Analisi mutazionale di K-RAS metodiche a confronto

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1 Analisi mutazionale di K-RAS metodiche a confronto Aula Magna Villa Sironi Gallarate 16 ottobre Dott. Carmelo Lupo Coordinatore Tecnico Anatomia Patologica e Patologia Molecolare Oncologica

2 PERCHÉ K-RAS COSA CERCARE COME CERCARLO LA NOSTRA ESPERIENZA

3 Momento storico Oncologia: esigenze terapeutiche Target Therapy, Tailored Therapy Anatomia Patologica: evoluzione necessaria in tempi brevi, valutando... tecnologia/aggiornamento tecnologico risorse interne (personale, budget) appoggiarsi a strutture di riferimento

4 FLUSSO DI LAVORO Informazione MUT. WT ONCOLOGIA Anatomia Patologica Tessuto

5 Pathway K-RAS

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7 Utilizzo degli anticorpi monoclonali anti-egfr Meccanismo d'inibizione degli eventi mediati dall attivazione del gene K-Ras

8 7 mutazioni nei codoni 12 e 13 dell esone 2 del gene K-Ras Le mutazioni nel gene K-RAS sono puntiformi

9 Metodiche disponibili Sequenziamento Pirosequenziamento PCR Real-Time (allele specifica SCORPION-ARMS) Strip assays

10 Gruppo di lavoro AIOM - SIAPEC-IAP Protocollo per l analisi mutazionale del gene K-RAS

11 Tecniche molecolari per la detection delle mutazioni Sequenziamento Pirosequenziamento PCR Real -Time

12 Idoneità del materiale biologico La percentuale di cellule di carcinoma infiltrante nel tessuto da sottoporre all esame molecolare non deve essere inferiore al 70% Escludere: necrosi, tessuto normale... tutto ciò che comporterebbe un DILUIZIONE del DNA Tali caratteristiche, prima dell estrazione del DNA, devono essere valutate accuratamente dall'anatomopatologo che deve provvedere a selezionare le aree tumorali.

13 Dissezione tessutale e sezioni al microtomo A) MICRODISSEZIONE LASER B) MACRODISSEZIONE vantaggi: singole cellule neoplastiche svantaggi: costosa strumentazione Al microtomo: se ci sono le condizioni (no micro-biopsie) si raccolgono al microtomo 5 sezioni da 20 micron dell area prescelta e raccolte in un tubo Eppendorf.

14 ANALISI MUTAZIONALE TRAMITE SEQUENZIAMENTO DIRETTO CONOSCERE LA SEQUENZA DOVE E LOCALIZZATA LA MUTAZIONE DISEGNARE DEI PRIMER CHE AMPLIFICANO LA REGIONE IN ESAME METTERE A PUNTO PROTOCOLLO DI AMPLIFICAZIONE (Tm- MgCl 2 - specificità) PURIFICARE IL PRODOTTO DI PCR METTERE A PUNTO IL PROTOCOLLO DI SEQUENZIAMENTO PURIFICARE IL PRODOTTO DI SEQUENZA SEQUENZIARE

15 L estrazione e la conservazione del DNA Kit estrazione DNA commerciali: il DNA genomico verrà estratto da sezioni di tessuto incluso in paraffina secondo il protocollo standard (es: Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit) In genere sono basati sul principio della cromatografia, che hanno il vantaggio di accorciare notevolmente i tempi tecnici e di consentire, inoltre, una standardizzazione delle procedure. Fenolo-cloroformio: metodica classica che prevede la purificazione mediante precipitazione in alcool.

16 QUANTIZZAZIONE E CONTROLLO QUALITA DEL DNA ESTRATTO

17 Stima della CONCENTRAZIONE del DNA estratto tramite l utilizzo dello spettrofotometro Nanodrop Il NanoDrop è uno Spettrofotometro UV-Visibile ( nm di lunghezza d onda). Lo strumento ha un range di concentrazione compreso tra 2 e 3700 ng, ed capace di lavorare con microvolumi di campione (1ul).

18 1 elettroforesi: qualità del DNA estratto La qualità del DNA estratto è stata valutata tramite elettroforesi su gel d agarosio in presenza di bromuro di etidio (0.5μg/ml) e le bande visualizzate mediante illuminazione UV

19 disegnare i primers Identificazione dell esone 2, codoni 12 e 13, del gene K-RAS mediante l utilizzo di primers specifici

20 Coppie di primers per PCR: K-Ras Forward TTTGTATTAAAAGGTACTGGTGGAG K-Ras Reverse GGTTTCTCTGACCATTTTCATGA

21 PCR (Polymerase Chain Reaction) Possibililtà di produrre quantità molto elevate di una specifica regione di DNA (gene o un altro segmento di DNA)

22 Reagente 5 x Buffer INVITROGEN dntps (10 mm) primer mix (10 μm each) DNA MgCl 2 Tfi DNA Polymerase (5 U/ μl) H 2 O Concentrazione finale 1 X 200 μm 0,2 μm ng 1.5 mm 5 unità to 50 μl

23 La reazione si svolge in 3 passaggi successivi

24 I due filamenti della molecola di DNA stampo da amplificare vengono separati mediante aumento della temperatura in modo che l energia termica rompa i legami d idrogeno. La temperatura viene abbassata e i primers si appaiano al DNA stampo. Questi ultimi sono due corte molecole di DNA a singolo filamento,sintetizzate artificialmente in modo da essere complementari a due regioni del DNA stampo che si trovano agli estremi del frammento da amplificare. La temperatura viene alzata fino a quella ottimale per l azione dell enzima DNA polimerasi. Esso si lega ai primers e inizia ad allungarli aggiungendo nucleotidi complementari al filamento stampo.

25 Il ciclo: denaturazione-appaiamento-estensione ripetuto volte

26 2 elettroforesi: abbiamo amplificato il DNA? Gli ampliconi verranno analizzati con elettroforesi su gel di agarosio all' 1% e colorati con etidio bromuro.

27 - Polo negativo 8 (Colonna 8) Marker 300 bp 200 bp + Polo positivo La distanza di migrazione dei frammenti di DNA sarà determinata dalle loro dimensioni Le dimensioni dei frammenti di DNA saranno identificate mediante il confronto con la migrazione sul gel dei pesi molecolari standard (Marker a peso noto)

28 PURIFICAZIONE DEI PRODOTTI DI PCR Per la purificazione dei campioni ci siamo serviti del kit Agencourt AMPure della Beckman Coulter, un sistema di purificazione ad alta efficienza dei prodotti di PCR che utilizza il Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI ), tecnologia basata sulle biglie magnetiche e che non richiede passaggi di centrifugazione e/o filtrazione. La tecnica di purificazione è molto semplice e basata essenzialmente su 3 step

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30 Biomek 3000 Laboratory Automation Workstation Biomek 3000 Laboratory Automation Workstation

31 Reazionie di sequenza Cycle sequencing Consiste in una variante della PCR in cui il DNA viene amplificato con una DNA polimerasi a partire da un unico primer di sequenza in presenza, oltre ai normali precursori nucleotidici, di una miscela di ddntps ciascuno marcato con un fluorocromo differente. Una tecnologia di marcatura comunemente utilizzata è quella dei BigDye, un sistema a trasferimento di energia a singola molecola, costituito da un accettore e da un donatore di fotoni collegati da un linker, che producono un segnale estremamente omogeneo e con bassissimo rumore di fondo

32 Reagente Sequencing Buffer 5X BigDye Terminator 3.1 Ready Reaction Mix Primer Templato (prodotto di PCR) H 2 O Concentrazione finale 1 X 1-8 μl 3,2 μm 3-10 ng To 20μl, DENATURAZIONE 10 sec. 96 C ANNEALING 5 sec. 55 C EXTENSION 4 min. 60 C

33 PURIFICAZIONE DEI PRODOTTI DELLA REAZIONE DI SEQUENZA Il campione deve essere totalmente privo di sali e di altre molecole contaminanti cariche negativamente, infatti, questi potrebbero competere con il DNA per l'ingresso nel capillare durante l'iniezione, con una conseguente perdita di segnale. Inoltre, la presenza di proteine, detergenti e templati di DNA non marcati potrebbero causare l'intasamento del capillare, con una conseguente perdita di risoluzione. Per tali motivi i prodotti di Cycle sequencing sono stati purificati con il kit Agencourt CleanSEQ analogo al kit Agencourt AMPure, mediante Biomek 3000 Laboratory Automation Workstation

34 Il sequenziatore automatico di DNA ABI 3130, Genetic Analyzer

35 PRINCIPIO DEL SEQUENZIAMENTO DEL DNA Il sequenziamento automatico: separazione dei vari frammenti ottenuti in base al peso molecolare questo avviene mediante una elettroforesi capillare la rivelazione avviene attraverso fluorescenza* un sistema di rilevazione di

36 Sistema di rilevazione di fluorescenza* L'emissione di fluorescenza viene focalizzata verso un fotomoltiplicatore, quindi raccolta e analizzata da una camera CCD (Charge Coupled Device) che elabora i diversi segnali con elevata sensibilità Il segnale così ottenuto viene filtrato ed elaborato da un opportuno software e presentato sotto forma grafica (DNA Sequencing Analysis Software v5.1.) L'elettroferogramma così ottenuto è caratterizzato da una successione di picchi di quattro colori diversi, ciascuno corrispondente ad un nucleotide

37 Elettroferogramma Ciascuno dei due esoni è stato sequenziato sia mediante primer forward che reverse, in maniera tale da poter confermare l'eventuale mutazione rilevata, su entrambi gli strand

38 National Center for Biotechnology Information Le sequenze ottenute saranno confrontate con quelle esistenti in banca dati ( Interfaccia grafica del programma BLAST (Basic Local Alignment SearchTool).

39 Wild Type

40 MUTAZIONE Gly12Val (GGT>GTT)

41 sensibilità

42 I CONTROLLI Per ogni determinazione devono essere previsti: Controllo positivo di amplificazione (utilizzando diluizioni di DNA mutato e DNA non-mutato da linee cellulari il cui stato mutazionale di K-RAS sia conosciuto) Controllo negativo (miscela di reazione priva di templato). La reazione PCR deve essere allestita utilizzando ng di DNA genomico per garantire una buona resa ed evitare artefatti.

43 Raccomandazioni per il protocollo di sequenziamento del gene KRAS Prodotti di due diverse PCR dovrebbero essere sequenziati in forward e reverse, in modo da ottenere un numero di 3-4 sequenze per campione. Il controllo qualitativo viene effettuato mediante assemblaggio delle sequenze con un software dedicato all analisi delle sequenze, lettura dell elettroferogramma e confronto con la sequenza wild type.

44 Sequenziamento: pregi e difetti... Pregi : metodica gold standard per la ricerca di mutazioni puntiformi elevata specificità Difetti : sensibilità non elevata (> 20-25% di cellule mutate) tempi di lavoro (minimo 3 giorni...ma...) pur essendo la metodica di riferimento è considerata home-made

45 PIROSEQUENZIAMENTO La metodica si basa sul monitoraggio in tempo reale della sintesi di uno specifico tratto di DNA attraverso la misurazione di segnali di bioluminescenza liberati in seguito all incorporazione nucleotidica

46 Pirosequenziamento Kit ready to use light PPi ATP Florescenza in tempo reale time

47 PIROGRAMMA

48 PIROSEQUENZIAMENTO: pregi e difetti... Pregi : elevata specificità elevata sensibilità (3-5 % delle cellule mutate) no dubbi interpretativi disponibilità di kit marcato CE (codoni 12, 13, 61, 146) tempi di lavoro ridotto (2 giorni) sistema aperto per analisi simultanea di altri geni Difetti : necessità di avere lo strumento specifico

49 PCR Real-Time La Real-Time PCR (RT-PCR), permette non solo di quantizzare l amplificato ottenuto ma anche di visualizzare la cinetica di amplificazione La RT-PCR rappresenta uno strumento per migliorare la sensibilità diagnostica e fornire risultati attendibili e in tempo reale.

50 TheraScreen: K-RAS Mutation Kit È possibile identificare sette mutazioni nel gene K-RAS; è basato sulla tecnologia Scorpions ARMS. È possibile determinare circa l'1% dei mutati

51 Tecnologia ARMS (Amplification Refractory Mutation System) Supporta l'amplificazione di specifici alleli o mutazioni. E' possibile eseguire un'amplificazione selettiva di specifiche sequenze mutate anche in campioni in cui le sequenze non mutate sono la maggioranza, in quanto: Quando il primer è perfettamente appaiato, l'amplificazione procede con la massima efficienza. Quando la base in 3 presenta un appaiamento errato, si osserva soltanto un'amplificazione di basso livello sullo sfondo.

52 Sonde Scorpions è una stem-loop coniugata con reporter e quencer (il quencer in questo assorbe, ma non emette) è coniugata con un primer forward (o reverse) tra primer e sonda reporter è presente una molecola (blocker) che impedisce alla Taq di utilizzare la sonda come stampo

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54 PCR Real-Time: pregi e difetti... Pregi : elevata sensibilità (1-2% delle cellule mutate) disponibilità di kit marcato CE tempi di lavoro ridotto (2 giorni) Difetti : costi elevati solo 7 mutazioni identificate sistema chiuso

55 Metodiche a confronto Fondamentale l'analisi del contesto in cui si opera

56 Parametri numero di casi attesi, routine non solo costo c'è un numero? addestramento/formazione del personale di laboratorio Expertise and Experience Riferimento esterno

57 I RISULTATI

58 50+10= 60% WT 40% MUT

59 I nostri dati MUTATO WILD TYPE 50% 50% BRAF? SAPPIAMO 10% MUT. 50 (K-RAS)+10(BRAF)= 60% MUT 40% W.T.

60 I nostri dati Codone 13 Codone 12 codone 12 (73%) codone 13 (27%)

61 Distribuzione delle mutazioni Gly 13 Asp 26,7% Gly 12 Cys 6,7 Gly 12 Val 26,7 % Gly 12 Asp 40%

62 Prospettive future? Altre applicazioni della detection delle mutazioni in relazione a Target Therapy sono già una richiesta : EGFRr NSCLC* *Carcinoma non a piccole cellule del polmone Mutazioni attivanti Sequenz. Esone: 18; 19, 20, 21 (x4)

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64 GRAZIE PER L ATTENZIONE