PRACTICE. Consensus Workshop e Raccomandazioni

Transcript

1 C LINICAL PRACTICE Consensus Workshop e Raccomandazioni sull'impiego delle diverse metodiche per la determinazione dello stato di HER2 nel carcinoma mammario e nel carcinoma gastrico Con l Endorsement del Gruppo di Lavoro sulla Terapia Molecolare dei Tumori

2 A cura del gruppo di lavoro AIOM-SIAPEC-IAP Vincenzo Adamo (Messina) Carlo A.M. Barone (Roma) Oscar Bertetto (Torino) Generoso Bevilacqua (Pisa) Roberto Biffi (Milano) Roberto Bordonaro (Catania) Antonino Carbone (Aviano-PN) Emanuele D'Amore (Vicenza) Marco Danova (Pavia) Angelo Paolo Dei Tos (Treviso) Michele De Laurentiis (Napoli) Lucia Del Mastro (Genova) Sabino De Placido (Napoli) Ferdinando De Vita (Napoli) Francesco Di Costanzo (Firenze) Claudio Doglioni (Milano) Nicola Fazio (Milano) Roberto Fiocca (Genova) Nicola Gebbia (Palermo) Annunziata Gloghini (Milano) Stefania Gori (Perugia) Stefano Iacobelli (Chieti) Roberto Labianca (Bergamo) Vito Lorusso (Lecce) Eugenio Maiorano (Bari) Annamaria Molino (Verona) Filippo Montemurro (Torino) Marcella Mottolese (Roma) Oscar Nappi (Napoli) Cecilia Nisticò (Roma) Carmine Pinto (Bologna) Massimo Rugge (Padova) Anna Sapino (Torino) Mario Scartozzi (Ancona) Alberto Sobrero (Genova) Gianluigi Taddei (Firenze) Mauro Truini (Genova) Giovanni Tuccari (Messina) Marco Venturini (Verona) Giuseppe Viale (Milano) 2

3 Indice Pagina 5 Pagina 6 Pagina 8 Pagina 12 Pagina 14 Pagina 14 Pagina 15 Pagina 22 Introduzione HER2 e altri parametri predittivi nel carcinoma mammario Requisiti minimi e standard di refertazione Gli statement Raccomandazioni Le metodiche di rilevazione Immunoistochimica nella determinazione dello stato di HER2 Le tecniche di ibridazione di situ: FISH/CISH/SISH Raccomandazioni Pagina 25 Pagina 27 Pagina 28 Pagina 3 Trastuzumab nel trattamento del carcinoma gastrico e della giunzione gastroesofagea HER2-positivo: le evidenze cliniche Criteri di eleggibilità della terapia antiher2 Gli statement sul carcinoma gastrico Raccomandazioni per la determinazione dello stato di HER2 nel carcinoma gastrico Pagina 36 Bibliografia 3

4 4 Consensus Workshop e Raccomandazioni sull'impiego delle diverse metodiche

5 Introduzione Gli approfondimenti relativi alla caratteristiche biologiche del carcinoma mammario e gastrico hanno radicalmente mutato l'approccio terapeutico a queste patologie. In particolare, grazie alla disponibilità di trastuzumab, è oggi possibile instaurare un trattamento mirato sui tumori HER2 positivi che costituiscono circa il 15-2 % dei tumori mammari e più del 2% dei tumori gastrici metastatici o localmente avanzati. L'identificazione dei soggetti candidati alla terapia personalizzata con trastuzumab assume pertanto un'importanza decisiva al fine di mutare la prognosi dei pazienti affetti da tumori HER2 positivi. E' importante, però, che le acquisizioni metodologiche, a livello laboratoristico e clinico, siano di volta in volta discusse e concordate dalle figure professionali cui è demandata la valutazione dei pazienti, in particolare dal patologo e dall'oncologo. Questo, ancora una volta, lo spirito che ha animato i lavori della Quarta Edizione del Consensus Workshop, dedicata a "HER2 e altri parametri predittivi", evento che si è celebrato a Catania sotto l'egida di AIOM e SIAPEC. Un'occasione di incontro tra specialisti patologi e oncologi che, oltre alle consuete sessioni plenarie per fare il punto sullo stato dell'arte in materia, ha previsto la costituzione di 4 gruppi di lavoro dedicati ad argomenti di grande attualità, al centro della ricerca di settore. Lo spazio riservato dal Consensus Workshop al carcinoma mammario HER2 positivo si è posto un duplice obiettivo: da un lato, fare il punto e riaffermare il consenso degli specialisti sulle informazioni raccolte nel corso degli anni e che si sono tradotte di recente nelle "Raccomandazioni sui requisiti minimi e gli standard di refertazione e sull utilizzo di metodiche per la determinazione dello stato di HER2 nel carcinoma mammario. Dall'altro lato, il Consensus Workshop mette a punto strategie condivise su problematiche particolari, quali il trattamento dei tumori mammari HER2 positivi di piccole dimensioni, il significato della polisomia del cromosoma 17 e dei cloni focali HER2 positivi. Inoltre, per la prima volta nell'ambito dei Consensus Workshop sui tumori HER2 positivi, un gruppo di lavoro specifico è giunto all'elaborazione di statement sulla valutazione dello stato di HER2 nei tumori gastrici e della giunzione gastroesofagea. Gli statement, basati in gran parte sulle esperienze cliniche raccolte dallo studio ToGA, sono stati successivamente votati da tutti i partecipanti all'evento e costituiscono un primo importante momento di condivisione tra gli specialisti italiani, confluito successivamente nelle Raccomandazioni per la determinazione dello stato di HER2 nel carcinoma gastrico. I due documenti, a cui abbiamo dato ampio spazio in questa edizione speciale di Clinical Practice, sono disponibili sui siti web delle due società ( e costituiscono il riferimento attuale per la valutazione dello stato di HER2 in questi pazienti. 5

6 HER2 e altri parametri predittivi nel carcinoma mammario Il percorso intrapreso già da diversi anni dal gruppo di lavoro AIOM-SIAPEC-IAP nel corso dei vari Consensus Workshop Palermo, Taormina, Paestum e Catania, è culminato nella messa a punto di raccomandazioni, recentemente pubblicate sul sito AIOM (www,aiom.it). Nella più recente Consensus di Catania (14-15 aprile 21), si è concretizzato un importante confronto tra anatomopatologi e oncologi su alcune tematiche di attualità in questo campo: il trattamento terapeutico dei tumori mammari HER2-positivi di piccole dimensioni, la polisomia del cromosoma 17, i cloni focali con amplificazione del gene HER2. I risultati dei gruppi di lavoro sono stati poi oggetto di discussione in plenaria, con votazione elettronica finale sugli statement elaborati da ogni gruppo tematico. La Consensus è parte di un percorso intrapreso già da diversi anni, e il cui primo importante risultato è stato la redazione di linee guida sottoscritte dalla SIAPEC-IAP e dall AIOM, presentate per la prima volta al Congresso Nazionale di Firenze nel 29. Accanto alle raccomandazioni cliniche per una gestione ottimale del carcinoma mammario, le linee guida integrano l iter standard per la determinazione della positività per HER2, osservata in circa il 15-2% dei carcinomi mammari. Le pazienti con carcinoma mammario HER2-positivo possono, infatti, beneficiare della terapia con trastuzumab, la prima targeted therapy ad avere ottenuto importanti risultati in termini di aumento della sopravvivenza dei tumori HER2-postivi, rendendola simile a quella, più favorevole, delle forme HER2-negative (Figura 1) In questa ottica, la definizione di requisiti minimi di refertazione, la standardizzazione della refertazione e l individuazione di percorsi diagnostico-terapeutici integrati sono cruciali per una gestione terapeutica ottimale: infatti, come afferma il professor Giuseppe Viale, dell Istituto Europeo di Oncologia ed Università degli Studi di Milano, chairman della Consensus di Catania: Ciò che il patologo scrive nel referto diventa uno dei pilastri fondamentali delle successive scelte terapeutiche. Ne consegue che una gestione integrata multispecialistica della paziente è necessaria, in quanto la scelta terapeutica è condizionata dalla caratterizzazione biologica, e pone in primo piano il ruolo del patologo, quale responsabile della congruità dei criteri diagnostici, prognostici e predittivi. D altro canto, l oncologo - applicando una strategia terapeutica basata sulla attesa risposta ai diversi trattamenti- è sempre di più figura centrale nella personalizzazione del trattamento. 1 Figura Trastuzumab ha modificato la prognosi delle donne con tumore mammario HER2-positivo Probabilità di sopravvivenza globale HER2 HER2+/no trastuzumab HER2+/trastuzumab Mesi dalla diagnosi Dawood S et al, J Clin Oncol. 21 Jan 1;28(1):92-8. Epub 29 Nov 23 Continua il percorso che ha portato l AIOM e la SIA- PEC-IAP alla realizzazione delle linee guida nazionali: centrale il ruolo della determinazione dell HER2-positività, primo step per l impostazione di una terapia personalizzata 6

7 2 Valutazione dello stato di HER2 Figura IIC FISH Utilizza anticorpi per la determinazione della iperespressione della proteina HER2 Utilizza ibridazione in situ con fluorescenza per determinare l amplificazione del gene HER2 Pubblicate a cura di AIOM- SIAPEC-IAP le recenti raccomandazioni per la determinazione dello stato di HER2 nel carcinoma mammario CISH SISH Utilizza ibridazione in situ con metodo cromogenico Utilizza ibridazione in situ con metodo all argento Perché trastuzumab funzioni è necessario che il carcinoma esprima la molecola HER2, ed è altresì indispensabile che gli esami preliminari per l identificazione di HER2 siano eseguiti il prima possibile e con la massima accuratezza. Si stima tra il 2-4% il tasso di errore nella diagnosi del carcinoma mammario HER2-positivo; ridurre questo errore ad appena il 5%, come auspicato dalle linee guida internazionali, significa una speranza di trattamento specifico per un ingente numero di donne: il carcinoma HER2-positivo- ogni anno- in Italia colpisce dalle 8. alle 1. donne. Inoltre, il continuo progredire delle conoscenze biologiche alla base dello sviluppo tumorale, unitamente all acquisizione, da parte dei patologi, di maggiore esperienza metodologica con i sistemi classici (IIC e FISH/CISH) (Figura 2) e l avvento di nuove tecniche di rilevazione, impongono una rivisitazione dello stato dell arte relativo alla gestione ottimale del carcinoma mammario HER2-positivo. Di recente sono state pubblicate a cura di AIOM-SIAPEC-IAP le Raccomandazioni sui requisiti minimi e gli standard di refertazione e sull utilizzo di metodiche per la determinazione dello stato di HER2 nel carcinoma mammario che rappresentano ad oggi il documento di riferimento in Italia. 7

8 Requisiti minimi e standard di refertazione Dalle sessioni delle Consensus dedicate al carcinoma mammario, gli statement votati, con un focus su alcuni degli argomenti più attuali Stato dei margini Per la valutazione dei margini il campione va chinato La valutazione dei margini va eseguita macroscopicamente con conferma istologica del margine più vicino, indicando la distanza in mm. Nel caso di infiltrazione visibile solo istologicamente si deve riportare se la medesima è focale o estesa ( di 1 campo a 4x) % Focolai multipli 8% Parzialmente 1% Disaccordo Il termine multicentrico o multifocale dovrebbe essere sostituito con il termine multiplo Tumori multipli nettamente separati da parenchima normale vanno campionati con le stesse modalità utilizzate per le neoplasie singole Focolai multipli di invasione insorti su un carcinoma duttale in situ vanno considerati come lesione % Refertazione 4% 2% Il referto deve includere tutti gli 8 parametri prognostico/predittivi identificati dal Consenso di St. Gallen. L inclusione nel referto di parametri aggiuntivi non è attualmente raccomandata Parametri San Gallen 1. Tipo istologico (sec. WHO 23) 2. Diametro del tumore 3. Grado 4. Invasione vascolare % 5. Stato linfonodale 6. Assetto recettoriale 7. HER2 8. Ki67 2% % Il ruolo di HER2 nel carcinoma mammario L evoluzione delle tecniche diagnostiche strumentali e le conoscenze più approfondite sulla storia naturale e biomolecolare del carcinoma mammario hanno modificato radicalmente l approccio terapeutico alla neoplasia mammaria, favorendo una strategia personalizzata delle cure. A riguardo, l individuazione di alcuni punti chiave molecolari, necessari alla cellula neoplastica per l acquisizione delle caratteristiche di malignità, ha evidenziato il ruolo primario svolto dalla superfamiglia HER/ EGFR, e in particolare dal c- erbb2/ HER2. Si tratta di recettori tirosin- chinasici in grado di trasferire gruppi fosforici da donatori ad alta energia, come l ATP, ad altre molecole. Sono enzimi a struttura monometrica: costituita da un domain transmembrana di pochi aminoacidi, un domain extracellulare N- terminale, destinato al legame con fattori di crescita e ormoni, ed un domain intracellulare C- terminale, responsabile dell attività chinasica propriamente detta Le vie del segnale indotte dal recettore HER2 non sono completamente note, ma l attivazione del meccanismo PI3K/ Akt è certamente cen- Diametro, istotipo, grado istologico, grado nucleare, neoangiogenesi sono i fattori morfologici del carcinoma mammario che guidano la valutazione prognostica 8

9 L iperespressione di HER2 è un fattore prognostico negativo e predittivo di risposta alla terapia trale, associato al segnale mitogenetico attraverso la via MAPK. Il gene HER2 è un proto- oncogene situato sul braccio lungo del cromosoma 17 (17q11.2-q12), che, una volta attivato, da origine ad una cascata di segnali intracellulari secondari, che comportano una spinta complessiva verso la proliferazione cellulare e la soppressione di meccanismi apoptotici. Dati in letteratura indicano che circa il 15-2% delle donne colpite da carcinoma della mammella hanno un carcinoma con amplificazione del gene che codifica per HER2, con conseguente sovraespressione del recettore. Questa situazione si associa ad una malattia aggressiva a prognosi infausta, con aumentato rischio di metastatizzazione a distanza. La caratteristica peculiare più importante è che l iperespressione di HER2 è un fattore predittivo di risposta alla terapia anti- HER2. Pertanto in quest ambito, un approccio terapeutico personalizzato implica due momenti fondamentali: ƒ la corretta identificazione dei bersagli molecolari; ƒ l utilizzo ottimale delle opportunità terapeutiche oggi disponibili. Trastuzumab è un anticorpo monoclonale umanizzato specifico per il recettore HER2; il suo legame al domain IV extracellulare del recettore arresta il ciclo cellulare in G1, verosimilmente bloccando la cascata PI3K. Si riconoscono al farmaco le seguenti azioni antitumorali: ƒ Il blocco dell HER- 2, impedendo processi molecolari orientati alla proliferazione cellulare; Malgrado i progressi in campo diagnostico abbiano permesso l identificazione di forme tumorali non palpabili <1 cm, non è ancora stata chiarita in modo definitivo la loro rilevanza prognostica Tipo istologico La neoplasia deve essere classificata in accordo al tipo istologico previsto da OMS % Diametro del tumore % % Parzialmente Disaccordo La dimensione del tumore è quella macroscopica, a meno che non venga indicata nel referto istologico una diversa dimensione microscopica In tumori con nodi multipli si misura e si stadia (T) il nodo di diametro maggiore; le dimensioni degli altri noduli vanno comunque riportate 1 98% Grado 2% % Il grado istologico deve essere valutato secondo i criteri di Elston & Ellis, ed applicato a tutti i carcinomi della mammella Per le agobiopsie, si suggerisce di utilizzare i sistemi di grading nucleare quando non è possibile valutare in modo adeguato il grado di Elston & Ellis % Stato linfonodale 4% Parzialmente % Disaccordo Lo stato linfonodale comprendente il numero di linfonodi esaminati e delle eventuali metastasi deve essere sempre riportato nel referto 1% % % Scelta del campione per la determinazione dei fattori prognostici predittivi La valutazione dei parametri biologici (assetto recettoriale, stato di HER2 e Ki67) deve essere effettuata anche sulle biopsie pre-operatorie se è prevista terapia neo-adiuvante e sulle biopsie di recidive e metastasi 99.3% % % 9

10 Il patologo dovrà garantire la massima accuratezza nell identificazione e nella misurazione della componente invasiva nei carcinomi mammari di piccole dimensioni (minori o uguali a cm. 1,), specificandone anche il diametro massimo istologico Scelta del campione per la determinazione dei fattori prognostico predittivi Nel caso di neoplasie, la determinazione dei parametri biologici va effettuata su tutte le lesione di diverso istotipo o grado % 3% 1% Parzialmente Disaccordo Determinazione sui carcinomi in situ fattori prognostici predittivi La determinazione dell assetto recettoriale (ER/PR) deve essere effettuata anche su neoplasie intraduttali % 2.1% 1.4% Determinazione dei recettori ormonali La valutazione dell assetto dei recettori ormonali deve essere espressa in valori percentuali indipendentemente dalla intensità di colorazione % 3% % Determinazione dell indice di proliferazione con Ki67 Ki67 va determinato in ogni carcinoma primitivo invasivo della mammella La valutazione della frazione di cellule proliferanti va espressa come percentuale di cellule positive per Ki67, indipendentemente dalla intensità di colorazione e deve essere effettuata alla periferia della neoplasia su più campi non selezionati % 1% Parzialmente % Disaccordo ƒ ƒ la citossicità anticorpo- mediata ( ADCC), con innesco della cascata della via del complemento o delle cellule immunocompetenti che riconoscono il frammento Fc degli anticorpi; una attività anti- angiogenetica. I maggiori studi in terapia adiuvante ( con oltre 14. pazienti) hanno documentato un vantaggio clinicamente significativo di trastuzumab in termini sia di sopravvivenza libera da malattia ( DFS) sia di sopravvivenza globale ( OS). Nel dettaglio, le analisi dei sottogruppi dello studio internazionale, multicentrico, randomizzato HERceptin Adjuvant ( HERA), dimostrano che la terapia adiuvante con trastuzumab è stata in grado di ridurre il rischio di recidiva del carcinoma, indipendentemente dallo stato linfonodale o recettoriale, e a prescindere dall età della paziente o dalle dimensioni del carcinoma. I tumori infracentimetrici Per ciò che concerne le dimensioni tumorali va sottolineato che grazie a campagne di diagnosi precoce, congiuntamente ad indagini strumentali più sensibili, si è incrementata la possibilità di identificare tumori spesso non palpabili con diametro inferiore al centimetro. Tuttavia, ancora oggi non si conosce la reale rilevanza che le dimensioni del carcinoma hanno ai fini prognostici e, ancor di più, alla terapia. E documentato che lo stato HER2 positivo rappresenta anche per i tumori di piccole dimensioni ( 1 cm o meno) un fattore prognostico indipendente negativo di rischio di ricaduta o di mortalità breast- cancer related: lo studio retrospettivo di coorte del gruppo del MD Anderson Center condotto su 965 pazienti con carcinoma mammario HER2 positivo, di dimensioni inferiori a 1 cm, ha riportato una percentuale di Lo stato di HER-positività anche nei tumori <1 cm è un fattore prognostico indipendente negativo di rischio di ricaduta o di mortalità carcinoma-correlata 1

11 Dagli statement emerge la necessità di valutare lo status di HER2 (oltre che degli altri parametri prognostico-predittivi) nei carcinomi mammari di piccole dimensioni limitatamente alla componente infiltrante, anche nei tumori microinvasivi recidiva a 5 anni del 23%, contro il 7% dei tumori HER2 negativi. Inoltre, i tumori HER2 positivi mostravano un rischio significativamente superiore, di oltre 5 volte, di andare incontro a recidive a 5 anni, rispetto ai tumori ormonosensibili. Sulla base di questi risultati, gli autori concludono che è necessario prendere in considerazione il trattamento in pazienti con tumori piccoli senza interessamento linfonodale, né metastasi a distanza - T1abNM- con terapia adiuvante e anti- HER2. Su un altra coorte di oltre 2 pazienti afferenti all Istituto Europeo di Oncologia, Curigliano et al riportano una prognosi peggiore per i tumori pt1an, HER2- positivi e ormonosensibili. Infine, un ulteriore conferma viene dalla revisione dei dati in letteratura svolta da Swain e presentata all ASCO 29: tumori HER2 positivi di qualunque dimensione- incluso l infracentimetrico- possono trarre vantaggio in termini di disease free suvival (DFS) dal trattamento con trastuzumab. DI conseguenza, è indicata la valutazione delle caratteristiche biologiche anche nei tumori di piccole dimensioni, ed è importante ricordare il contributo del patologo, che dovrà: ƒ garantire la massima accuratezza nella identificazione e nella misurazione della componente invasiva nei carcinomi mammari di piccole dimensioni (minori o uguali a cm. 1,), specificandone anche il diametro massimo istologico, ƒ valutare lo status di HER2 ( oltre che degli altri parametri prognostico- predittivi) nei carcinomi di piccole dimensioni limitatamente alla componente infiltrante, anche nei tumori microinvasivi. Tutte le pazienti con tumori HER2-positivi di qualsiasi dimensione trattate con trastuzumab mostrano un aumento della sopravvivenza libera da malattia Determinazione di HER2 L iperespressione/amplificazione di HER2 deve essere valutata in ogni carcinoma invasivo mammario primitivo all atto della prima diagnosi o della recidiva % Amplificazione genica % Parzialmente Tumori HER2+ di piccole dimensioni prognosi e terapie % Disaccordo La presenza di iperespressione/amplificazione di HER2 è associata a prognosi peggiore anche nei tumori T1 di piccole dimensioni (pt1a-b) pno Il trattamento adiuvante con Trastuzumab potrebbe essere efficace anche in pazienti con tumore mammario HER2-positivo di dimensioni pari od inferiori ad 1 cm Identificazione e misurazione componente infiltrante Il patologo deve garantire la massima accuratezza nella identificazione e nella misurazione della componente invasiva nei carcinomi mammari di piccole dimensioni (minori o uguali a cm. 1,), specificandone anche il diametro massimo istologico La valutazione dello status di HER2 (oltre che degli altri parametri prognostico-predittivi) nei carcinomi di piccole dimensioni deve essere limitata alla componente infiltrante, anche nei tumori microinvasivi % Nei casi con dubbia iperespressione di HER2, la valutazione dell amplificazione del gene nei carcinomi di piccole dimensioni è facilitata dall impiego di reazioni di ibridazione in situ in campo chiaro (CISH/SISH) % % 2.8% %.68% % % 1.38% 11

12 Dalle Raccomandazioni AIOM-SIAPEC-IAP sui re e sull utilizzo di metodiche per la determinazione Requisiti minimi e standard di refertazione Campionamento della neoplasia Da ogni neoplasia della mammella si devono ottenere non meno di 3 inclusioni in paraffina se le dimensioni del carcinoma lo consentono. Stato dei margini Per la valutazione dei margini il campione va chinato. La valutazione dei margini va eseguita macroscopicamente con conferma istologica del margine più vicino, indicando la distanza in mm. Nel caso di infiltrazione visibile solo istologicamente si deve riportare se la medesima è focale o estesa (>1 di campo a 4x). Focolai multipli Il termine multicentrico o multifocale deve essere sostituito con il termine multiplo. Tumori multipli nettamente separati da parenchima normale vanno campionati con le stesse modalità utilizzate per le neoplasie singole. Focolai multipli di invasione insorti su un carcinoma duttale in situ vanno considerati come lesione singola. Refertazione Il referto deve includere tutti gli 8 parametri prognostico/predittivi identificati dal Consenso di St. Gallen. L inclusione nel referto di parametri aggiuntivi non è attualmente raccomandata. Parametri San Gallen ƒ Tipo istologico (sec. WHO 23) ƒ Diametro del carcinoma ƒ Grado ƒ Invasione vascolare ƒ Stato linfonodale ƒ Assetto recettori ormonali ƒ HER2 ƒ Ki67. Diametro del carcinoma La dimensione del carcinoma è quella macroscopica, a meno che non venga indicata nel referto istologico una diversa dimensione microscopica. In tumori con nodi multipli si misura e si stadia ( T) il nodo di diametro maggiore; le dimensioni degli altri nodi vanno comunque riportate. Il patologo deve garantire la massima accuratezza nella identificazione e nella misurazione della componente invasiva nei carcinomi mammari di piccole dimensioni ( minori o uguali a cm. 1, ), specificandone anche il diametro massimo istologico. La presenza di iperespressione/ amplificazione di HER2 è associata a prognosi peggiore anche nei tumori T1 di piccole dimensioni ( pt1a- b) pn; il trattamento adiuvante con target therapy potrebbe essere efficace anche in pazienti con carcinoma mammario HER2- positivo di dimensioni pari od inferiori ad 1 cm. La valutazione dello stato di HER2 (oltre che degli altri parametri prognostico-predittivi) nei carcinomi di piccole dimensioni, anche microinvasivi, deve essere limitata alla componente infiltrante. La valutazione dell amplificazione del gene nei carcinomi di piccole dimensioni è facilitata dall impiego di reazioni di ibridazione in situ in campo chiaro ( CISH/ SISH). Grado Il grado istologico deve essere valutato secondo i criteri di Elston & Ellis, ed applicato a tutti i carcinomi della mammella. Per le agobiopsie, si suggerisce di utilizzare i sistemi di grading nucleare quando non è possibile valutare in modo adeguato il grado di Elston & Ellis. Invasione vascolare La presenza o meno di invasione vascolare per i t u m o r a l e d e ve e s s e r e i n d i c a ta, e d e fi n i ta estesa, se identificata in 2 o più inclusioni della stessa neoplasia. Tipo istologico La neoplasia deve essere classificata in accordo al tipo istologico previsto da OMS. Diagnosi su linfonodo sentinella E opportuno indicare il protocollo utilizzato per la valutazione del linfonodo sentinella. 12

13 quisiti minimi e gli standard di refertazione dello stato di HER2 nel carcinoma mammario La diagnosi morfologica su linfonodo sentinella deve essere riportata secondo la definizione TNM. Stato linfonodale Lo stato linfonodale, comprendente il numero di linfonodi esaminati e delle eventuali metastasi, deve essere sempre riportato nel referto. Stadiazione TNM La stadiazione TNM deve essere sempre riportata. Referto del carcinoma in situ Nelle neoplasia in situ va indicato il tipo istologico, il grado nucleare, la presenza di necrosi comedonica e la relativa classificazione DIN/LIN Per la definizione dell estensione e dei margini il campione chirurgico va incluso in toto a meno di non disporre di studio radiologico del pezzo. Scelta del campione per la determinazione dei fattori prognostico predittivi E necessario che l inclusione scelta per la determinazione dei parametri biologici includa anche parenchima mammario non neoplastico in tutti i casi in cui ciò sia possibile. La valutazione dei parametri biologici (assetto recettoriale, stato di HER2 e Ki67) deve essere effettuata anche sulle biopsie pre-operatorie se è prevista terapia neo-adiuvante e sulle biopsie di recidive e metastasi. Nel caso di neoplasie multiple, la determinazione dei parametri biologici va effettuata su tutte le lesioni solo se di diverso istotipo o grado. Determinazione sulle neoplasie in situ fattori prognostico predittivi La determinazione dell assetto recettoriale (ER/PR) deve essere effettuata anche sulle neoplasie intraduttali. Determinazione dei recettori ormonali Il referto deve riportare il clone utilizzato per la determinazione immunocitochimica dei recettori. La valutazione dell assetto dei recettori ormonali deve essere espressa in valori percentuali indipendentemente dalla intensità di colorazione. La valutazione dell assetto recettoriale deve corrispondere alla espressione media di recettori dell intera sezione esaminata. Il controllo positivo interno deve mostrare una colorazione eterogenea delle cellule luminali normali, con cellule non colorate accanto a cellule debolmente colorate e a cellule intensamente colorate. Una colorazione limitata a poche cellule e di uguale intensità può essere dovuta ad una scarsa sensibilità della reazione. Le cellule mioepiteliali e le cellule stromali rappresentano un utile controllo negativo interno: una loro colorazione, per quanto debole, è segno di aspecificità della reazione. Determinazione dell indice di proliferazione (Ki67) Ki67 va determinato in ogni carcinoma primitivo invasivo della mammella. La valutazione della frazione di cellule proliferanti dovrebbe essere espressa come percentuale di cellule positive per Ki67 indipendentemente dalla intensità di colorazione e deve essere effettuata alla periferia della neoplasia su più campi non selezionati. Determinazione di HER2 L iperespressione/amplificazione di HER2 deve essere valutata in ogni carcinoma invasivo mammario primitivo all atto della prima diagnosi o della recidiva (per le metodiche vedi sotto). Integrazione dei parametri morfologici e biologici Il patologo è responsabile della congruità dei parametri diagnostici, prognostici e predittivi. Controlli di qualità E fortemente raccomandata la partecipazione a programmi di controllo esterno della qualità (VEQ) per la determinazione di ER, PR, HER2 e Ki67. Integrazione nei nomenclatori/tariffari E necessario il riconoscimento della determinazione dei parametri biologici nel nomenclatore/tariffario. 13

14 Le metodiche di rilevazione Immunoistochimica nella determinazione dello stato di HER2 Quando e su quali campioni effettuare il test La determinazione dello stato di HER2 deve essere effettuata sempre al momento della diagnosi sul tumore primario infiltrante Modalità e tempi di fissazione dei campioni tessutali 1 I campioni tessutali da sottoporre a valutazione dello stato di HER2 devono essere fissati in formalina neutra tamponata al 1%, a meno che l uso di fissativi alternativi sia stato validato presso l istituzione stessa % % % In disaccordo Non so Quando e su quali campioni effettuare il test In presenza di progressione di malattia la determinazione va effettuata sulla lesione metastatica, se disponibile, o sul tumore primario se non precedentemente effettuata secondo gli attuali standard % % % In disaccordo Non so Quando e su quali campioni effettuare il test Qualora siano disponibili solo preparati citologici non inclusi, si raccomanda l utilizzo di ibridazione in situ come metodo di determinazione % 2% 2% In disaccordo Non so 97% 2% 1% D'accordo In disaccordo Non so Lo stato di HER2 rappresenta un importante fattore prognostico e predittivo del carcinoma mammario. E ampiamente accettato che l immunoistochimica (IIC) sia la metodica di screening di primo livello di tutti i nuovi tumori mammari: il grado di affidabilità della tecnica dipende però da numerosi fattori legati alle modalità di preparazione ed analisi dei campioni, all interpretazione dei risultati, nonché alle procedure di refertazione e ai controlli di qualità sui test eseguiti. Inoltre, in presenza di malattia metastatica, è preferibile valutare lo stato di HER2 nella sede di recidiva, a causa della possibile discordanza, stimata intorno al 1-2%, fra carcinoma primario e metastasi. Per contro, su campioni citologici non inclusi la tecnica non permette una adeguata valutazione, e pertanto viene raccomandata la tecnica di ibridazione in situ. Di seguito, sono riportati alcuni punti fermi relativi alla metodica IIC: ƒ L IIC è stata validata su campioni tessutali fissati in formalina neutra tamponata al 1%; ƒ Fissativi diversi (in particolare su base alcolica) vanno validati; ƒ E obbligo di ogni laboratorio organizzare modalità di trasporto e consegna del campione per consentire un adeguata e rapida fissazione/conservazione; ƒ Il campione va fissato per almeno 6 ore e per un massimo di 48 ore; ƒ E preferibile utilizzare kit standardizzati di anticorpi anti-her2 poli o monoclonali referenziati per aumentare la riproducibilità tra laboratori; Punteggi IIC 3+ indicano pazienti con alta probabilità di risposta a trastuzumab, mentre score di e 1+ sono considerati negativi 14

15 L immunoistochimica è la metodica più comunemente utilizzata come valutazione di primo livello. Le metodiche ISH vengono prevalentemente utilizzate per l accertamento dell eleggibilità alla terapia con trastuzumab nei casi con immunoreattività 2+, e/o quando richiesto dal curante nell appropriato contesto clinico ƒ I risultati della tecnica IIC vanno validati utilizzando controlli interni, quali ghiandole mammarie normali; la rilevazione, in queste ultime, di reattività più che minimale, deve fare considerare la possibilità di falsi positivi e indurre a rivedere la tecnica; ƒ Per ovviare alle variazione di immunoreattività in distinte aree neoplastiche, va esaminata l intera neoplasia presente sulla sezione istologica, escludendo aree più periferiche o con artefatti morfologici; ƒ La refertazione deve essere il più possibile chiara, concisa e priva di ambiguità: viene comunemente utilizzato uno scoring system (,1+,2+,3+), che tiene conto della percentuale di cellule positive e della completezza e intensità della colorazione di membrana; ƒ Il controllo di qualità inter e intra- laboratorio è un dovere del servizio di istocitopatologia; ƒ L omogeneità e la riproducibilità della metodica va validata ri-testando una parte dei casi con tecniche di ibridazione molecolare. L importanza di HER2 come marcatore predittivo di riposta al trastuzumab è ormai un dato consolidato: punteggi 3+ indicano pazienti con alta probabilità di risposta all anticorpo monoclonale, mentre score di e 1+ vengono considerati negativi. Le tecniche di ibridazione in situ: FISH/CISH/SISH Le tecniche di ibridazione in situ sono analisi di citogenetica molecolare per la rilevazione di specifiche anomalie cromosomiche. Versatilità, applicabilità e riproducibilità delle metodiche hanno favorito un aumento della loro diffusione in questi ultimi anni, soprattutto in ambito oncologico. Al momento, la FISH è la tecnica di elezione per la ricerca di un numero crescente di aberrazioni cromosomiche e/o alterazioni geniche, con Modalità e tempi di fissazione dei campioni tessutali 1 Il tempo di fissazione ottimale in formalina neutra tamponata è compreso fra le 6 h e le 48 h, in relazione alla tipologia del campione % % % D'accordo In disaccordo Non so Scoring System Si raccomanda di esprimere lo stato di HER2 mediante uno scoring system (, 1+, 2+, 3+ secondo FDA e/o linee guida ASCO/CAP) e con la valutazione descrittiva che tenga conto della percentuale di cellule positive e della completezza Correlazioni dei test IIC vs FISH E opportuno che ciascun laboratorio provveda a validare una quota parte della casistica valutata in IIC con ibridazione in situ, ottenendo una concordanza non inferiore al 9% nei casi % 95% 9% Parzialmente % Non so 5% % In disaccordo Non so L espressione di HER2 1 nel carcinoma primitivo è stata correlata ad una riduzione significativa della PFS, della DFS e della OS, soprattutto nelle pazienti ormono-responsive 15

16 La FISH viene considerata principalmente come metodica di valutazione di II livello, in accordo con le linee guida internazionali e nazionali, da utilizzare dopo l immunoistochimica, per dirimere quei casi in cui la determinazione IIC abbia fornito risultati equivoci (IIC 2+) o per contribuire a risolvere quesiti clinici specifici FISH/CISH/SISH: quando utilizzarle Lo studio dell amplificazione genica di HER2 nel carcinoma della mammella mediante tecniche di ibridazione in situ fluorescente o in campo chiaro è utilizzato come indagine di secondo livello successivo alla valutazione con immunoistochimica % 9% Parzialmente FISH/CISH/SISH: quando utilizzarle % Disaccordo La FISH/CISH/SISH va eseguita su tutti i casi 2+ (o equivoci secondo le linee guida ASCO/CAP) all analisi immunoistochimica o su richiesta del medico curante % 1% 2% FISH/CISH/SISH: su quali campioni eseguirle FISH/CISH/SISH possono essere efficacemente impiegati su preparati istologici fissati in formalina neutra tamponata FISH/CISH rappresentano la metodica di elezione per preparati citologici (convenzionali o in monostrato) di lesioni metastatiche Non vi sono ancora procedure standardizzate per la SISH su preparati citologici % 2% 5% FISH/CISH/SISH: il cromosoma 17 Per la FISH è raccomandabile l uso di kit che includano una sonda centromerica (dual color). Per CISH/SISH, è raccomandabile la valutazione del cromosoma 17 con sonda centromerica su sezioni consecutive % 1% 2% numerose applicazioni diagnostiche. La standardizzazione delle procedure con questa tecnica non è compiutamente definita, a causa di limiti propriamente strumentali/tecnici e per possibili difficoltà nell interpretazione dei risultati: Dowsett et al hanno riscontrato in un proficiency program svolto in 5 laboratori di riferimento una discordanza di lettura dello status di HER2 alla FISH dell ordine del 2%. In occasione delle passate consensus furono poste le basi per una maggiore accuratezza e riproducibilità della rilevazione di HER2 utilizzando metodiche di ibridazione in situ cromogeniche, come CISH e SISH. La FISH viene considerata principalmente come metodica di valutazione di II livello, in accordo con le linee guida internazionali e nazionali, da utilizzare dopo l immunoistochimica, per dirimere quei casi in cui la determinazione IIC abbia fornito risultati equivoci (IIC 2+) o per contribuire a risolvere quesiti clinici specifici. L'impiego di tecniche di ibridazione in situ è, comunque, possibile anche per la valutazione di primo livello dello stato di HER 2 nel carcinoma della mammella. L adozione di tecniche dual color, che utilizzano due fluoro cromi o due cromogeni diversi per visualizzare sullo stesso preparato istologico o citologico la regione centromerica del cromosoma 17 (sonda CEP 17) ed il numero di copie del gene HER2 (sonda locus-specifica), deve essere privilegiata. La valutazione, deve essere fatta su almeno 2 cellule neoplastiche e in almeno due campi diversi della componente invasiva, per rendere ragione dell eterogeneità tumorale; ƒ deve comprendere il rapporto tra segnali del gene HER2/segnali centromerici del cromosoma 17, è definito come amplificato un rapporto >2/nucleo; ƒ nel caso di un rapporto tra 1,8 e 2,2, considerato equivoco dalle linee guida CAP/ASCO, va ripetuta la reazione su altri campioni o la lettura, che può essere fatta dallo stesso o affidata a un secondo osservatore; 16

17 L introduzione di CISH e SISH ha permesso di ovviare ad alcune problemtiche tecniche della FISH, garantendo una migliore correlazione tra aspetti morfologici e risultato della reazione ƒ va segnalata la percentuale di cellule neoplastiche in cui il gene HER2 risulta amplificato, nonché il valore di cut-off applicato per lo score finale. La FISH, pur restando la tecnica di riferimento per la predittività di risposta al trattamento con trastuzumab, presenta alcune criticità: necessità di attrezzature costose, specifiche e dedicate; perizia del lettore; impossibilità di conservazione a lungo termine dei preparati per decadimento del fluorocromo; mancanza di dettaglio morfologico che non consente un confronto con IIC. Per ovviare ad alcune di queste problematiche, sono state introdotte la CISH e la SISH, metodiche di ibridazione in situ in campo chiaro, che prevedono, quindi, l utilizzo del comune microscopio ottico, garantendo una migliore correlazione tra aspetti morfologici e risultato della reazione. 8 9 FISH: l interpretazione dei risultati Si raccomanda di valutare non meno di 2 cellule/campo in almeno 2 campi della componente invasiva identificata sulla sezione in E/E I preparati citologici vanno esaminati interamente % FISH: l eterogeneità tumorale 1% 1% E opportuno esaminare il preparato allestito con la FISH sulla base della reattività dell IIC In caso di popolazione neoplastica eterogenea è opportuno riportare la percentuale di cellule in cui il gene risulta amplificato % L ibridazione in situ cromogenica ( CISH) è la metodica di elezione per preparati citologici o in monostrato di lesioni metastatiche. Rappresenta una valida alternativa alla FISH, con livelli di concordanza riportati in letteratura superiori al 95%. La valutazione dello stato di HER2 va effettuata solo sulla compone nte infiltrante della neoplasia mammaria. Il segnale è sotto forma di precipati puntiformi o aggregati di cromogeno; la sezione va esaminata dapprima ad ingrandimento relativamente basso per valutare la omogeneità o meno della distribuzione dei segnali. Quando si utilizzino tecniche con una sola sonda specifica per il gene HER2, è accertata l amplificazione del gene quando si contano >6 segnali/nucleo o grandi cluster, mentre è considerata negativa quando i segnali sono <4/nucleo. Nei casi dubbi, 4-6 segnali/nucleo, si raccomanda di verificare anche il numero dei centromeri del cromosoma 17, per escludere casi di polisomia. Se si utilizzano tecniche di dual-color, con una sonda specifica per il gene HER2 ed una per il centromero del cromosoma 17, la valutazione della eventuale amplificazione genica viene effettuata applicando gli stessi criteri della FISH (rapporto tra gene e centromero maggiore o uguale a 2) % % FISH: l interpretazione dei risultati Lo stato del gene si valuta tramite il rapporto tra le copie di geni HER2 e i segnali centromerici del cromosoma 17 Un rapporto >2,2 dimostra amplificazione del gene E necessario anche riportare la media dei segnali CEP17 per fornire indicazioni sulla polisomia % 1% % La CISH, metodica di elezione per preparati citologici di lesioni metastatiche, è una valida alternativa alla FISH, con una concordanza superiore al 95% 17

18 Se si utilizzano le tecniche di dual-color, la valutazione dell eventuale amplificazione genica si effettua applicando gli stessi criteri che vengono utilizzati con la FISH FISH: il referto finale Nel referto finale si deve indicare se il tumore è amplificato o non amplificato. Non è necessario riportare la ratio % 4% 2% FISH: l interpretazione dei risultati Nei casi con rapporto gene/cromosoma 17 compreso tra 1,8-2,2, la conta dovrebbe essere ripetuta dallo stesso o da un secondo osservatore. In alternativa la reazione dovrebbe essere effettuata su altre sezioni o, se disponibile, su una diversa inclusione della neoplasia % 4% 3% Parzialmente Disaccordo CISH/SISH: l interpretazione dei risultati Si deve esaminare tutta la sezione a 2X Nel caso in cui si rilevi omogeneità di segnale, selezionare almeno 2 campi della neoplasia infiltrante e valutarli ad alto ingrandimento evitando le aree periferiche della sezione I preparati citologici vanno esaminati interamente % 2% 5% CISH/SISH: l interpretazione dei risultati In caso di sicura amplificazione (>1 segnali o clusters) o non amplificazione (1-4 segnali), l analisi può essere effettuata a 4x In presenza di un numero di segnali compreso tra 5 e 1 è opportuno proseguire l analisi a maggior ingrandimento (63x o 1x) contando almeno 4 cellule % 8% Parzialmente % Disaccordo Tecniche metallografiche, distinte in autometallografia a base di oro (Nanogold with gold enhancement in situ hybridization: GOLDFISH) o metallografia enzimatica a base di argento (SISH). In questa ultima metodica, il precipitato puntiforme d argento - a bordo uniforme e arrotondato identifica ogni copia del gene o del centromero del cromosoma 17; il precipitato nero contrasta nettamente con la colorazione standard con ematossilina. Copie multiple vengono evidenziate come punti multipli o cluster (gruppi di segnali di forma irregolare). La concordanza totale con la FISH dual color è riportata dell ordine del 96 %, con discrepanze legate essenzialmente all eterogeneità delle aree tumorali. Analogamente alla CISH, la SISH permette il calcolo del rapporto tra copie del gene e del cromosoma 17 sullo stesso preparato solo se vengono utilizzate tecniche dual-color. La concordanza delle due metodiche con la FISH è superiore al 95%, utilizzando lo scoring system CAP/ASCO. La polisomia del cromosoma 17. Sulla base delle linee guida FDA e, più recentemente, delle raccomandazioni CAP/ ASCO, l amplificazione del gene HER2, quando si utilizzino tecniche dual color, viene indicata dal rapporto 2 o >2.2 tra numero di copie del gene HER2 e i segnali del centromero del cromosoma 17 (CEP 17); i tumori con un aumento del numero di segnali sia per il gene HER2 sia per il CEP 17, ma con ratio <2 (<1.8 per ASCO/CAP) sono considerati polisomici. La polisomia 17, definita come presenza di 3 o più copie del centromero 17, in assenza di amplificazione genica può essere associata ad una intensità di colorazione all IIC di 2+, e più raramente a 3+: solo i casi polisomici con iperespressione del- Secondo lo scoring system CAP/ASCO, la concordanza tra le due metodiche CISH/SISH con la FISH è superiore al 95% 18

19 Poichè solo i casi polisomici IIC 3+ sono eleggibili alla targeted therapy, bisogna verificare l incidenza di polisomia 17 in assenza di amplificazione genica e il meccanismo dell aumento dei segnali CEP17 la proteina (IIC 3+) sono eleggibili per il trattamento con targeted therapy. Diventa, quindi, prioritario verificare: ƒ la reale incidenza di polisomia 17 in assenza di amplificazione genica, ƒ il meccanismo biologico responsabile dell aumento dei segnali CEP 17, ƒ il valore biologico e clinico da attribuire alla polisomia 17. La reale incidenza di casi polisomici è dibattuta: i dati in letteratura oscillano tra il 4 ed il 3%, in funzione dei criteri utilizzati per la diagnosi. Le linee guida ASCO/CAP definiscono la polisomia come la presenza di 3 segnali CEP 17 per cellula, mentre l NCCTG definisce polisomici i casi con almeno 3 copie CEP 17 per cellula in 3% dei nuclei contati. Recentemente Marchiò C. et al, utilizzando la tecnica microarray- based comparative genomic hybridization (acgh) hanno suggerito che la polisomia vera potrebbe essere un evento molto raro: nello studio solo il 5.5% delle polisomie individuate con la FISH è stato confermato alla acgh. Infatti, quanto inizialmente definito polisomico con la FISH dual color ha corrisposto piuttosto ad un aumento (gain) o ad un amplificazione della sola zona del centromero, e non ad un vero aumento del numero dei cromosomi 17. Il 2% delle pazienti di questo studio con carcinoma considerato polisomico alla FISH, con ratio HER2:CEP17<2, mostravano in realtà amplificazione del gene HER2 alla acgh, ed erano quindi eleggibili ad un trattamento con trastuzumab. Questo dato, confermato poi da altri studi analoghi, potrebbe in parte spiegare alcuni report apparentemente sorprendenti di pazienti con neoplasie HER2 negative/equivoche, che hanno comunque risposto al trattamento con trastuzumab. In conclusione, è verosimile che i casi di carcinoma della mammella con vera polisomia del cromosoma 17 siano estremamente rari, e sia pertanto opportuno considerare amplificati i casi con >6 segnali di HER2 per cellula, indipendentemente dal numero dei segnali del centromero 17, anche in virtù del potenziale beneficio clinico ottenibile con trastuzumab in queste pazienti. FISH/CISH/SISH: la polisomia del cromosoma 17 Il tumore è considerato polisomico quando la media delle copie del centromero 17 è 3 L eventuale presenza di polisomia va segnalata in assenza di amplificazione genica La polisomia del cromosoma 17 Il rapporto > 2 dimostra amplificazione del gene per i casi disomici % 6.11% Parzialmente La polisomia del cromosoma % Disaccordo La vera polisomia del cromosoma 17 è un evento molto raro La presenza di un numero di segnali >2 del centromero del 17 è quasi sempre causata da gain o da amplificazione di tale regione e non da polisomia In questi casi è necessario evitare sottostime della amplificazione di HER2 dimostrata dalla presenza di >6 copie o clusters Il referto deve includere la dizione non amplificato o amplificato e la sua spiegazione (ratio>2 per i casi disomici o >6 copie o cluster di HER2) % 99.33% 2% Parzialmente.67% % Di recente, è emerso che la vera polisomia può essere un evento molto raro: vanno considerati amplificati tutti i casi con >6 segnali per cellula 8% Disaccordo 19

20 Alcuni tumori mammari appaiono eterogenei per caratteristiche morfologiche e genetiche e possono causare discrepanze di risultato tra metodiche di IIC e FISH: in questi casi vanno ancora definite prognosi ed eleggibilità della terapia con trastuzumab 5 5 Cloni focali con amplificazione del gene HER2 Non è raro il riscontro di eterogeneità nella iperespressione/ amplificazione di HER2 nei tumori mammari Se la frazione di cellule positive infiltranti è pari o inferiore al 1%, la paziente non è candidata al trattamento con trastuzumab (risultato negativo per FDA/EMEA/AIFA; equivoco per ASCO/CAP) Prima di escludere la paziente dal possibile beneficio del trattamento è necessario che lo stato di HER2 venga accuratamente rivalutato con ulteriori colorazioni immunoistochimiche e/o con tecniche di ibridazione in situ % Cloni focali: il campione.79% % Quando si sia evidenziata iperespressione/amplificazione in <1% cellule in una inclusione è raccomandato di testare ulteriori inclusioni della neoplasia primaria e/o delle eventuali metastasi linfonodali Cloni focali amplificati: la rivalutazione Tutti i tumori con quota di cellule neoplastiche HER2 3+IIC pari o inferiore al 1% devono essere ritestati con tecniche di ibridazione in situ Tutti i tumori valutati in prima istanza con ISH e con quota di cellule neoplastiche amplificate pari o inferiore al 1% devono essere ritestati con tecniche di IIC % 9.37% 5.22% 1.49% 8.15% Parzialmente 1.48% Disaccordo Di recente è emerso il beneficio della terapia con trastuzumab anche nei casi eterogenei con amplificazione focale Cloni focali con amplificazione del gene HER2 Malgrado i tentativi di uniformare ed aumentare l accuratezza della rilevazione dello status di HER2, alcuni tumori mammari appaiono eterogenei, sia per quanto riguarda la morfologia che le caratteristiche genetiche, e possono causare discrepanze di risultato tra metodiche di IIC e FISH. L eterogeneità genetica, rilevata all immunoistochimica, viene distinta in focale, quando localizzata in cloni definiti di cellule HER2 positive, o diffusa, quando vi sono area 3+ positive frammiste ad aree 2+ o negative. Le raccomandazioni ASCO/CAP definiscono eterogeneo, utilizzando tecniche di ibridazione in situ, un carcinoma che presenti amplificazione del gene in più del 5%, ma in meno del 5% delle cellule neoplastiche infiltranti, con una ratio >2.2. Sulla base di questa definizione l incidenza di eterogeneità intratumorale varia dal 5 al 3%, evidenziando una ampia soggettività di interpretazione. Questa eterogeneità intratumorale può essere responsabile della diversità nell amplificazione del gene o iperespressione del recettore HER2 tra carcinoma primario e metastasi, che si evidenzia in circa il 14% dei casi. Oggi, è sconosciuto l impatto che l eterogeneità genetica può avere sulla storia naturale della neoplasia mammaria e sulle scelte terapeutiche, generando, quindi, diversi quesiti: ƒ La prognosi è diversa rispetto ai tumori con omogeneità genetica? ƒ I tumori eterogenei traggono comunque beneficio da trattamenti con agenti anti-her2? ƒ In presenza di recettori ormonali negativi, vanno considerati tumori triple-negative? A queste domande non esistono ancora risposte definitive, tuttavia va tenuto presente che le pazienti con tumori che non hanno >1% di cellule HER2 positive (3+) all IIC o un rapporto uguale o superiore a 2 alle tecniche di ibridazione in situ non sono candidata al trattamento con trastuzumab. Il risultato è infatti ritenuto negativo per FDA/EMEA/AIFA, e considerato equivoco per le raccomandazioni ASCO/CAP. 2