Dal balsamo del Canada ai micro-arrays: sempre patologi?

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Pio Oliva
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1 Dal balsamo del Canada ai micro-arrays: sempre patologi? Corso Nazionale AITIC Per tecnici di laboratorio biomedico Riccione 24 maggio 2013 Dr. Filippo Crivelli U.O.C. Aziendale di Anatomia Patologica A.O. Ospedale di Circolo di Busto Arsizio

2 Da dove partiamo Gli obiettarono: Perché allora Mosè ha ordinato di darle l atto di ripudio e mandarla via?. Rispose loro Gesù: Per la durezza del vostro cuore Mosè vi ha permesso di ripudiare le vostre mogli, ma da principio non fu così. (Mt 19, 7-9)

3 Da dove partiamo Gli obiettarono: Perché allora Mosè ha ordinato di darle l atto di ripudio e mandarla via?. Rispose loro Gesù: Per la durezza del vostro cuore Mosè vi ha permesso di ripudiare le vostre mogli, ma da principio non fu così. (Mt 19, 7-9)

4 Da dove partiamo I patologi obiettarono: Perché allora ci è stato ordinato di interessarci di biologia molecolare? Risposero loro: Per la durezza del cuore degli oncologi che devono trattare i pazienti con farmaci sempre nuovi vi è stato chiesto di eseguire numerose valutazioni di biologia molecolare, ma da principio non fu così. (FC 34, 1-3)

5 Come era all inizio? Tre periodi (epoche) Epoca della morfologia Epoca della immunoistochimica Epoca della biologia molecolare

6 Come era all inizio? epoca della biologia molecolare epoca dell'immunoistochimica epoca della morfologia

7 EPOCA DELLA MORFOLOGIA

8 Epoca della morfologia

9 Epoca della morfologia

10 Epoca della morfologia

11 Epoca della morfologia

12 Epoca della morfologia

13 Epoca della morfologia

14 Epoca della morfologia

15 Epoca della morfologia

16 Epoca della morfologia

17 Epoca della morfologia

18 Epoca della morfologia

19 Epoca della morfologia

20 Epoca della morfologia

21 Epoca della morfologia Al patologo veniva chiesto di emettere una diagnosi attraverso il riconoscimento: del tessuto (componente cellulare), delle lesioni elementari (componente patologica), della malattia (sintesi diagnostica)

22 EPOCA DELLA IMMUNOISTOCHIMICA

23 Epoca della immunoistochimica L immunoistochimica è l identificazione di una componente tessutale in situ per mezzo di una reazione antigene-anticorpo resa visibile a livello microscopico Coons, 1941

24 Epoca della immunoistochimica L immunoistochimica riconosce un ruolo in: Biologia della cellula e dei tessuti Embriologia Diagnostica patologica caratterizzare neoplasie difficili o insolite riclassificare molte neoplasie creare nuove categorie tumorali definire meglio la prognosi e la terapia

25 Epoca della immunoistochimica

26 Epoca della immunoistochimica

27 Epoca della immunoistochimica CD56 Biopsia epatica di nodulo sospetto metastatico TTF-1 CD56 TTF-1

28 Epoca della immunoistochimica

29 Epoca della immunoistochimica CK7 CK7 CA125 CA125

30 Epoca della immunoistochimica

31 Epoca della immunoistochimica UN LAVORO MOLTO INTERESSANTE MARKERS OF ADENOCARCINOMA CHARACTERISTIC OF THE SITE OF ORIGIN:DEVELOPMENT OF A DIAGNOSTIC ALGORITHM. DENNIS Jle coll. CLIN CANCER RES. 2005,11,MAY15

32 IMMUNOISTOCHIMICA: % DI POSITIVITA DI OGNI MARKER P.SIT N. PSA TTF1 GCD CDX2 CK20 CK7 ER MES CA125 LYSO BREAST 35 OV.SIE 18 OV.MU 10 ENDO 10 PANCR 53 CA AMP 6 COLAN 10 STOM 34 ESOFAG

33 IMMUNOISTOCHIMICA: % DI POSITIVITA DI OGNI MARKER P.SIT N. PSA TTF1 GCD CDX2 CK20 CK7 ER MES CA125 LYSO COLON 47 PROSTA 18 LUNG 46 MESOT 6 CA REN 15 CA HEP

34 STUDIO SU 10 MARKERS SELEZIONATI PERCENTUALI DI SENSIBILITA E SPECIFICITA MARKER NEOPLASIA %SENSIBILITA %SPECIFICITA PSA PROSTATA TTF1 POLMONE CDX2 COLON CDX2 COLON STOMACO CK20 COLON CK20 COLON STO.PANCR GCDFP MAMMELLA ER MAMMELLA OVAIO CA125 OVAIO PANCREAS MESOTHELINA OVAIO PANCREAS LYSOZIMA STOMACO PANCR CK7 STO/PANC vs COLON 72 96

35 L ALBERO DECISIONALE PSA POS PROSTATA NEG TTF1 POS POLMONE NEG GCDFP POS CDX2+ COLON NEG CDX2- MAMMELLA CDX2/CK20 POS CK7+ STOMACO PANCREAS NEG CK7- COLON ER POS MESOTH.+ OVAIO NEG MESOTH - MAMMELLA CA125 POS PANCREAS NEG MESOTHELI POS STOMACO PANCREAS NEG LYSOZIME POS STOMACO PANCREAS NEG MAMMELLA STOMACO PANCREAS

36 UTILIZZANDO LE % DI POSITIVITA E L ALBERO DECISIONALE P.SITE N. PSA TTF1 GCDFP CDX2 CK20 CK7 ER MES CA125 LYS BREAST COLON LUNG OV.SIER OV.MUC PANCREAS STOMACO PROSTATA

37 Epoca della immunoistochimica

38 Epoca della immunoistochimica L immunoistochimica non elimina la morfologia ma la completa permettendo di riconoscere con approssimazione totale o parziale la provenienza istogenetica delle cellule che si stanno valutando permettendo una migliore valutazione dell istotipo. L utilizzo della immunoistochimica è imprescindibile dalla valutazione morfologica che rimane sempre il primo indicatore da considerare e sulle cui basi deve essere chiesta la valutazione immunoistochimica

39 Epoca della immunoistochimica Il patologo ha quindi a disposizione un ulteriore strumento per emettere una diagnosi: Morfologia del tessuto (componente cellulare), Linea di origine cellulare o presenza di marcatori specifici (istogenesi; tessuto di origine) Riconoscimento delle lesioni elementari (componente patologica), Malattia (sintesi diagnostica)

40 EPOCA DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE

41 Epoca della biologia molecolare MORFOLOGICO MOLECOLARE CELLULA NUCLEO GENE BASI CROMOSOMI CITOGENETICO

42 Approccio molecolare 5 3 Esone Introne Porzione regolatoria Ricerca di alterazioni molecolari della sequenza (mutazioni puntiformi, piccole inserzioni o delezioni, inversioni, duplicazioni di poche basi) Ricerca di grossolane alterazioni della sequenza (traslocazioni, grosse delezioni) Analisi del silenziamento genico tramite studio della metilazione del promotore

43 Approccio molecolare

44 Approccio molecolare MWG microarray E.Coli gene chip Ibridizzato con RNA di Coli marcato Cy3/Cy5

45 Epoca della biologia molecolare

48 Fase pre-analitica Fissazione La fissazione con formalina può danneggiare il DNA e introdurre mutazioni artificiali (e.g.: over-fixation) Il campionamento di una sufficiente quantità di tessuto è perciò critico su materiale fissato in formalina Le soluzioni con fissazione non formalinica sono anch esse problematiche Dettagli morfologici Qualità del DNA/RNA

50 Formalin fixation >6 - <48 hrs 4 micron thick sections

52 Maximize tumor cell DNA content

53 EGFR mutation testing Method Sensitivity Mutations Specific mutation Direct sequencing Sanger 30 Deep 5-10 Real-time PCR Known and new Known and new Scorpions ARMS 5 Known only No TaqMan PCR 10 Known only No Mutant enrich PCR PNA-LNA PCR clamp 1 Known only No Enzymatic digestion 0.2 Known only No Smart 0.1 Known only No Known and COLD-PCR 1-10 new Yes PCR-RFLP 5 Known only Yes Known and dhplc 1 new Yes Immunohistochemistry * Known only Yes * Biological sensitivity: 40-89% Yes Yes Adapted from Clin Cancer Res 2007; 13:

54 Tumor tissue optimization Cytology Extractive Mutation Analysis (i.e., direct sequencing, others) DNA Storage DNA enrichment EGFR KRAS BRAF HER2 Biopsy -Immunoistochemistry -(ALK, HER2, c-met) - FISH -(ALK, HER2, c-met)

55 Type of material, tumor sites and biomarkers EGFR KRAS BRAF HER2 Lung Colon/rectum melanoma gastric Cytology +++ rare - - Biopsy Surgery

56 Type of material & analytical method IHC FISH DNA RNA (i.e.egfr) (i.e. ALK) (i.e. EGFR/KRAS) Cytology ++ Cell block Stained slides do no compromise DNA quality Biopsy Surgery

57 Molecular Heterogeneity Per gentile concessione del Prof. Aldo Scarpa Università di Verona

58 Per gentile concessione del Prof. Aldo Scarpa Università di Verona

59 Epoca della biologia molecolare

60 Epoca della biologia molecolare

61 MORTE DEI PATOLOGI?

63 ANATOMIA PATOLOGICA

65 Il futuro è chiaro: La diagnosi di cancro, di malattia infiammatoria cronica e di malattia degenerativa rimane basata sul tessuto Le informazioni pre-biopsia devono permettere una miglior gestione del tessuto Le tecnologie per estrapolare dal tessuto un numero sempre maggiore d informazioni evolvono rapidamente Solo il patologo può riconoscere in un tessuto cosa e quanto può essere sottoposto a quale test Le informazioni estrapolate dai tessuti avranno un impatto sempre maggiore sulle scelte terapeutiche

66 Di conseguenza: Smettere di fare cose che non sono più utili Responsabilizzare le professionalità Incrementare le informazioni che possono essere estratte da tessuti mediante loro adeguata gestione (strategia della qualità e della quantità)

67 Grazie per la Vostra attenzione e pazienza

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