Mitogen-stimulated DAT: a new method for the diagnosis of AIHA

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1 Mitogen-stimulated DAT: a new method for the diagnosis of AIHA Wilma Barcellini, Anna Zaninoni, Francesca Guia Imperiali, Alberto Zanella IRCCS, Department of Haematology, Ospedale Maggiore Policlinico, Milano Background. Direct antiglobulin test (DAT), the hallmark of autoimmune haemolytic anaemia (AIHA), can be performed with different laboratory techniques, which have variable sensitivity and/or specificity. In a minority of patients, named DAT-negative AIHA, the diagnosis is made in exclusion. We recently described a new method for the detection of anti-rbc antibodies in mitogenstimulated whole blood cultures, named mitogenstimulated-dat (MS-DAT). Aim. To investigate the prevalence of MS-DAT positivity in a larger series of DAT-positive and DATnegative AIHA at different states of disease activity, and in B-CLL with or without DAT-positive AIHA. Materials and methods. We studied 33 DAT-positive AIHA with different disease activity, 7 DAT-negative AIHA, and 69 B-CLL patients. MS-DAT was performed by stimulating whole blood cultures with mitogens, and anti-rbc antibodies were detected by competitive solid phase ELISA. Standard DAT was performed with tube test, in solid phase and with enhancing solutions. Results. MS-DAT was positive in 6 DAT-negative patients with a history of DAT-positive AIHA, who were in clinical and laboratory remission at the moment of the study, and in 7 DAT-negative haemolytic anaemias, diagnosed as autoimmune in exclusion. MS-DAT was positive in 1/3 of the B-CLL patients without haemolytic features. MS-DAT was routinely performed during the follow-up of AIHA patients, and its values correlated with the clinical course, haemolytic parameters and response to therapy. Received: 24 June Accepted: 28 July 2003 Correspondence: Dott.ssa Wilma Barcellini Dipartimento di Ematologia, Padiglione Granelli Ospedale Maggiore di Milano Via Francesco Sforza Milano - ITALY Introduzione Le malattie emolitiche autoimmuni (MEA) comprendono un gruppo eterogeneo di condizioni morbose caratterizzate dalla presenza di autoanticorpi diretti contro antigeni eritrocitari e da un quadro clinico di emolisi variabile nella sua gravità. Le MEA vengono distinte in forme da autoanticorpi "caldi" o "freddi" in base alle loro proprietà termiche e in forme "primitive" (idiopatiche) o "secondarie" ad altre malattie. Il cardine diagnostico delle MEA è rappresentato dalla positività del test dell'antiglobulina diretto (TAD), mediante il quale si evidenziano anticorpi (IgG) o frazioni del complemento (in genere, C3d) sulla superficie eritrocitaria 1. La maggioranza dei pazienti affetti da MEA presenta una TAD-positività. Tuttavia, in una piccola percentuale di casi, il TAD può essere debolmente positivo nonostante l'emolisi sia imponente: in alcuni di questi pazienti gli autoanticorpi possono essere presenti nel siero, sebbene le emazie non siano saturate con anticorpi 2. Ci sono, inoltre, casi di MEA nei quali non si riesce a dimostrare, utilizzando le metodiche standard, la presenza di autoanticorpi adesi alle emazie 3-7. In questi ultimi casi, viene posta la diagnosi di MEA TAD-negativa dopo esclusione di altre cause di emolisi e in base alla risposta clinica alla terapia steroidea. Esistono numerose tecniche di laboratorio per individuare anticorpi antieritrocitari. La classica agglutinazione è relativamente poco sensibile, dal momento che i reagenti in commercio preparati per l'uso routinario danno risposte positive quando un minimo di anticorpi sono adesi alla superficie di un singolo globulo rosso 8. Altre tecniche più sensibili del TAD, quali il test di consumo del complemento da parte di anticorpi 6,9, vari test immunoradiometrici, ELISA o citofluorometrici e il test 127

2 W Barcellini et al. Conclusions. In the test described here mitogen stimulation seems able to disclose a latent anti-rbc autoimmunity, both in AIHA in clinical remission and in B-CLL. MS-DAT could be proposed as an additional test for the diagnosis and monitoring of AIHA, and for the screening of those pathological conditions in which anti- RBC autoimmunity is known to be potentially harmful. Key words: AIHA, B-CLL, autoimmunity, mitogenstimulated DAT Introduction Autoimmune haemolytic anaemias (AIHA) are a heterogeneous group of disorders characterised by the presence of auto-antibodies directed against red cell surface antigens, and by a variable clinical picture and severity of haemolysis. AIHA can be distinguished in "warm" and "cold" based on the thermal properties of the antibody, and in "primary" (idiopathic) and "secondary" to underlying disease. The hallmark of AIHA is a positive direct antiglobulin test (DAT), by which IgG and/or complement (C3d) are found on the red blood cell (RBC) surface 1. The vast majority of patients with AIHA present a positive DAT. However, in a minority of patients with AIHA the DAT may be weakly positive in spite of fairly severe haemolysis in the patient. In some of these patients unbound auto-antibody may be present in the serum although the patients' red cells are clearly not saturated with antibodies 2. Moreover there are now many well documented cases of patients with the disease in whom no red cell-bound auto-antibody could be demonstrated by standard procedures 3-7. In these patients, the diagnosis of DAT negative AIHA is made on the basis of the exclusion of other causes of haemolysis and of the clinical response to steroid therapy. There are many laboratory techniques to detect anti- RBC antibodies. The traditional agglutination technique is relative insensitive, since commercially available reagents prepared for routine use usually yield a positive reaction when a minimum of antibodies attach to the surface of each erythrocyte 8. More sensitive DAT techniques, such as the complement-fixing antibody consumption test 6,9, various immunoradiometric ELISA and cytofluorimetric assays and the solid phase antiglobulin test 15 have been reported to give positive results in some patients with negative conventional DAT. However since all the methods available could give 128 dell'antiglobulina in fase solida 15, si sono dimostrate positive in alcuni pazienti affetti da MEA TAD-negativa con i tradizionali test. Pertanto, si raccomanda di utilizzare per la diagnosi di MEA una batteria di esami piuttosto che un singolo test, dal momento che tutte le metodiche a disposizione possono dare risposte falsamente positive o falsamente negative 16. Recentemente abbiamo descritto un nuovo metodo per la ricerca di anticorpi antieritrocitari, basato sulla stimolazione con mitogeni di colture di sangue intero e denominato MS-DAT (Mitogen Stimulated-Direct Antiglobulin Test). Il test si è dimostrato in grado di rilevare nelle MEA la modulazione della produzione anticorpale da parte delle citochine ed è risultato positivo in alcuni casi di MEA TAD-negative in remissione clinica, probabilmente perché la stimolazione con mitogeni induce una produzione anticorpale in vitro 17. Abbiamo inoltre valutato, mediante MS-DAT, la produzione in vitro di anticorpi antieritrocitari in pazienti affetti da leucemia linfatica cronica a cellule B (B-LLC), malattia nella quale si riscontra frequentemente una MEA 18. MS-DAT si è dimostrato positivo non soltanto nei casi evidenti di MEA ma anche in una frazione di pazienti con B-LLC senza anemia emolitica, suggerendo l'esistenza di forme latenti di autoimmunità antieritrocitaria in corso di B-LLC, che potrebbero essere evidenziate utilizzando la stimolazione in vitro con mitogeni 19. Lo scopo di questo lavoro è di indagare l'incidenza di MS-DAT positività in un maggior numero di MEA sia TADpositive che TAD-negative in fase diversa di attività clinica nonché in pazienti affetti da B-LLC con o senza MEA TADpositiva. Inoltre, è stato investigato il significato del test, eseguendolo routinariamente durante il monitoraggio clinico dei pazienti affetti da MEA e correlando i risultati con il decorso clinico, i parametri emolitici e la risposta alla terapia. Materiali e metodi TAD, ricerca e identificazione degli anticorpi Il TAD in provetta è stato eseguito secondo la tecnica standard, impiegando sieri antiglobuline poli e monospecifici. Si sono utilizzati reagenti monoclonali del commercio (anti-igg+c, anti-igg, anti-c3d e anti-c3c), sieri di coniglio anti-iga umane e sieri di capra anti-igm umane, forniti dall'ortho-clinical Diagnostics (Raritan, NJ, USA), dalla Bioscot Ltd (Edimburgo, Scozia) e dalla Gamma Biologicals Inc (Houston, TX, USA). I risultati vengono

3 MS-DAT: new method for AIHA false-positive and false-negative results, a battery of tests rather than a single test is recommended for the diagnosis of AIHA 16. We recently described a new method for the detection of anti-rbc antibodies in mitogen-stimulated whole blood cultures, named mitogen-stimulated-dat (MS-DAT). The test was suitable for revealing cytokine modulation of anti- RBC antibody production in AIHA, and was positive in a small number of DAT-negative AIHA in clinical remission, probably because mitogen stimulation induced antibody production in vitro 17. Furthermore, we investigated by MS-DAT the in vitro production of anti-rbc antibodies in B-Chronic Lymphocytic Leukaemia (B-CLL), a disease in which AIHA is frequently observed 18. MS-DAT was positive not only in overt AIHA, but also in a fraction of B-CLL patients without haemolytic anaemia, suggesting the existence of a latent anti-rbc autoimmunity in B-CLL, that could be disclosed by in vitro mitogen stimulation 19. The aim of this paper was to investigate the prevalence of MS-DAT positivity in a larger series of DAT-positive and DAT-negative AIHA at different states of disease activity, and in B-CLL with or without DAT-positive AIHA. Furthermore the significance of MS-DAT was investigated by routinely performing the test during the follow-up of AIHA patients, and relating it to the clinical course, haemolytic parameters and response to therapy. Materials and methods DAT and antibody screening and identification Tube-DAT was performed according to the standard techniques using both polyspecific and monospecific sera. Commercial monoclonal reagents (anti-igg+c, anti- IgG, anti-c3d, and anti-c3c), rabbit anti-human IgA and sheep anti-human IgM from Ortho (Raritan, NJ, USA), Bioscot (Edinburgh, UK) and Gamma (Houston, TX, USA) were used. The results expressed as titre and score by testing two-fold dilutions 20. The cassette-dat was carried out with monospecific antisera only, following the manufacturer's instructions. Cassettes (BioVue Ortho) with anti-igg, anti-c and negative control were used for cassettes-dat. Antibody screening and identification in serum, eluates, and culture supernatants were performed using the indirect antiglobulin test in tube (eluate or culture espressi in titolo e in score valutando le diluizioni per raddoppio 20. Il TAD su schedina è stato effettuato soltanto con sieri monospecifici seguendo le istruzioni dei produttori. Si sono impiegate schedine (BioVue Ortho) con anti-igg, anti-c e controllo negativo. L'individuazione e l'identificazione degli anticorpi sono state condotte su sieri, eluati e supernatanti di colture, impiegando il test delle antiglobuline indiretto in provetta (eluati e supernatanti) o in schedina (sieri) utilizzando antiglobuline polispecifiche. Per l'individuazione e l'identificazione degli anticorpi su eluati, supernatanti e sieri si sono utilizzate soluzioni facilitanti-rinforzanti (PEG Gamma e Bliss Ortho). Le reazioni positive sono state registrate utilizzando una scala da 0,5+ a Per lo screening e l'identificazione degli anticorpi si sono impiegati un pannello a tre cellule (Surgiscreen Ortho) e due a 11 (Ortho e Gamma), rispettivamente. Test dell'antiglobulina diretto stimolato con mitogeni (MS-DAT) MS-DAT è stato condotto come descritto in precedenza 15,17. Brevemente, campioni di sangue fresco eparinato sono stati diluiti (1:6) con RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) e posti in coltura senza stimolo o stimolati con 2 µg/ml di fitoemoagglutinina (PHA), 20 ng/ml di Phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA, Sigma-Aldrich Chemicals, St Louis, MO, USA) o 1% di fitolacca americana (PWM, Gibco) in piastre a 24 pozzetti e incubati per 48 h. La quantità di IgG adese alla superficie eritrocitaria è stata misurata con un test immunoenzimatico competitivo in fase solida, come descritto di seguito. Abbiamo rivestito con 50 µl di IgG umane (Sclavo, Siena, Italia), diluite alla concentrazione di 50 µg/ml in tampone carbonato-bicarbonato a ph 9, piastre a 96 pozzetti (Falcon 3912, Becton Dickinson, Oxnard, CA, USA), incubando per una notte a +4 C. Dopo tre lavaggi con fisiologica tamponata (PBS) contenente 0,2% di siero fetale bovino (FCS, Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA), in ciascun pozzetto sono stati seminati 200 µl di 2% FCS-PBS per 2 ore a temperatura ambiente, al fine di saturare i legami aspecifici; infine, le piastre sono state lavate 3 volte con 0,2%FCS-PBS. È stata costruita una curva standard con emazie O CcDee, ottenute da un solo donatore, e sensibilizzate con diluizioni seriali di anticorpi anti-d (Immuno AG, Vienna, Austria), come descritto precedentemente 17. Cento µl sia dei campioni che degli standard sono stati incubati, a 37 C per 30', con un eguale volume di IgG anti-uomo da coniglio coniugate con perossidasi (Dako, Glostrup, Danimarca), diluite 129

4 W Barcellini et al. supernatant) or in cassettes (serum) with polyspecific anti-human globulin reagents. Enhancement solutions (PEG Gamma and Bliss Ortho) were used for screening and identification of antibodies in eluates, culture supernatants and serum, respectively. Positive results were recorded on a scale from 0.5+ to A 3-cell RBC panel (Surgiscreen Ortho) and two 11-cell RBC panels (Ortho and Gamma) were used for serum antibody screening and identification, respectively. Mitogen-stimulated DAT Mitogen-stimulated DAT was performed as already described 15,17. Briefly, fresh heparinized blood samples were diluted 1:6 with RPMI 1640 medium (Gibco, Grand Island, NY, USA) and either unstimulated or stimulated with 2 µg/ml phytohaemoagglutinin (PHA) and 20 ng/ ml Phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) (Sigma- Aldrich Chemicals, St. Louis, MO, USA), or 1% pokeweed (PWM) (Gibco) in 24 well-plates and incubated for 48 hr. The quantitation of IgG bound to the surface of RBC was evaluated with a competitive solid-phase enzyme immunoassay. Briefly, 96 well-plates (Falcon 3912, Becton Dickinson, Oxnard, CA, USA) were coated with 50 µl of human IgG (Sclavo, Siena, Italy) diluted at the concentration of 50 µg/ml in carbonate-bicarbonate buffer, ph 9.00, and incubated overnight at +4 C. After washing three times with PBS containing 0.2% fetal calf serum (FCS, Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA), plates were blocked with 200 µl of 2% FCS-PBS for 2 hr at room temperature, and finally washed 3 times with PBS-0.2% FCS. A standard curve was constructed with group O CcDee RBC, obtained from a single blood donor, sensitised with serial dilutions of anti-d antibody (Immuno AG, Vienna, Austria) as previously described 17. One hundred µl of both samples and standards were incubated with an equal volume of peroxidaseconjugated rabbit anti-human IgG (Dako, Glostrup, Denmark) diluted 1:3,000 in 0.2% FCS-PBS at 37 C for 30 min. One-hundred µl of this mixture were added to the IgG-coated plates in triplicate wells, and incubated at +37 C for 30 min. The plate was then washed five times with PBS containing 0.2% FCS and 0.05% Tween 20 (Merck, Darmstadt, Germany). Fifty µl of o-phenylenediamin dihydrochloride (Sigma-Aldrich Chemicals, St. Louis, MO, USA) at a concentration of 0.5 mg/ml in 10-1 M 1:3.000 in 0,2%FCS-PBS. Le piastre venivano poi lavate 5 volte con PBS contenente 0,2% di FCS e 0,05% di Tween 20 (Merck, Darmstadt, Germania). A ciascun pozzetto sono stati poi aggiunti 50µL di una soluzione di ortofenilendiamina diidrocloride (Sigma-Aldrich Chemicals, St Louis, MO, USA) alla concentrazione di 0,5 mg/ml in una soluzione tampone 10-1 M di acido citrico-citrato di sodio a ph 4,8-5,0; è seguita incubazione a temperatura ambiente. Dopo 15 minuti, è stata misurata la reazione colorimetrica a 450 nm, utilizzando uno spettrofotometro ELISA. Per la determinazione della presenza di anticorpi antieritrocitari sulle emazie autologhe poste in colture, le sospensioni cellulari sono state trattate come emazie O CcDee sensibilizzate con anticorpi anti-d, mentre per la determinazione della presenza di anticorpi antieritrocitari secreti, i supernatanti delle colture sono stati utilizzati per sensibilizzare emazie O CcDee. Abbiamo costruito una curva standard su scala logaritmica con i valori di densità ottica (OD) e della concentrazione degli anticorpi anti-d (ng/ml); facendo riferimento a questa curva, sono stati calcolati i valori delle IgG legate ad emazie autologhe o la concentrazione degli anticorpi antiemazie nei supernatanti delle colture. È da sottolineare che il controllo positivo TAD standard dava un valore di IgG adese di 327±23 ng/ml (media±es di 6 esperimenti indipendenti). Al fine di fissare un cut-off per i valori positivi di MS- DAT, sono state calcolate le medie di 81 colture stimolate con PHA, PMA e PWM di soggetti di controllo; la positività è stata definita come un valore che eccedesse la media più 3 DS (220 IgG ng/ml). Pazienti Sono stati esaminati i seguenti soggetti: 1) 33 pazienti affetti da MEA primitiva (idiopatica) con età media (±DS) di 50±12 anni, range 28-76, 20 femmine e 13 maschi e 2) 69 pazienti affetti da B-LLC, età media 68±11 anni, range 41-89, 25 femmine e 44 maschi, la cui diagnosi era stata posta seguendo i criteri clinici, morfologici e immunologici di Cheson et al. 21 e la cui stadiazione clinica era in accordo con le linee-guida proposte da Binet et al. 22. Inoltre, abbiamo studiato altri 7 pazienti, con diagnosi presuntiva di MEA TAD-negativa posta in base all'esclusione di altre cause di emolisi e alla risposta clinica alla terapia con steroidi. Il test MS-DAT, insieme con la conta eritrocitaria e i parametri emolitici (reticolociti, LDH e aptoglobina) è stato eseguito ogni mese su 8 pazienti affetti da MEA, seguiti regolarmente in regime ambulatoriale dal nostro Dipartimento. 130

5 MS-DAT: new method for AIHA Table I - Effect of mitogen stimulation on in vitro autologous anti-rbc bound IgG in 48 hr whole blood cultures from patients and controls Unstimulated PHA PMA PWM AIHA Patients *** ** * ** B-CLL Patients ** *** ** *** Controls Values are expressed as IgG ng/ml, mean + SE of 33 AIHA and 69 B-CLL patients and 81 controls. * p<0.05, ** p<0.01 and ***p<0.001 citric acid-sodium citrate buffer ph , were added to each well and incubated at room temperature. The colorimetric reaction was measured at 450 nm after 15 min with ELISA spectrophotometer. For the determination of anti-rbc on autologous cultured RBC, cell suspensions were treated as anti-d-sensitised CcDee RBC, and for the determination of secreted anti- RBC, culture supernatants were used for sensitisation of CcDee RBC. Log/log plot was constructed with OD values and anti- D antibody concentration of the standard curve (ng/ml), and autologous anti-rbc bound IgG value or anti-rbc antibody concentration in culture supernatants were calculated referring to this standard curve. It should be noted that the positive control of standard DAT gave a RBC bound IgG value of ng/ml (mean + SE of 6 independent experiments). To determine a cut off for MS-DAT positive values, the mean of PHA-, PMA-, and PWM-stimulated cultures of 81 controls was calculated, and the positivity for MS- DAT defined as a value exceeding the mean plus 3 SD of controls (220 IgG ng/ml). Patients The following patients were investigated: 1) 33 primary (idiopathic) AIHA patients (mean age+sd years, range 28-76, 20 female and 13 male), 2) 69 B-CLL patients (mean age+sd years, range 41-89, 25 female and 44 male), diagnosed according to defined clinical, morphological and immunological criteria 21, and staged according to the guidelines proposed by Binet et al. 22. Moreover, we investigated 7 additional patients, tentatively diagnosed as DAT-negative AIHA on the basis of the exclusion of other causes of haemolysis and of the clinical response to steroid therapy. MS-DAT, together with blood counts and haemolytic parameters (reticulocytosis, LDH, and haptoglobin), was performed monthly in 8 AIHA patients, regularly followed at the outpatient Department. Risultati MS-DAT in pazienti affetti da MEA o B-LLC In tabella I è riportata la quantità di IgG adese alle emazie autologhe, in colture di sangue intero non stimolate e dopo stimolazione con mitogeni, in pazienti affetti da MEA o B- LLC. Il valore delle IgG adese alle emazie autologhe era significativamente aumentato nei pazienti rispetto ai controlli sia in colture non stimolate (p 0,001) che dopo stimolazione con PHA (p 0,01), PMA (p 0,05) o PWM (p=0,01). Inoltre, nei pazienti, la stimolazione con mitogeni aumentava in modo significativo il valore delle IgG legate alle emazie autologhe, se paragonato a quello di colture non stimolate (p=0,01), mentre non si riscontrava alcun effetto nei controlli. Egualmente, i valori delle IgG antieritrocitarie erano significativamente più alti nei pazienti affetti da B-LLC, rispetto ai controlli, in tutte le condizioni sperimentali indagate (p 0,01 per le colture non stimolate, p=0,001 per le colture stimolate con PHA e PWM e p=0,01 per le colture stimolate con PMA). Come già riscontrato nelle MEA, la stimolazione con mitogeni aumentava, in maniera significativa, il valore delle IgG antieritrocitarie in pazienti affetti da B-LLC (p=0,001 e p 0,05, rispettivamente per stimolazioni con PHA e con PWM). Abbiamo quindi valutato l'incidenza della positività di MS-DAT, definita come valore che eccedeva il cut-off di 220 ng/ml di IgG; tale valore risultava dalla media più 3 DS dei valori di IgG adese in colture stimolate con PHA, PMA e PWM dei controlli. La positività di MS-DAT è stata confrontata con la positività dei TAD eseguiti con tecniche standard. Sia TAD standard che MS-DAT sono risultati positivi in 27 MEA a diverso stato di attività della malattia (dati non mostrati). MS-DAT è risultato positivo in 6 pazienti con TAD negativo ma con una storia di MEA TAD-positiva, che erano in remissione al momento dello studio (Tabella II, pazienti 1-6). Infine, abbiamo individuato altri 7 pazienti, nei quali era stata posta una diagnosi presuntiva di MEA TAD-negativa, dopo esclusione di altre cause di emolisi e sulla base della risposta clinica alla terapia steroidea. Questi pazienti hanno mostrato una chiara positività di MS-DAT 131

6 W Barcellini et al. Table II - Clinical and laboratory characteristics of DAT-negative, MS-DAT positive AIHA patients Patient N Gender Hb Total Reticulocytes Haptoglobin LDH Steroid DAT* MS-DAT g/dl bilirubin % mg/l U/L therapy IgG ng/ml (unconjugated) µmol/l 1 F (5) 1.4 1, yes neg F (12) 0.8 2, yes neg F (7) 0.7 1, no neg M (9) 1.8 1, no neg M (8) yes neg M (8) no neg M (22) no neg F (22) no neg M (18) no neg 1, F (19) no neg 1, M 8.8 n.d yes neg M (27) no neg F (8) no neg 314 Normal range female (0-12) <2% 600-3, male * DAT was performed with standard tube test, in solid phase and with enhancing solutions Results MS-DAT in AIHA and B-CLL patients. The amount of IgG bound to autologous RBC both in resting conditions and after mitogen stimulation of whole blood culture from AIHA and B-CLL patients is shown in Table I. The amount of autologous RBCbound IgG value was significantly increased in patients versus controls in unstimulated cultures (p 0.001) and in the presence of PHA (p<0.01), PMA (p<0.05), and PWM (p=0.01). Moreover, in patients mitogen stimulation significantly increased autologous RBC-bound IgG value compared to unstimulated cultures (p=0.01), whereas it had no effect in controls. Similarly, anti-rbc IgG values were significantly higher in B-CLL patients compared with controls in all the experimental conditions tested (p<0.01 for unstimulated cultures, p<0.001 for PHA- and PWMstimulated cultures, p=0.01 for PMA-stimulated cultures). As found in AIHA, mitogen stimulation significantly increased anti-rbc IgG value in B-CLL patients (p=0.001, and p<0.05 for PHA and PWM, respectively). We then evaluated the prevalence of MS-DAT positivity, defined as the mean of IgG bound value of PHA-, PMA- and PWM-stimulated cultures exceeding the cut-off value of 220 IgG ng/ml, resulting from the (Tabella II, pazienti 7-13). MS-DAT è risultato positivo in 20 su 69 pazienti affetti da B-LLC (10 in stadio A, 4 in stadio B e 6 in stadio C), con un'incidenza del 28,9% (dati non mostrati). Al momento dello studio, il TAD standard è risultato positivo in 3 pazienti con B-LLC (stadio C), affetti da anemia emolitica (incidenza del 4,3%). MS-DAT nel follow-up di MEA MS-DAT è stato eseguito in 6 pazienti affetti da MEA, regolarmente seguiti dal nostro dipartimento ambulatoriale. Il test veniva eseguito sistematicamente a ogni controllo, insieme a un esame emocromocitometrico e a una valutazione dei parametri di emolisi. La figura 1 mostra due casi tipici. Il primo caso (riquadro sinistro) riguardava un paziente di 70 anni affetto da una forma tipica di MEA da autoanticorpi caldi con esordio acuto, sottoposto successivamente a trattamento con steroidi. La terapia ha determinato un progressivo aumento dei valori di Hb (da 5,8 a 15,3 g/dl in 7 mesi), la normalizzazione dei valori di aptoglobina (da 200 a mg/l) e la diminuzione dei valori di MS-DAT (da a 374 ng/ml). Il secondo caso (riquadro destro) si riferiva a una paziente di 50 anni, con MEA in remissione clinica (Hb 13,6 g/dl), in terapia con basse dosi di steroidi. Durante il follow-up, la paziente ha avuto una ricaduta della forma emolitica, con riduzione dei valori di Hb (da 13,6 a 10 g/dl) e aptoglobina (da 590 a 200 mg/l). È interessante notare che MS-DAT ha mostrato un aumento di positività che precedeva il peggioramento clinico (da 41 a 176 IgG ng/ml) e una chiara positività al 132

7 MS-DAT: new method for AIHA Figure 1 - MS-DAT in the clinical follow up of AIHA. Levels of Hb ( ), Haptoglobin ( ), and MS-DAT ( ) are expressed as percentage of the values at the beginning of the follow-up. For the first patient (left panel) these values were: Hb=5.8 g/dl, Haptoglobin=200 mg/l, MS-DAT=4,121 IgG ng/ml. For the second patient (right panel) these values were: Hb=13.6 g/ dl, Haptoglobin=590 mg/l, MS-DAT=41 IgG ng/ml mean plus 3 SD of controls. MS-DAT positivity was compared with standard DAT-tube positivity. Both the standard DAT and MS-DAT were positive in 27 AIHA at varying degree of clinical activity (data not shown). MS-DAT was positive in 6 DAT-negative patients with a history of DAT-positive AIHA, who were in clinical and laboratory remission at the moment of the study (Table II, patients 1-6). Finally, we studied 7 additional patients, tentatively diagnosed as DAT-negative AIHA on the basis of the exclusion of other causes of haemolysis and of the clinical response to steroid therapy. These patients showed a clear-cut positive MS-DAT (Table II, patients 7-13). MS-DAT was positive in 20 out of 69 B-CLL patients (10 in stage A, 4 in stage B, 6 stage C), corresponding to a prevalence of 28.9% (data not shown). Standard DAT tube was positive at the time of the study in 3 stage C B-CLL patients, suffering from haemolytic anaemia, with a prevalence of 4.3%. momento dell'anemia manifesta (355 e 528 IgG ng/ml). La modesta ricaduta emolitica è stata controllata prontamente dalla terapia steroidea, che ha determinato una normalizzazione dei livelli di emoglobina (da 10 a 13,4 g/dl) e aptoglobina (da 200 a 430 mg/l) e una diminuzione dei valori di MS-DAT (da 528 a 166 IgG ng/ml). Discussione I risultati descritti in questo lavoro dimostrano che MS- DAT è positivo in pazienti con anamnesi di MEA, che erano in fase di remissione clinica e laboratoristica al momento dello studio e divenuti TAD negativi. Dato ancor più interessante, MS-DAT è risultato positivo in pazienti nei quali è stata posta una diagnosi presuntiva di MEA, sulla base dell'esclusione di altre possibili cause di emolisi e della risposta alla terapia steroidea. Per di più, MS-DAT si è dimostrato positivo in un terzo di pazienti affetti da B- LLC, con TAD negativo e senza segni clinici di emolisi, confermando precedenti risultati 19. I valori assoluti di IgG 133

8 W Barcellini et al. MS-DAT in the clinical follow up of AIHA MS-DAT was performed in 6 AIHA regularly followed at the out-patient department. The test was performed at each medical examination, together with blood counts and haemolytic parameters. Two typical cases are shown in Figure 1. The first case (left panel) was a 70 years old man with an acute onset of typical warm AIHA, subsequently treated with steroid. The therapy induced a progressive increase of haemoglobin levels (from 5.8 to 15.3 g/dl in 7 months), normalisation of the haptoglobin levels (from 200 to 1,370 mg/l), together with a decrease of MS-DAT values (from 4,121 to 374 IgG ng/ml). The second case (right panel) was a 50 years old woman with AIHA in clinical remission (Hb 13.6 g/dl) on low-dose steroid therapy. During the follow-up a haemolytic relapse occurred, with decrease of haemoglobin (from 13.6 to 10 g/dl) and haptoglobin (from 590 to 200 mg/l) levels. Interestingly, MS-DAT showed an increased positivity which preceded the clinical worsening (from 41 to 176 IgG ng/ml) and was clearly positive at the time of overt anaemia (355 and 528 IgG ng/ml). The mild haemolytic relapse was promptly controlled by steroid therapy which induced a normalisation of haemoglobin (from 10 to 13.4 g/dl) and haptoglobin (from 200 to 430 mg/l) levels and a decrease of MS- DAT values (from 528 to 166 IgG ng/ml). Discussion Results presented in this paper showed that MS- DAT was positive in DAT-negative patients with a history of AIHA, who were in clinical and laboratory remission and, more interestingly, in patients tentatively diagnosed as DAT-negative AIHA on the basis of exclusion of other causes of haemolysis and of the clinical response to steroid therapy. Moreover, MS-DAT was positive in 1/3 of DAT-negative B-CLL patients without haemolytic features, confirming previous findings 19. Absolute values of IgG bound to RBC are greater in mitogen-stimulated cultures, as compared to unstimulated ones, both in AIHA and in B-CLL patients 17,19. On the contrary, mitogen stimulation has no effect adese alle emazie sono maggiori nelle colture di sangue intero stimolate con mitogeni se paragonati a quelli rilevabili in colture non stimolate, sia nei pazienti affetti da MEA che in quelli affetti da B-LLC 17,19. Al contrario, la stimolazione con mitogeni non ha alcun effetto nei controlli, dove non vi sono linfociti B potenzialmente autoreattivi, così da essere stimolati in vitro a produrre anticorpi antieritrocitari. Nel loro insieme, questi risultati indicano che la stimolazione con mitogeni sembra essere in grado di svelare un'autoimmunità antieritrocitaria latente, sia nella MEA in remissione clinica che nella B-LLC. Questo dato potrebbe essere utile per continuare il monitoraggio clinico e laboratoristico dei pazienti con MEA in remissione e per programmare un follow-up più intensivo nei pazienti B-LLC, soprattutto in quelli in trattamento con fludarabina Tuttavia, per accertare il valore predittivo del test, si rende necessario un controllo clinico a distanza di tempo dei pazienti affetti da B-LLC con MS-DAT positivo. Abbiamo, inoltre, individuato 7 pazienti con diagnosi di MEA TADnegativa, presuntivamente posta sulla base dell'esclusione di altre cause di emolisi: tale diagnosi è stata confermata dalla positività di MS-DAT. È noto che tutti i metodi a disposizione per la diagnosi di MEA possono dare risultati falsamente negativi e che è necessario disporre di una batteria di test, piuttosto che di un singolo tipo di esame 2,10,16. Di conseguenza, MS-DAT potrebbe essere proposto come test supplementare per la diagnosi di MEA. La negatività del TAD eseguito con metodiche standard è spesso dovuta ad numero esiguo di molecole immunoglobuliniche presenti sulla superficie eritrocitaria 8. Così come si osserva nella MEA in remissione e nella B-LLC, la stimolazione con mitogeni può provocare, anche nelle forme di MEA TAD-negative, la produzione in vitro di anticorpi e la loro conseguente adesione alle emazie autologhe presenti nella coltura, determinando la positività del TAD. Infine, MS-DAT è stato eseguito routinariamente nel corso dei follow-up di pazienti affetti da MEA e i valori ottenuti sono risultati correlare con il decorso clinico, con i parametri emolitici e con la risposta alla terapia. Un dato di particolare interesse è che MS-DAT ha rivelato una aumentata positività che precedeva il peggioramento clinico, indicando, una volta di più, che la stimolazione con mitogeni è in grado di svelare una autoimmunità latente e agire da "cassa di risonanza" per l'individuazione di una risposta autoimmunitaria. Conclusioni Il test che abbiamo descritto in questo lavoro sembra in grado di evidenziare un'autoimmunità antieritrocitaria latente, sia in MEA in fase di remissione clinica sia in corso di B-LLC. 134

9 MS-DAT: new method for AIHA in controls, where no potentially auto-reactive B- lymphocytes exist, that could be stimulated in vitro to produce anti-rbc antibodies. Altogether these findings suggest that mitogen stimulation seems able to disclose a latent anti-rbc autoimmunity, both in AIHA in clinical remission and in B-CLL. In the former, this information could be useful to continue the clinical and laboratory monitoring of patients, and, in B-CLL, to plan more intensive follow-up, particularly in fludarabine-treated patients The clinical follow-up of these MS-DAT positive B-CLL patients is needed to ascertain the predictive value of MS-DAT positivity. Furthermore, we identified 7 patients in which the diagnosis of DAT-negative AIHA, previously made in exclusion, was confirmed by a positive MS-DAT. It is known that all the methods available could give falsenegative results, and that a battery of tests rather than a single test is recommended for the diagnosis 2,10,16. Therefore, MS-DAT could be proposed as an additional test for the diagnosis of AIHA. The negativity of DAT performed with standard procedures is often a problem of number of IgG molecules present on the surface of the RBC 8. As observed for AIHA in clinical remission and B-CLL, mitogen stimulation could induce also in DAT-negative AIHA antibody production in vitro and subsequent binding of antibodies to autologous RBC present in culture, determining the positivity of the DAT. Finally, MS-DAT was routinely performed during the follow-up of AIHA patients, showing that its values correlated with the clinical course, haemolytic parameters and response to therapy. Interestingly, MS- DAT showed an increased positivity, which preceded the clinical worsening, again indicating that mitogen stimulation could disclose a latent autoimmunity and perform as a "resonance box" for the detection of an autoimmune response. Conclusion In the test described here, mitogen stimulation seems able to disclose a latent anti-rbc autoimmunity, both in AIHA in clinical remission and in B-CLL. MS-DAT could be proposed as an additional test for the diagnosis and monitoring of AIHA, and for the screening of those pathological conditions in which anti-rbc autoimmunity is known to be potentially harmful. Di conseguenza, MS-DAT potrebbe essere proposto come un test aggiuntivo per la diagnosi e il monitoraggio di MEA e per lo screening di quelle condizioni patologiche nelle quali un'autoimmunità antieritrocitaria può divenire pericolosa. Riassunto Premessa. Il test dell'antiglobulina diretto (TAD), cardine diagnostico della malattia emolitica autoimmune (MEA), può essere eseguito con tecniche di laboratorio differenti, ognuna con sensibilità e/o specificità di vario grado. In una minoranza di casi, indicati come MEA TADnegative, la diagnosi viene posta per esclusione. Recentemente, abbiamo descritto una nuova metodica per l'individuazione di anticorpi antieritrocitari in colture di sangue intero stimolate con mitogeni, denominata MS- DAT (Mitogen-Stimulated-Direct Antiglobulin Test). Scopo. Investigare l'incidenza di positività di MS-DAT in un'ampia serie di MEA TAD-positive o negative a differente stato di attività della malattia e in pazienti affetti da leucemia linfatica cronica a cellule B (B-LLC) con o senza MEA TAD-positiva. Materiali e metodi. Abbiamo studiato 33 MEA TADpositive con malattia a diverso stato di attività, 7 MEA TADnegative e 69 pazienti affetti da B-LLC. MS-DAT è stato eseguito stimolando con mitogeni colture di sangue intero e sono stati rilevati anticorpi antieritrocitari utilizzando un test ELISA competitivo, in fase solida. Il TAD è stato effettuato anche con metodiche tradizionali, in provetta, in fase solida o utilizzando soluzioni facilitanti-rinforzanti. Risultati. MS-DAT è risultato positivo in 6 pazienti con MEA TAD-negativa, che avevano una storia clinica di MEA TAD-positiva e che erano in fase di remissione al momento dello studio; MS-DAT è risultato positivo in 7 pazienti con anemia emolitica TAD-negativa, diagnosticata come autoimmune per esclusione. Inoltre, MS-DAT è risultato positivo in un terzo dei pazienti affetti da B-LLC senza segni di emolisi. MS-DAT è stato routinariamente eseguito durante il monitoraggio clinico dei pazienti affetti da MEA e i valori correlavano con il decorso clinico della malattia, con i parametri emolitici e con la risposta alla terapia. Conclusioni. La stimolazione con mitogeni utilizzata in MS-DAT sembra in grado di svelare casi di autoimmunità antieritrocitaria latente sia in corso di MEA in remissione clinica che in corso di B-LLC. Il test può essere proposto come indagine supplementare per la diagnosi e il monitoraggio di MEA e per lo screening di quelle condizioni patologiche nelle quali l'autoimmunità antieritrocitaria può essere pericolosa. Parole chiave: MEA, B-LLC, autoimmunità, MS-DAT 135

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