Tecniche di patologia molecolare finalizzate all'analisi di mutazioni

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1 Tecniche di patologia molecolare finalizzate all'analisi di mutazioni dei geni predittivi di risposta alla terapia oncologica Carmelo Lupo Casa di Cura La Maddalena Palermo

2 Test molecolari PREDITTIVI di risposta al farmaco Finalizzati alla ricerca di fattori molecolari predittivi di risposta a terapie biologiche mirate in oncologia (Target Therapies) nell'ambito della Medicina Oncologica Personalizzata. La positività o la negatività a tali test permette di: valutare l'appropriatezza di terapie biologiche in base alle caratteristiche di sensibilità o resistenza dei singoli tumori alle terapie evitare terapie inutili e inutili effetti tossici ai pazienti

3 Tecniche di patologia molecolare ONCOLOGIA MOLECULAR PATHOLOGY ANATOMIA PATOLOGICA

4 Predittivo

5 Perchè Same type of cancer Same type of treatment

6 Perchè

7 Perchè

8 HER2/neu 20-25% Carcinoma mammella Trastuzumab K-RAS N-RAS adenocarcinoma del colon Cetuximab/panitunumab EGFR 20-25% adk polmone Erlotinib Gefitinib BRAF V600E 50-60% Melanoma Vemurafenib ALK 3-5% adk polmone Crizotinib BRAF 1799 T>A V600E

9 Il carcinoma del colon e del retto

10 Il pathway RAS-RAF RAS BRAF Funzione biologica Crescita Cellulare Proliferazione Cellulare Differenziazione Cellulare MEK ERK

11 RAS-RAF signaling nelle cellule normali L attivazione della cascata RASRAF signaling accade attraverso steps sequenziali: Attivazione attraverso fattori di crescita Attivazione di RAS Attivazione di RAF Fosforilazione di MEK Fosforilazione di ERK Attivazione dei fattori di trascrizione Risultati Proliferazione cellulare Sopravvivenza cellulare

12 Mutazioni di RAS KRAS NRAS Esone 2 codone 12, 13 Esone 3 codone 59, 61 Esone 4 codone 117, 146

13 Il carcinoma del polmone

14 Lung cancer NSCLC Nature Medicine 18, (2012)

15 EGFR

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17 Meccanismi di resistenza ai TKI Resistenza primaria: Inserzioni esone 20 Mutazioni KRAS Resistenza acquisita (6-10 mesi dall inizio della terapia): T790M nel 50% dei pazienti Amplificazione di MET nel 20%

18 Mutazioni di K-ras Mutazioni di K-ras Presenti nel 15-30% degli adenocarcinomi Elevata incidenza nei forti fumatori Predittivi di scarsa risposta a inibitori TK Mutazioni di EGFR e K-ras sembrano essere mutualmente esclusive Ahrendt SA et al. Cancer 2001; 92: Kosaka T et al. Cancer Res 2004; 64: Eberhard DA et al. JCO 2005;23:

19 Inibitori TK di EGFR e stato molecolare Stato molecolare EGFR TK mutazioni: Fortemente predittive di risposta agli inibitori TK EGFR amplificazione (FISH): Probabilmente predittivo EGFR (IHC): Non predittivo KRAS mutazioni: Altamente predittive di scarsa risposta agli inibitori

20 Riarrangiamento del gene ALK

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23 In generale Mutazioni attivanti EGFR Non fumatori (50%) Donne Est Asia (50% vs 10%) Adenocarcinoma con pattern lepidico Adenocarcinoma papillare Adenocarcinoma micropapillare Non componente mucinosa ALK Non fumatori Pazienti più giovani 2-8% degli adenocarcinomi Pattern solido Carcinoma con componente a cellule ad anello con castone

24 Le mutazioni di EGFR, KRAS, EML4-ALK e BRAF sembrano essere mutalmente esclusive EGFR e KRAS sono attualmente valutati con metodiche molecolari di sequenziamento o PCR (mutazione specifica) EML4-ALK è valutata mediante FISH Non esistono test per predirre la risposta a terapie anti- VEGF

25 Il melanoma

26 Mutazione di BRAF Il DNA estratto per il test, viene estratto da campioni di tessuto di melanoma umano fissati in formalina e inclusi in paraffina. Detection: rilevare la presenza della mutazione V600E (T1799A). Con minore frequenza sono state osservate anche mutazioni dei dinucleotidi che interessano il codone 600 (V600K, V600R e V600D).

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28 Campioni per diagnosi Citologici Microistologici Resezioni chirurgiche

29 Fondamentale l'analisi del contesto in cui si opera

30 Requisiti Requisiti strutturali Requisiti culturali Requisiti comportamentali

31 Le fasi nella preparazione del tessuto tumorale 1 2 Scelta della sezione tumorale più rappresentativa del tumore Taglio sezioni 3 La dissezione manuale

32 Processo di preparazione dei campioni Prelievo bioptico/chirurgico Fissazione del tessuto Inclusione in paraffina Taglio sezioni del tessuto tramite microtomo Colorazione

33 Contestualizzare

34 Il ruolo dell anatomopatologo nel valutare: Dimensioni area tumorale (le biopsie hanno frequentemente materiale insufficiente) Percentuale di cellule tumorali nell area/sezione scelta Aree di necrosi Aree con caratteristiche istologiche diverse (grado, istotipo, infiltrazione)

35 Fissazione Gli scopi principali della fissazione sono: Preservare la morfologia cellulare e l architettura tissutale Permettere al campione di tollerare gli stress della processazione Mantenere un buon grado di reattività per le colorazioni tradizionali Preservare l integrità antigenica Mantenere le molecole antigeniche nella loro posizione originale

36 La formalina La fissazione con formalina determina legami crociati tra il liquido fissativo e gruppi attivi delle proteine, con mascheramento di molti siti antigenici.

37 Metodiche mutazionali disponibili Metodi di screening Sequenziamento Pirosequenziamento HRMA (high resolution melting analysis) SSCP Bersaglio Molecolare Scorpion Arms PNA/LNA clamp SNAPshot PCR mutant-enriched PCR PCR Real-Time Strip Assays BioChip film Array

38 Sequenziamento diretto del DNA

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41 Sequenziamento diretto I prodotti di due distinte PCR devono essere sequenziati in forward e reverse, in modo da ottenere un numero di 3-4 sequenze per campione. Il controllo qualitativo viene effettuato mediante assemblaggio delle sequenze con un software dedicato all analisi delle sequenze, lettura dell elettroferogramma e confronto con la sequenza wild type. I software per l analisi di sequenza devono essere impostati con livelli soglia piu bassi di quelli utilizzati per l analisi dei polimorfismi nel DNA della linea germinale.

42 Sequenziamento diretto Un campione può essere definito positivo per mutazione se questa è presente in almeno due diverse sequenze (una forward ed una reverse) ottenute da PCR indipendenti. Nel caso venga evidenziata una nuova mutazione (mai riportata precedentemente) o una mutazione rara (riportata 1-2 volte nei database internazionali) questa deve essere verificata in due ulteriori amplificati PCR. Ad intervalli di sequenze, deve essere sequenziato un DNA di controllo per verificare l assenza di contaminazioni e la qualità della procedura.

43 Pirosequenziamento

44 Pyrosequencing

45 Pirosequenziamento Il Pirosequenziamento è una tecnologia di sequenziamento mediante sintesi. La tecnica consente il monitoraggio in tempo reale della sintesi di DNA mediante il rilevamento della bioluminescenza prodotta al termine di una cascata di reazioni enzimatiche innescata dall incorporazione di un nucleotide. Vantaggi rispetto al sequenziamento standard: maggiore sensibilità (riportata tra il 5 ed il 10%) e possibilità di sequenziare frammenti piuttosto corti di DNA, superando in tal modo eventuali problematiche legate alla frammentazione del DNA.

46 Step 1 PCR Real Time workflow Quattro fasi di lavoro che possono essere concluse in <8 ore Step 2 (1) H&E Staining & Tumor Content Determination Macro dissect as per package insert DNA Sample Genomic DNA Preparation Kit DNA Isolation Quantification Step 4 Step 3 Automated / Standardized Reporting Automated Analysis cobas 4800 v2.0 PCR setup

47 BRAF V600 PCR Real-Time Sequenziamento DNA BRAF 1799 T>A V600E

48 Quantificazione Acidi Nucleici

49 I criteri per lavorare in sicurezza Laboratorio Accreditato Superamento controlli di Qualità AIOM SIAPEC/Europei Campioni Campione più rappresentativo Definire la % delle cellule tumorali Procedere alla macrodissezione se necessario Analisi Molecolare Scelta della metodologia/tecnologia Sensibilità Report Chiaro e completo di informazioni

50 Conclusioni Qualità di DNA (poco ma di buona qualità, non grandi quantità di DNA degradato inutilizzabili) Ricerchiamo mutazioni somatiche, concetto di idoneità tissutale Tutte le figure professionali coinvolte nel percorso diagnostico-terapeutico del paziente, devono lavorare in sinergia per un corretto management del materiale biologico La sommatoria di questi elementi condiziona fortemente la valutazione dell analisi mutazionale

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52 It is not the strongest of the species that survives, nor the most intelligent, but the ones most responsive to change

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