe>o Nessun effe>o di rilievo

26 Una ricerca effettuata su 200 pazienti ammalati di AIDS e affetti da neutropenia ha evidenziato, in seguito a trattamento con Filgrastim, una inversione della neutropenia nel 96% dei pazienti, entro un tempo medio di tre giorni; inoltre, nel corso della ricerca, la stessa percentuale di pazienti è stata in grado di aumentare la dose di farmaci antivirali assunti o di aggiungerne alla propria terapia. Il G-CSF si è dimostrato efficace anche nel trattamento delle neutropenie congenite gravi e, nei pazienti con neutropenia ciclica, aumenta il livello di neutrofili e abbrevia la lunghezza del ciclo, in misura sufficiente a prevenire le infezioni batteriche ricorrenti. Sia il Filgrastim che il Lenograstim sono abitualmente impiegati nella mobilizzazione di cellule progenitrici emopoietiche nel sangue periferico, per la raccolta e la successiva reinfusione autologa, o allogenica. I pazienti trapiantati con cellule staminali raccolte dal sangue periferico, richiedono un minor numero di giorni di trasfusione di piastrine ed eritrociti, e un ospedalizzazione più breve rispetto ai pazienti che hanno ricevuto un trapianto autologo di midollo osseo.

27 L indicazione approvata per il pegfilgrastim è la riduzione della durata della neutropenia e dell incidenza di neutropenia febbrile, in pazienti trattati con chemioterapia citotossica per neoplasia. In diversi studi clinici randomizzati in doppio cieco, condotti su pazienti affetti da neoplasia e sottoposti a chemioterapia mielosoppressiva, una singola somministrazione sottocutanea di pegfilgrastim, per ciclo di chemioterapia, è risultata terapeuticamente equivalente a somministrazione giornaliere ripetute di Filgrastim (numero medio di somministrazioni compreso tra le 5 e le 9 fiale). Il pegfilgrastim non è stato ancora studiato in soggetti effetti da leucemia, né in pazienti neutropenici sottoposti a chemioterapia ad alte dosi, a trattamenti mielosoppressivi con antivirali o a trapianto di midollo osseo.

28 I prodotti a base di GM-CSF, Molgramostim e Sargramostim, sono indicati, in particolare, per accelerare il recupero mieloide dopo trapianto autologo di midollo osseo. Nel corso di uno studio randomizzato a doppio cieco, su 128 pazienti che hanno subito un trapianto di midollo osseo per cancro linfoide, a paragone con il placebo, il Sargramostim ha migliorato, in misura significativa, l impianto dei neutrofili a durata dell ospedalizzazione ed ha anche ridotto l incidenza complessiva di infezioni. Meno ben definito è, invece, il ruolo della terapia con GM-CSF nel trapianto allogenico. L effetto del fattore di crescita sul ripristino del numero di neutrofili è meno pronunciato; tuttavia, sembra migliorare la sopravvivenza nei trapianti che manifestano un rigetto precoce. Un altra indicazione approvata del Sargramostim è la stimolazione della mielopoiesi in pazienti con mielodisplasia, anemia aplastica o neutropenia da AIDS. Studi preliminari hanno indicato una certa efficacia di Sargramstim nel morbo di Crohn, per la capacità di stimolare le cellule del sistema immunitario dell intestino.

29 Gli effetti indesiderati più comuni legati alla somministrazione dei fattori di crescita mieloidi ricombinanti sono disturbi GI (nausea, vomito, diarrea), anoressia, febbre, dolori muscolo-scheletrici, reazioni al sito di iniezione, rash cutanei, più pronunciati per somministrazione di dosaggi elevati. Meno frequentemente sono stati riportati dolore toracico, cefalea, confusione, reazioni di ipersensibilità (tra cui anafilassi e broncospasmo) e rari casi di infiltrazioni polmonari con conseguente insufficienza respiratoria grave. I fattori di crescita mieloidi devono essere utilizzati con cautela in pazienti neutropenici affetti da tumori maligni della serie mieloide sottoposti a chemioterapia. Il beneficio che si ottiene riducendo, in tali pazienti, il periodo di neutropenia, deve essere valutato in confronto al rischio teorico di crescita tumorale, associato alla stimolazione delle citochine.