5. Applicazioni delle biotecnologie innovative nello sviluppo di nuovi farmaci e prodotti farmaceutici biotecnologici commerciali

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1 5. Applicazioni delle biotecnologie innovative nello sviluppo di nuovi farmaci e prodotti farmaceutici biotecnologici commerciali 5.2. Citochine Interleuchine Interferoni Fattori di crescita emopoietici

2 CITOCHINE glicoproteine che agiscono da mediatori solubili e favoriscono la comunicazione tra cellule del sistema immunitario, nervoso ed ematico CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DELLE CITOCHINE: Citochine che mediano e regolano l immunità innata Azione diretta (produzione di interferone da parte di monociti, macrofagi) Azione indiretta (attivazione di macrofagi e cellule NK da parte di IL-12) Citochine che mediano e regolano l immunità acquisita Attivazione dei linfociti T e B e dei macrofagi Differenziazione di effettori citotossici Citochine che stimolano l emopoiesi Agiscono su cellule immature regolandone differenziazione, maturazione e proliferazione Citochine come sensore biologico delle condizioni dell organismo Danno tissutale, presenza di microrganismi, ipossia

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4 Interleuchine (da interleucocita) favoriscono la comunicazione tra globuli bianchi mediano l azione dei leucociti CLASSIFICAZIONE ATTUALE DELLE CITOCHINE (basata sulla capacità funzionale) Interferoni interferiscono con l infezione virale all interno della cellula Fattori di crescita emopoietici stimolano la produzione di cellule mieloidi Chemochine attraggono cellule verso il loro sito di produzione (attività chemiotattica) Citochine infiammatorie CLASSIFICAZIONE STORICA DELLE CITOCHINE (in base alle cellule da cui sono prodotte) Linfochine Prodotte dai linfociti Monochine prodotte dai macrofagi

5 La secrezione è un evento di breve durata e autolimitato Le azioni svolte sono spesso pleiotropiche e ridondanti Influenzano la sintesi e l azione di altre citochine Azione locale o sistemica Svolgono la loro funzione legandosi a recettori specifici sulle cellule bersaglio, la cui espressione è regolata da segnali esterni alla cellula Agiscono modulando l espressione genica CARATTERISTICHE GENERALI DELLE CITOCHINE

6 CARATTERISTICHE DELLE CITOCHINE (1)

7 CARATTERISTICHE DELLE CITOCHINE (2) azione locale o sistemica IL-2/linfociti T IL-1

8 CITOCHINE vs ORMONI (4)

9 CARATTERISTICHE DELLE CITOCHINE (3) famiglie dei recettori delle citochine * RECETTORI SOLUBILI

10 CARATTERISTICHE DELLE CITOCHINE (4) trasduzione del segnale

11 CARATTERISTICHE DELLE CITOCHINE (4) trasduzione del segnale

12 Interleuchine e proteine ricombinanti correlate

13 Interleuchina-2 (IL-2) fattore di crescita autocrino dei linfociti T favorisce proliferazione e differenziazione di altre cellule

14 Interleuchina-2 (IL-2) proprietà immunoregolatrici

15 Recettore per IL-2 (IL-2R) espressione del recettore ad alta affinità in seguito ad attivazione delle cellule T bassa affinità alta affinità attivazione cellule T

16 Complesso IL-2 recettore

17 Prodotto ricombinante ottenuto in E. Coli Aldesleuchina PROLEUKIN IL-2 (naturale) 132 aa (manca Ala N-terminale) NO glicosilazione Ser 125 (mutagenesi) Proteina fusa al Flag (EK) 133 aa (15.6 kd) glicosilata su Thr3 Cys 125 un legame disolfuro (essenziale per l attività) Formulazione Liofilizzata (x uso parenterale) Tendenza all aggregazione (27 molecole, attive) Somministrazione sottocutanea (raramente IV) conc. sierica proporzionale alla dose Emivita = 85 minuti Metabolizzata nel rene INDICAZIONI TERAPEUTICHE: Bioterapia (= immunoterapia) del cancro (carcinoma metastatico renale e anche melanoma metastatico) EFFETTI COLLATERALI: Tossicità globale (midollare, epatica, renale, tiroidea, aumento premeabilità capillare.) Denileukin diftitox ONTAK (non commercializzata in Italia) Proteina di fusione: [tossina difterica-il2] Target: cellule T maligne che esprimono il componente CD25 del recettore di IL-2 (leucemie, linfomi) Somministrazione endovenosa Emivita minuti INDICAZIONI TERAPEUTICHE: Linfoma cutaneo delle cellule T ( blocco sintesi proteica morte cellulare) EFFETTI COLLATERALI: Ipotensione Dolori muscolo-scheletrici Vasodilatazione

18 Bioterapia con Aldesleukina Cellule T, NK e LAK (Lymphokin Activated Killers)

19 Interleuchina-1 (IL-1) mediatore chiave dell infiammazione FUNZIONI mediatore chiave dell infiammazione Secreta da monociti e macrofagi in risposta a microrganismi patogeni, interagisce con recettori presenti su linfociti, macrofagi.. Stimola i linfociti T e induce il rilascio di IL-2 Stimola crescita e differenziazione dei linfociti B risposta flogistica Coopera con TNF-α Attività regolata da IL-1 Ra (regolatore fisiologico) STRUTTURA 2 forme: IL-1α e IL-1β (2 geni diversi) di 17 kd, con omologia strutturale del 30% Pro-peptidi da 30 kd (maturati da una caspasi) Fattori ridondanti, pleiotropici 2 recettori: IL-R1 ed IL-R2 IL-R1: espresso da linfociti T, fibroblasti, epatociti, cellule endoteliali; affinità maggiore per IL-1β IL-R2 : affinità maggiore per IL-1α AcP: proteina accessoria necessaria per la trasmissione del segnale IL-1 Ra (IL-1 Receptor antagonist) = inibitore competitivo endogeno prodotto dai macrofagi inibisce gli effetti mediati da IL-1

20 CONDIZIONI FISIOLOGICHE IL-1 Ra compete con IL-1 per il legame al recettore IL-R1 e ne regola l attività CONDIZIONI PATOLOGICHE La sovraespressione di IL-1 impedisce il controllo da parte di IL-1 Ra

21 Prodotto farmaceutico prodotto in E. Coli Anakirna KINERET IL-1 Ra ricombinante R-Met-hIL-1 Ra (Met in più all N-terminale) Stesse attività dell inibitore endogeno (vs IL-1α ed IL-1β) FORMULAZIONI: Formulazione liquida (siringhe pre-riempite): 100 mg/0.67 ml SOMMINISTRAZIONE: Sottocutanea (SC) BIODISPONIBILTA : 95% (picco in 3-7 ore) EMIVITA: 4-6 ore ELIMINAZIONE: con le urine INDICAZIONI TERAPEUTICHE: Artrite reumatoide (in monoterapia o in associazione con Metotrexate) EFFETTI COLLATERALI: Reazioni nel sito di inezione Cefalea Neutropenia Infezioni gravi

22 Interferoni (IFN) Citochine dotate di attività antivirale ad ampio spettro, immunomodulatrice e antiproliferativa Glicoproteine 3 classi principali: interferone-α, -β, -γ Interferone-α (IFN-α): prodotto da leucociti e macrofagi Interferone-β (IFN- β): prodotto da fibroblasti, cellule epiteliali e macrofagi Interferone-γ (IFN- γ): prodotto da linfociti T e cellule NK IFN di tipo II IFN di tipo I MECCANISMO D AZIONE: Interazione con recettori di membrana Trasduzione del segnale JAK-STAT Legami di fattori di regolazione alle sequenze ISRE (Interferon-Stimulated Response Element) Trascrizione genica Sintesi di proteine antivirali, antiproliferative etc che ne mediano gli effetti finali

23 INTERFERONE nella resistenza cellulare all attacco virale

24 Risposta della cellula alla presenza di RNA virale ds viral dsrna APOPTOSI McManus, Nat. Rev. Genet. (2002)

25 Altre attività mediate dall INTERFERONE Azione antiproliferativa sulle cellule tumorali (MECCANISMO DIRETTO) Regolazione di vari aspetti della risposta immunitaria

26 : IFN-α, IFN-β

27 INTERFERONE-α ATTIVITA : antivirale e antiproliferativa 20 polipeptidi ( 19kD), codificati da geni diversi 2 sottogruppi: α1 ed α2 Ricchi di Gly e Glu; Cys conservate IFN-α umane costituiti da 165 o 166 aa

28 Prodotti farmaceutici ottenuti in E. Coli Interferone-α2a ROFERON-A Interferone-α2b INTRON-A 165 aa (Lys 23) Purificazione con cromatografia di affinità Peginterferone-α2a PEGASYS Derivato coniugato con PEG 165 aa (Arg 23) Purificazione con cromatografia di affinità Peginterferone-α2b PEGINTRON Derivato coniugato con PEG FORMULAZIONI: Formulazione liquida (versioni α2a); liofilizzata (α2b) SOMMINISTRAZIONE: Intramuscolare, intralesionale o intravescicolare BIODISPONIBILTA : 100% (picco dopo 3-12 ore) EMIVITA: 2-3 ore (più rapida nella somministrazione endovenosa) ELIMINAZIONE: Principalmente epatica PEGILAZIONE: emivita maggiore, più prolungata attività antivirale INDICAZIONI TERAPEUTICHE: Antivirali: epatite cronica B e C Antineoplastici: linfomi (leucemia a cellule capellute, linfoma follicolare) e tumori solidi (sarcoma di Kaposi, melanoma maligno, mieloma multiplo ) EFFETTI COLLATERALI: Variabili nei vari pazienti Più frequenti: febbre, spossatezza, cefalea, mialgia Meno frequenti (1/10): infezioni virali, disturbi del sistema emolinfopoietico, etc.

29 IFN -n3 ALFERON miscela di elevata purezza contenente fino a 14 sottotipi di IFN umano. si ottiene da unità riunite di leucociti umani indotti a liberare IFN mediante l infezione incompleta con il virus Sendai (uccelli). purificazione tramite cromatografia di immunoaffinità con anticorpi monoclonali (mab) murini, seguita da cromatografia per gel-filtrazione.

30 INTERFERONE-β ATTIVITA : antivirale e immunomodulatrice glicoproteina di 165 aa ( 20kD), codificata da un singolo gene 3 Cys conservate un ponte disolfuro; glicosilazione su Asn80 Prodotto da fibroblasti e cellule del mesenchima embrionale mutagenizzata nel prodotto ricombinante per impedire oligomerizzazione

31 Prodotti farmaceutici Interferone-β1b BETASERON Interferone-β1a AVONEX, REBIF 165 aa (Ser 17 invece di Cys) Prodotto in E. Coli FORMULAZIONI: Liofilizzata in fiale SOMMINISTRAZIONE: Sottocutanea BIODISPONIBILTA : BASSA: livelli plasmatici poco significativi EMIVITA PLASMATICA: 4 ore 165 aa (NO mutagenesi) Prodotti in cellule di mammifero FORMULAZIONI: Liofilizzata in fiale o siringhe preriempite SOMMINISTRAZIONE: Intramuscolare (1 volta/settimana) BIODISPONIBILTA : BASSA: livelli plasmatici poco significativi EMIVITA PLASMATICA: 4 ore INDICAZIONI TERAPEUTICHE: Sclerosi multipla recidivante-remittente (RRMS) e secondaria progressiva BETASERON riduce la frequenza e la gravità delle ricadute nella RRMS; applicato anche nella sclerosi multipla secondaria progressiva AVONEX: trattamento pazienti con deambulanti con sclerosi multipla recidivante e pazienti con un unica crisi demielinizzante grave REBIF: trattamento pazienti con RRMS EFFETTI INDESIDERATI FREQUENTI: Infiammazione locale; febbre, mialgia; leucopenia, anemia, trombocitopenia

32 SCLEROSI MULTIPLA (patologia infiammatoria su base autoimmunitaria) linfociti, macrofagi Movimenti tremolanti, debolezza muscolare, paralisi, difetti nel linguaggio, nella visione.

33 INTERFERONE-γ ATTIVITA : immunomodulatrice e antivirale (minore di IFN-α e IFN-β) glicoproteina omodimerica: subunità di 143 aa, codificata da un singolo gene Diversa glicosilazione (Asn 25 e 97): PM 20-25kD Identificate 5 forme tronche al C-terminale Prodotto da linfociti T stimolati e cellule NK

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35 Prodotti farmaceutici ottenuti in E. Coli Interferone-γ1b IMUKIN Polipeptide a catena singola di 140 aa (non glicosilato) FORMULAZIONI: Soluzione sterile iniettabile SOMMINISTRAZIONE: Sottocutanea BIODISPONIBILTA : 85% (picco dopo 7 ore = assorbimento lento) EMIVITA DI ELIMINAZIONE PLASMATICA: 30 min ELIMINAZIONE: Catabolismo renale ed epatico INDICAZIONI TERAPEUTICHE: Malattia granulomatosa cronica (difetto del metabolismo ossidativo dei fagociti che ne compromette le funzioni) somministrato in associazione con antibiotici Carcinoma renale e altri tumori (fase sperimentale) EFFETTI COLLATERALI: Sindrome similinfluenzale: febbre, cefalea, brividi, mialgia Patologie del sistema emolinfopoietico, del sistema nervoso

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38 CITOCHINE glicoproteine che agiscono da mediatori solubili e favoriscono la comunicazione tra cellule del sistema immunitario, nervoso ed ematico CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DELLE CITOCHINE: Citochine che mediano e regolano l immunità innata Azione diretta (produzione di interferone da parte di monociti, macrofagi) Azione indiretta (attivazione di macrofagi e cellule NK da parte di IL-12) Citochine che mediano e regolano l immunità acquisita Attivazione dei linfociti T e B e dei macrofagi Differenziazione di effettori citotossici Citochine che stimolano l emopoiesi Agiscono su cellule immature regolandone differenziazione, maturazione e proliferazione

39 EMOPOIESI O EMATOPOIESI processo che permette alle cellule precursori immature del midollo osseo di maturare e divenire cellule ematiche funzionali la crescita e la sopravvivenza delle cellule ematiche richiede la presenza di fattori specifici detti Fattori stimolanti la formazione di colonie (CSFs). tali fattori sono glicoproteine tra 14 e 34 KD con ponti disolfuro Cys-Cys. Eritrociti Emazie Leucociti Trombociti Trasportatori di O2 e CO2 (tramite Hb) Protezione da agenti estranei Ruolo nell emostasi, coagulazione sanguigna

40 EMOPOIESI PROLIFERAZIONE: riproduzione di cellule simili DIFFERENZIAZIONE: specializzazione e acquisizione di funzioni differenti rispetto ai precursori MATURAZIONE: mutamenti che determinano lo stadio funzionalmente attivo della cellula MOBILIZZAZIONE: i fattori di crescita inducono la migrazione delle cellule progenitrici dal midollo osseo al sangue periferico

41 LINEE PRINCIPALI DI CELLULE EMATICHE Cellula staminale Cellula committed Cellula staminale Pathway mieloide Pathway linfoide Eritrociti Piastrine o trombociti Monociti/ macrofagi Granulociti (neutrofili, eosinofili, basofili) Mastociti Linfociti T Linfociti B e plasma cellule Cellule NK

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43 FATTORI DI CRESCITA EMOPOIETICI Fattori multilinea: (GM-CSF, IL-3, SCF) Fattori specifici per linea: (G-CSF, M-CSF, EPO) Influiscono su più linee e tendono ad agire sulle prime cellule progenitrici Influiscono prevalentemente su un solo tipo cellulare ed agiscono lungo la cascata emopoietica più tardi AGISCONO ATTRAVERSO IL BINDING A RECETTORI DELLA SUPERFICIE CELLULARE

44 esistono RICOMBINANTI

45 Basse concentrazioni in circolo Agiscono attraverso il binding a RECETTORI della superficie cellulare Hematopoietic Growth Factors (HGFs) Colony Stimulating Factors (CSFs) EFFETTO DIRETTO segnalazione intracellulare alterazione espressione genica Proliferazione EFFETTO INDIRETTO induzione produzione altra citochina risposta finale Funzione Differenziazione

46 Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) ATTIVITA : agisce su neutrofili, eosinofili, ma anche monociti e macrofagi Glicoproteina di 127 aa O- ed N-glicosilata ( kd) Concentrazione nel siero: pg/ml Meccanismi di regolazione dell attività funzionale Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF) ATTIVITA : stimola la proliferazione, differenziazione e funzione dei granulociti glicoproteina O-glicosilata di 20kD 2 forme: tipo a meno attivo (177 aa); tipo b più attivo (174 aa) codificata da un singolo gene Concentrazione nel siero: 9-51 pg/ml diretto GM-CSF G-CSF indiretto 4 α-eliche antiparallele a corta catena 4 α-eliche antiparallele a lunga catena Legame GM-CSF/recettore rilascio citochine (G-CSF, IL-1, TNF) effetto su altre cellule

47 Prodotti farmaceutici a base di GM-CSF Molgramostim LEUKOMAX MIELOGEN Sargramostim LEUKINE 128 aa (Ile in posizione 100): Mw 14.5 kd NO glicosilazione Prodotto in E. Coli FORMULAZIONI: Liofilizzata SOMMINISTRAZIONE: Endovenosa o sottocutanea BIODISPONIBILTA : Picco dopo 3-4 ore da somministrazione SC EMIVITA PLASMATICA: 2-3 ore (1-2 ore per IV) 127 aa (Leu in posizione 23) Solo N-glicosilato Prodotto in Saccharomyces cerevisiae FORMULAZIONI: Liofilizzata SOMMINISTRAZIONE: Sottocutanea o endovenosa BIODISPONIBILTA : Dipende da somministrazione EMIVITA PLASMATICA: 2-3 ore Prodotti farmaceutici a base di G-CSF Filgrastim GRANULOKINE, NEUPOGEN Lenograstim GRANOCYTE, MYELOSTIM 175 aa (una Met in più all N-terminale) Prodotto in E. Coli NO glicosilazione FORMULAZIONI: Iniettabile o siringhe preriempite SOMMINISTRAZIONE: Sottocutanea o endovenosa BIODISPONIBILTA : Picco dopo 4-5 ore EMIVITA: 3.5 ore Pegfilgrastim: picco a 72 ore, emivita 33 ore 174 aa (sequenza naturale) Prodotti in CHO O-glicosilazione FORMULAZIONI: Liofilizzata o siringhe preriempite SOMMINISTRAZIONE: Sottocutanea o endovenosa BIODISPONIBILTA : Picco dopo 4-5 ore EMIVITA: 3.5 ore

48 Prodotti farmaceutici a base di rgm-csf (filgrastim, lenograstim, pegfilgrastim) e rg-csf (molgramostim, sargramostim) INDICAZIONI TERAPEUTICHE: Neutropenia indotta da trattamento chemioterapico Pazienti sottoposti a terapia mieloablativa, in preparazione a trapianto di midollo osseo autologo) Recupero mieloide dopo trapianto di midollo osseo o di cellule progenitrici ematiche periferiche rgm-csf Neutropenia cronica grave rg-csf AIDS (diminuzione neutrofili durante trattamento con antivirali) Malattie infettive (si richiede l aumento di fagocitosi ed eliminazione anticorpo-dipendente) Cautela nel caso di tumori maligni della serie mieloide EFFETTI INDESIDERATI FREQUENTI: Disturbi gastro-intestinali, anoressia, astenia, febbre, dolori muscolo-scheletrici, reazioni al sito di iniezione

49 EFFETTI in vivo di rg-csf e rgm-csf

50 ERITROPOIETINA (EPO) ATTIVITA : stimola la divisione e differenziazione dei proeritroblasti in globuli rossi maturi glicoproteina di 165 aa; codificata da un singolo gene MW 18.4 kd (non glicosilata), kd (glicosilata) 2 ponti disolfuro; 4 siti di glicosilazione (1 catena O- e 3 catene N-) entrambi ESSENZIALI PER L ATTIVITÀ BIOLOGICA Prodotta dalle cellule interstiziali del rene (90%) e dal fegato ( 10%) trasportata al midollo interazione con recettore sui proeritroblasti Concentrazione sierica: 3-7 mu/ml

51 Produzione di repo: isolamento del gene

52 Prodotti farmaceutici Epoetina alfa EPREX Darbepoetina alfa ARANESP, NESPO stessa sequenza aminoacidica e pressochè identica glicosilazione di Epoetina beta Prodotta in CHO (cellule ovariche di criceto cinese) FORMULAZIONI: siringhe preriempite SOMMINISTRAZIONE: IV (in 1-5 min) o SC (NO in caso di insufficienza renale) BIODISPONIBILTA : 25-40% (dopo iniezione sottocutanea) Epoetina beta NEORECORMON stessa sequenza aminoacidica e pressochè identica glicosilazione di Epoetina beta Prodotta in CHO (cellule ovariche di criceto cinese) EMIVITA PLASMATICA: 4-12 ore (somministrazione IV), ore (somministrazione SC) Darbepoetina alfa: mutagenizzata, iperglicosilata emivita più lunga : 21 ore (IV), 73 ore (SC) INDICAZIONI TERAPEUTICHE: diversi tipi di anemia (diminuzione dell emoglobina o del numero di eritrociti) Anemia associata ad insufficienza renale cronica (pazienti emodializzati) Anemia da trattamento dell AIDS con zidovudina (mielosoppressore) o da chemioterapia anticancro EFFETTI INDESIDERATI FREQUENTI: Sintomatologia similinfluenzale, aumento di eventi trombotici vascolari, effetti derivanti dalla malattia sottostante Recettori EPO espressi sulla superficie di diverse cellule tumorali CONTROINDICAZIONE (?)

53 IMPIEGHI COLLAUDATI DEI rhhgfs Neutropenia indotta da chemioterapia (Filgrastim, Lenograstim, Pegfilgrastim, Sargramostim, Molgramostim) Trapianto di midollo (autologo/allogenico) o di cellule staminali (Filgrastim, Lenograstim, Sargramostim, Molgramostim) Mobilizzazione di cellule progenitori degli elementi del sangue per recupero e trapianto (Filgrastim, Sargramostim, Molgramostim, Ancestim= rhscf) Neutropenia cronica grave (congenita, periodica, idiopatica) (Filgrastim) AIDS (neutropenia, anemia, trombocitopenia) (Filgrastim, rhepo) Anemia (riduzione: numero RBC, volume RBC, concentrazione Hb) (rhepo, Darbepoetin alfa) Trombocitopenia (Oprelvekin = rhil-11)

54 CARATTERISTICHE DEI PRODOTTI FARMACEUTICI A BASE DI rhhgfs MANIPOLAZIONI SCONSIGLIATE No freezing No shaking FARMACOCINETICA Dipende da terapie concomitanti, dose, via di somministrazione EFFETTI AVVERSI (TOSSICITA ) Febbre, mialgia, reazioni nel sito di iniezione, sviluppo di anticorpi neutralizzanti (basso rischio), effetti secondari dovuti al rilascio di citochine EFFETTI AVVERSI (DETERMINAZIONE) Difficile per: mancanza di studi comparativi, diverse formulazioni, effetto glicosilazione

55 Approfondimenti Testi di riferimento Calabrò M.L. Compendio di Biotecnologie farmaceutiche (EdiSES) Cap. 9 Crommelin D.J.A. Pharmaceutical Biotechnology (Informa Healthcare) Cap. 10 Abbas Abul K., Lichtman Andrew H., Pober Jordan S. Immunologia cellulare e molecolare (PICCIN) Cap. 11