Lezione 6. Analisi di sequenze biologiche e ricerche in database

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1 Lezione 6 Analisi di sequenze biologiche e ricerche in database

2 Schema della lezione Allinemento: definizioni Allineamento di due sequenze Ricerca di singola sequenza in banche dati (Alignment-based database searching) FASTA, BLAST

3 Allinemento: definizioni Allineamento di due sequenze Ricerca di singola sequenza in banche dati (Alignment-based database searching) FASTA, BLAST

4 Allineamento di sequenze Determinare la similarità e dedurre l omologia

5 Allineare Definire il numero di passi necessari per trasformare una sequenza nell altra utilizzando passaggi mutazionali come -sostituzione -inserzione/delezione mismatch 1 LA CASA È NUOVA 2 LA CASSA È VUOTA 1 LA CAS-A È NUO-VA 2 LA CASSA È V-UOT-A 5 indels gap 1 LA CASA È NUOVA 2 LA CASSA È VUOTA 1 LA CAS-A È NUOVA 2 LA CASSA È VUOTA match 1 indels + 2 sostituzioni Tra le due soluzioni mostrate (ce ne sono altre!), quale scegliamo? Esistono criteri e algoritmi che ci possono aiutare

6 Perchè allineare? Per fornire una misura di quanto sequenze nucleotidiche o aminoacidiche siano imparentate, abbiano in comune Questa parentela ci permette di fare inferenze biologiche in termini di relazioni strutturali relazioni funzionali relazioni evolutive Alignment-based database searching

7 Terminologia La misura QUANTITATIVA: Similarità Si esprime in genere come % di identità, quantifica i cambiamenti che sono avvenuti dal momento della divergenza tra due specie (sostituzioni, Indels) Identifica i residui cruciali per mantenere la struttura o la funzione di una proteina Alti livelli di similarità possono indicare una divergenza recente tra le sequenze, una storia evolutiva comune, simile funzione biologica

8 Terminologia Una valutazione di STATO: Omologia Implica l esistenza di relazioni evolutive Geni omologi: geni che si sono originati per divergenza da un antenato comune I geni SONO o NON SONO omologhi, non esiste una misura quantitativa dell omologia

9 Eyeless ha un ruolo importante nel dirigere lo sviluppo dell occhio in drosofila; Pax6 lo stesso nel topo Eyeless e Pax6 sono decisamente simili in sequenza e funzione probably > 500 MYA

10 Terminologia Ortologhi: Geni che si sono separati in seguito ad un evento di speciazione Le sequenze discendono da un antenato comune Molto probabilmente codificano per proteine con domini simili e simili strutture tridimensionali Spesso mantengono funzioni simili Possono essere usati per predire funzioni geniche in genomi nuovi Paraloghi: Geni che si sono evoluti per duplicazione in una specifica linea evolutiva E meno probabile che mantengano funzioni simili, più comunemente evolvono nuove funzioni

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12 Globale Allineamenti globali e locali trova l allineamento ottimale sul totale della lunghezza delle sequenze È la soluzione migliore per sequenze di lunghezza simile ed omologhe Al dimiuire del grado di similarità (es. aumento distanza evolutiva, alto tasso di ricombinazione) i metodi di allineamento globale tendono a peggiorare molto in efficienza

13 Locale Allineamenti globali e locali Ha lo scopo di trovare regioni simili (es. domini) in due sequenze ( paired subsequences ) Le regioni fuori dalle aree di allineamento locale vengono escluse Può essere generato più di un allineamento locale per ogni coppia di sequenze confrontate Scelta indicata nel caso di due sequenze a similarità ridotta o di differenti lunghezze

14 Local vs. Global Alignment Global Alignment --T -CC-C-AGT -TATGT-CAGGGGACACG A-GCATGCAGA-GAC AATTGCCGCC-GTCGT-T-TTCAG----CA-GTTATG T-CAGAT--C Local Alignment migliore per trovare regioni conservate tcccagttatgtcaggggacacgagcatgcagagac aattgccgccgtcgttttcagcagttatgtcagatc

15 Allineamenti locali: perchè? Due geni in specie diverse possono essere simili in corte regioni conservate e diversi nel resto della sequenza. Esempio: I geni Homeobox (chiaramente omologhi) hanno corte regioni chiamate omeodomini altamente conservate tra specie. Un allineamento globale non troverebbe gli omeodomini perchè cercherebbe di allineare l INTERA sequenza

17 Allineamento: ipotesi circa l omologia posizionale (discendenza da antenato comune) di due residui in due (o più) sequenze

18 Un allineamento a coppie consiste di una serie di residui o basi accoppiati, una per sequenza. Ci sono tre tipi di coppie: (1) match = stesso nucleotide (o AA) in entrambe le sequenze (2) mismatch = diverso nucleotide (o AA) in una delle sequenze (3) gap = una base (o AA) in una sequenza e niente nell altra GCGGCCCATCAGGTAGTTGGTG-G GCGTTCCATC--CTGGTTGGTGTG Come si può fare in modo non manuale??

19 Dot plot: matrici a punti Gibbs and McIntyre 1970 Non produce direttamente un allineamento, ma una mappa delle zone di somiglianza Le due sequenze vengono scritte come colonne e righe di una matrice Si inserisce un punto dove le due sequenze sono identiche Sequenza 2: inversione

20 Dot plot: matrici a punti Vantaggi: visivamente si intuisce che cosa è successo Sequenza 2: delezione (potrebbe essere anche un inserzione in seq1) Passo in diagonale verso una casella con un punto= match. Diagonale verso una casella vuota = mismatch. Orizzontale = gap nella sequenza2. Verticale = gap nella sequenza1.

21 Svantaggi: Non è possibile identificare l allineamento migliore. Le matrici di nucleotidi sono spesso confuse per via dell alta ripetitività dei simboli (sono solo 4!) 23

22 Come si può migliorare il metodo dot plot eliminando un po di rumore di fondo? Ad esempio pesando i diversi cambiamenti usando dei criteri

23 Matrici di punteggio e penalità per i gap Il vero allineamento tra due sequenze è quello che riflette in modo accurato le loro relazioni evolutive. Poichè il vero allineamento non è conosciuto in pratica si cerca l allineamento ottimale: minimizza i mismatches e i gaps secondo certi criteri.purtroppo mms gaps gaps mms

24 ( ( ( Matches Mismatches Gaps (1 terminal) Matches Mismatches Gaps Matches Mismatches Gaps (both terminal)

25 Matrici di punteggio e penalità per i gap Lo schema di punteggio include una penalizzazione per le in-del (gap penalty) e una matrice di punteggio (scoring matrix) M(a,b), che specifica ogni tipo di match (a = b) o di mismatch (a b). Le unità nella matrice di punteggio possono essere nucleotidi nelle sequenze di DNA o RNA, i codoni nelle regioni codificanti, o gli aminoacidi nelle sequenze proteiche.

26 Cos è una matrice di punteggio? Matrice che associa un punteggio ad ogni coppia di entità che troviamo in un allineamento Ogni linea e ogni colonna rappresentano un residuo (4 nucleotidi o 20 aminoacidi) La diagonale è l identità Il triangolo inferiore corrisponde alle sostituzioni e il superiore è simmetrico (non necessario) I valori negativi indicano penalità per certe sostituzioni, l algoritmo di allineamento cercherà di evitarle I valori positivi indicano sostituzioni accettate in termini evoolutivi, strutturali o funzionali

27 Perché è importante capire le matrici di punteggio? Compaiono in ogni analisi che implichi un confronto tra sequenze Implicano un determinato percorso evolutivo Possono influenzare fortemente il risultato delle analisi

28 DNA scoring matrices Di solito sono semplici. La più semplice: M(a,b) assegna valori positivi se a = b (match), altrimenti negativi (mismatch) M(a,b) 0 if a b 0 if a b

29 DNA scoring matrices Matrici più complesse possono distinguere ad esempio tra transizioni e trasversioni (le prime avvengono più facilmente trattandosi di molecole più simili, però ci sono 4 possibili trasversioni e solo 2 transizioni)

30 Amino acid/protein scoring matrices Margareth Dayhoff 1965: Atlas of potein sequences contenente le sequenze aminoacidiche di 65 proteine Inizio delle collezioni di dati da cui avranno origine le banche dati elettroniche Dayhoff et al. nel decennio hanno proposto una procedura per il calcolo di matrici di punteggio per quantificare la propensione di AA a mutare l uno nell altro durante l evoluzione (matrici 20 x 20). Alla base c è l osservazione delle proteine note: MATRICI DI SOSTITUZIONI EMPIRICHE

31 Amino acid/protein scoring matrices Empirical substitution matrices PAM matrix (Percent/Point Accepted Mutation Matrix) BLOSUM (BLOcks SUbstitution Matrix)

32 PAM (Percent/Point Accepted Mutation) Una point accepted mutation PAM è la sostituzione di un AA nella struttura primaria di una proteina con un altro AA, che viene tollerata dalla selezione naturale. Dalle PAM sono escluse le mutazioni sinonime, le letali, o non tollerate dalla selezione naturale in qualche maniera (l esclusione è ovvia: non si osserveranno!).

33 Costruzione di una matrice PAM Per costruire le matrici PAM ( ) sono stati identificati tra le sequenze proteiche conosciute in quegli anni, 71 gruppi di sequenze con almeno l 85% di identità (poca distanza evolutiva > allineamento semplice> bassa possibilità di mutazioni multiple ad un sito). Le sequenze sono state allineate: 1572 cambiamenti osservati Gruppi di proteine > 85% identità Sono state stimate le mutabilità dei diversi AA (propensione di un certo AA ad essere sostituito) > OSSERVAZIONE!!

34 Gruppi di proteine > 85% identità I dati sono stati combinati per produrre una Mutation Probability Matrix in cui ogni valore indica la probabilità che l AAx sia sostituito con l AAy attraverso una o più mutazioni accettate in uno specifico intervallo evolutivo, rispetto alla probabilità che i due aminoacidi siano stati allineati per caso (calcolata come freq AAx * freqaay).

35 1 PAM è la quantità di cambiamenti evolutivi che porta, in media, ad una sostituzione ogni 100 residui aminoacidici (1%) Moltiplicando la matrice PAM01 per se stessa N volte ottengo matrici per distanze evolutive sempre maggiori PAM60: mi aspetto in media 60 cambiamenti ogni 100 AA PAM250: 250 cambiamenti ogni 100 AA (un AA può mutare più volte) Gruppi di proteine > 85% identità PAM N matrix

36 ogni valore indica la probabilità che l AAx sia sostituito con l AAy attraverso una o più mutazioni accettate in uno specifico intervallo evolutivo, rispetto alla probabilità che i due aminoacidi siano stati allineati per caso P > 0 P = 0 P < 0 lo scambio AAx AAy si osserva più frequentemente di quanto atteso per caso la frequenza della sostituzione è indistinguibile da quella casuale lo scambio AAx AAy è più raro di quanto atteso per caso

37 BLOSUM (BLOcks SUbstitution Matrix) Henikoff and Henikoff (1992): matrice basata su molte più osservazioni della PAM: scambi aminoacidici calcolati su circa 2000 «blocchi» Blocco: regione conservata di una famiglia di proteine senza indels Direttamente calcolate sulla base di allineamenti locali Probabilità di sostituzione (conservazione) Frequenza degli aminoacidi

38 Cosa rapprsenta il numero dopo BLOSUM? Esempio: BLOSUM n include nei blocchi sequenze con MASSIMO n% di identità Sequenze con > n% di dientità vengono clusterizzate e sostituite da un unica sequenza che rappresenti il cluster (vedi ad esempio le ultime due dello schema)

39 Default in BLAST E: Asp D: Glu

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41 Equivalenze Non esiste la matrice perfetta, dipende dal dataset che stiamo analizzando e da quanto le sequenze da allineare sono conservate

42 Gap penalties Quanto è probabile una Costo delle indels (GAP) certa sostituzione (matrici) Costo dell introduzione di un gap (Gap opening penalty: G) Costo dell estensione di un gap (Gap extension penalty: L*n) Costo complessivo: G+Ln Questi sono valori usati spesso, ma si possono cambiare!

43 Algoritmi di allineamento Obiettivo: trovare il miglior allineamento, cioè il massimo numero di simboli identici e il minor numero di gap (=minor numero di mutazioni = più breve percorso evolutivo) Per due sequenze di DNA di 200 basi ci sono possibili allineamenti.meglio non farli a mano!

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45 Algoritmi di allineamento Esausitivi o esatti: esplorano tutte le possibili soluzioni e scelgono la migliore (lenti, computazionalmente intensi, precisi) Euristici: prendono scorciatoie e cercano di arrivare ad una soluzione ottimale basandosi su ipotesi plausibili Algoritmi di allineamento comuni Algoritmo Esaustivo? Gaps? Loc/Glo Mul align Db searches Needleman -Wunsch Smith- Waterman Si Si Global Si No Si Si Local Si Si FASTA No Si Local Si Si BLAST No No Local No Si

46 Needleman-Wunsch Exact global alignment method Non molto buono in molti casi (es. db searches, ricerca di piccole regioni di similarità, allinemanti tra sequenze con grosse differenze di lunghezza) Il più rigoroso e completo se lo scopo è di allineare sequenze che non si sono evolute per exon shuffling, inserzione/delezione di domini, etc. Il metodo migliore se le sequenze sono di lunghezze simili e si sono evolute da un antenato comune attraverso mutazioni di punto, piccole ind/dels

47 Smith-Waterman Exact local alignment method Modifica del N-W che permette di allineare in locale (non serve allineare tutta la seq) Allineamento molto buono per db searching, allineamento multiplo e a coppie Esaustivo, quindi può essere molto lento. A differenza del N-W considera qualunque allineamento che parta da qualunque posizione della sequenza, non solo quelli che cominciano all inizio e terminano alla fine

49 L algoritmo deve identificare le sequenze omologhe e non omologhe separate da un valore soglia Ricerche in database Query (sequenza sonda) ricerca Sequenze nelle banche dati FP: falsi positivi Caso 1: buon lavoro dell algoritmo Sequenze non omologhe Sequenze omologhe VP: veri positivi FN: falsi negativi VN: veri negativi Caso 2: c è una zona in cui non è possibile discriminare omologhe e non VN Regione di sovrapposizione FN FP VP Punteggio soglia

50 FASTA: Pearson WR (1996) Effective protein sequence comparison. Academic Press Inc Pearson WR and Lipman DJ (1998) Improved tools for biological sequence comparison. PNAS 85:2444 Euristico locale Prima identifica regioni di identità tra la sequenza sonda ( query ) e le sequenze in db. (KTUP) I geni o proteine con la densità maggiore di segnale vengono riesaminati L allineamento viene esteso ad entrambi i lati delle regioni di match aggiungendo gaps e mismatches sulla base di matrici di punteggio L allineamento ottiene un punteggio NB: leggere l HELP del programma

51 FASTA algoritm Trova sottosequenze identiche Le rivaluta assegnando nuovi punteggi con le matrici di punteggio (PAM, BLOSUM etc)

52 FASTA algoritm Unisce segmenti usando i gaps, elimina gli altri Usa programmi dinamici (simili agli algoritmi NW e SM visti in precedenza) per creare l allineamento ottimale: ottiene un punteggio «S opt»

53 FASTA algoritm Assegnazione di un «S opt» a ciascuna sequenza della banca dati Le sequenze con punteggi superiori ad una certa soglia sono riportate in ordine decrescente Possiamo guardarle per vedere se hanno un senso biologico ( > omologia) Se non lo identifichiamo guardiamo l E value (significatività statistica)

54 E value: significatività statistica Attesa (Expectation) di trovare PER CASO uno Score come quello osservato

55 E value: significatività statistica Non si interpretano come p values dove p < 0.05 sono generalmente considerati significativi Regola generale E values < 10-6 sono molto probabilmente significativi < E values < 10-3 meritano una seconda occhiata. E values < 10-3 andrebbero scartati (ci aspettiamo di trovare sequenze non correlate alla nostra-falsi positivi- che ottengono un punteggio superiore a quell S).

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