DUPLICα RealTime MTHFR C677T Genotyping Kit

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1 DUPLICα RealTime MTHFR C677T Genotyping Kit INTENDED USE DUPLICα RealTime MTHFR C677T Genotyping Kit is a test with the DNA-based detection of the nucleotide substitution in EDTA collected peripheral whole blood. SUMMARY Both genetic and environmental factors affect homocystein levels. One of the most common genetic defects of homocystein metabolism is a mutation in the enzyme MTHFR. This enzyme is involved with folate metabolism catalyzing the reduction of 5,10 methylenetetrahydrofolate to 5- methyltetrahydrofolate. Folate is a cofactor in remethylation of homocystein. Without it, homocystein levels in the plasma increase. The most common MTHFR mutation is C677T causing substitution of Ala to Val at position 222 (Ala222Val). This mutation is associated with reduced enzyme activity and elevated total homocystein levels in serum or plasma. Another mutation an A to C transition at base pair 1298 which substitutes a glutamate for alanine, is also associated with increased homocystein and lowered plasma folate levels when present in combination with the C677T mutation. The C677T mutation is frequent in the general population: in Caucasian of European descent the frequency of homozygotes for this mutation ranges from about 5 percent to percent. African Americans have as low frequency of 1.4 percent. Elevated plasma homocystein is an independent risk factor for arteriosclerotic coronary heart disease and thrombosis. Homozygosity for the C677T MTHFR mutation has been associated with intermediate and mild hyperhomocisteinemia. C677T homozygosity correlated with a threefold increased risk for premature cardiovascular disease in patients with mild hyperhomocisteinemia even without other known risk factors such as hypertension, hyperlipidemia or diabetes. PRINCIPLE OF THE TEST DUPLICα RealTime h: EER tests CV MTHFR C677T Genotyping Kit was designed to identify C667T point mutation in a gene coding MTHFR enzyme. Two reaction mixes are provided for the amplification: AMPLIFICATION MIX: with Hot Start Taq DNA polymerase (modify antibody technology), nucleotides, MgCl 2 and buffer. OLIGO MIX: with primers and fluorogenic probes. In the PCR procedure trace amounts of DNA can be quickly and repeatedly copied to produce a quantity sufficient to investigate using conventional laboratory methods. There are three basic steps involved in the PCR process: denaturation, annealing, extension. Denaturation to promote single-strandedness of the template DNA is achieved by heating to approximately 94 C. The temperature is then lowered significantly to promote base-pairing (annealing) of the primer to the template. The DUPLICα RealTime assay allows the direct detection of a point mutation by monitoring the increase in fluorescence of a dyelabelled oligonucleotide probe. Two dye-labelled probes are used in this allelic discrimination assay, one probe specific for each allele in the two-allele system. Each probe consists of an oligonucleotide with a 5 -report dye and a 3 -quencher dye. FAM (6-carboxy-fluorescein) is covalently linked to the 5 -end of the probe for detection of the wild-type allele. HEX (hexachlorofluorescein) is covalently linked to the 5 end of the probe of detection of the mutant allele. Each of these two reporters are quenced by BHQ-1 (Black Hole Quencher) linked through a linker arm on the 3 -end of each probes.

2 Quencer can quench the reporter fluorescent only when the two dyes are close to each other. This happens when the probe is intact. Once amplification occurs, the probe is destroyed by the 5-3 exonuclease activity of the Taq DNA polymerase and the fluorescence will be detected by the optical system. The fluorescence detected by instrument increased together with the DNA amplification. REAGENTS PROVIDED Each kit contains enough reagents to perform 32 tests. The kit is for 4 sessions with 6 samples,1 normal control (C1),1 mutated control (C2) and one blank of reaction (B). Real Time PCR Reagents Amplification mix (400 ul) Oligo Mix* (400 ul) Control 1 (Wild Type) (>50ul) Control 2 (Mutated) (>50 ul) Reaction blank (B) (>50 ul) *store the tube far from light Color Code Blue Cap Green Cap Red Cap Yellow Cap White Cap STORAGE AND HANDLING All reagents have to be stored at -22 C/-18 C. All reagents can be used until the expiration date printed on the labels. EuroClone Diagnostica Srl recommends freezing and thawing the products at most six times. Warning: after complete thawing and before using the kit is recommended to spin all reagents and to resuspend them by pipetting 3 times. REAGENTS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED Micropipette 1-10 µl Micropipette µl Sterile filter tips Rack for 0.2 ml tubes Optical tubes or microplate for Real Time PCR Thermal cycler for Real Time PCR PRECAUTIONS AND WARNINGS Do not use the reagents after the date of expiration. Mix the reagents of the kit before use. Periodically verify the calibration of micropipette and instrumentation. Change gloves frequently. Laboratory equipments (pipettes, tips etc.) should not be moved from one working area to another. Periodically wash the working area with hypochlorite 5% Use powder-free gloves. Do not leave fingerprints on optical caps. Do not write on caps as this may cause an interference with fluorescence detection. OPERATING PROCEDURE a) DNA extraction For genomic DNA extraction EuroClone Diagnostica Srlrecommends to use: Fassst DNA Releaser (Euroclone, EMR057050) for fresh peripheral blood (i.e. stored until 24 hours at +2/+8 C) EuroClone Diagnostica SrlSpin DNA Purification Kit (EMR061050) for frozen blood or stored at +2/+8 C for more than 24 hours. Attention! Use blood samples in EDTA anti-coagulant solution. b) Thermal Cycler set up Refer to the specific handbook of the equipment used but be sure to set the following thermal profile. We recommend to switch on the instrument, setting the thermal profile and having the plate ready before preparing the reaction mix. Thermal Profile Time Temperature Cycles 10 min 95 C 1 15 sec 95 C sec 62 C Fluorescent Acquisition

3 c) Preparation of PCR mix For each experiment prepare a PCR mix for the 2 controls (1 and 2), 1 reaction blank, n+1 samples. The reagents of the PCR mix have to mixed under this ratio: REAGENT VOLUME (ul) Amplification mix 10 Oligo mix 10 Extracted DNA 5 After a mix preparation, aliquot 20µl of Master Mix in the tubes or in the microplates for PCR than add in each tube 5µl (correspondent to ng) from the extracted DNA or control DNA and set in order the tubes in the instrument and start the program of amplification setting before. At the end of the program remove the tubes from the thermocycler. d) ANALYSIS and INTERPRETATION of the RESULTS The fluorescence in each channel indicates the hybridisation of the allelic specific probes: Channel 1 for FAM= Wild Type probe and Channel 2 for HEX= Mutated probe. If a sample shows a fluorescence in FAM, the sample has Wild Type allele. If a sample shows a fluorescence in HEX, the sample has Mutated allele. Therefore, if a signal only a FAM signal (Ct > 0) is detected the sample is Homozygous Wild Type, whereas if a signal only a HEX signal (Ct > 0) is detected the sample is Homozygous Mutated. Finally, if both FAM and HEX are detected the sample is Heterozygous. Condition in which no signal is detected indicates PCR inhibition. In this case, the sample must be reextracted. Control 1 (Wild Type) and Control 2 (Mutant) are provided in order to properly set the threshold line before samples analysis. After the run, the threshold line has to be set so that: Control 1 results positive in FAM and negative in HEX, whereas Control 2 results positive in HEX and negative in FAM. If these two conditions have been met, the run is valid and it s possible to analyse the data; otherwise the run is not valid. It s responsibility of the user to validate the run by checking that these conditions have been met. FAM HEX Results Ct > 0 Ct=0 Wild Type Ct = 0 Ct > 0 Mutated Ct > 0 Ct >0 Heterozygous Ct = 0 Ct = 0 Inhibition TROUBLESHOOTING Problem 1: No signal 1. Wrong channel/filter was chosen. 2. Pipetting error due to omitted reagents or samples. 3. Inhibitory effect of the sample: genomic DNA with a insufficient purification and/or insufficient extraction. 4. Check the kit was stored correctly. 5. Assess the performance of the thermal cycler. Problem 2: Fluorescence intensity too low 1. Deterioration of dyes and/or primers in the reagents due to unsuitable storage conditions. 2. Very low starting amount and/or purity of genomic DNA. Problem 3: Fluorescence intensity varies 1. The prepared PCR master mix is not well mixed. 2. Air bubbles trapped in the PCR tubes. THE PURCHASE OF THIS PRODUCT GRANTS THE PURCHASER RIGHTS UNDER CERTAIN ROCHE PATENTS TO USE IT SOLELY FOR PROVIDING HUMAN IN VITRO DIAGNOSTIC SERVICES. NO GENERAL PATENT OR OTHER LICENSE OF ANY KIND OTHER THAN THIS SPECIFIC RIGHT OF USE FROM PURCHASE IS GRANTED HEREBY

4 DUPLICα RealTime MTHFR C677T Genotyping Kit h: EER tests CV FINALITA D USO DUPLICα RealTime MTHFR C677T Genotyping Kit è un test qualitativo, impiegato per la ricerca della mutazione C677T nel DNA ottenuto da campioni clinici di sangue intero periferico in soluzione EDTA. INTRODUZIONE I livelli di omocisteina sono influenzati sia da fattori genetici che ambientali. Uno dei più comuni difetti genetici nel metabolismo dell omocisteina è una mutazione dell enzima MTHFR. Questo enzima è coinvolto nel metabolismo del folato, catalizzando la riduzione del 5,10-metilenetetraidrofolato a 5- metiltetraidrofolato. Il folato è un cofattore nella rimetilazione dell omocisteina; senza di esso i livelli di omocisteina nel plasma aumenterebbero. La mutazione più comune del MTHFR è C677T e consiste in una sostituzione di Alanina con Valina nella posizione 222 (Ala222Val). Questa mutazione è associata alla riduzione di funzionalità dell enzima e al conseguente livello elevato di omocisteina nel plasma. Un altra mutazione, la transizione da A a C in posizione 1298 provoca la sostituzione di glutammato con alanina, e, se associata alla mutazione C677T, provoca un incremento del livello di omocisteina e una diminuzione del folato nel plasma. La C677T è una mutazione frequente nelle diverse popolazioni: nella razza Caucasica Europea la frequenza di omozigoti per questa mutazione ha un range che va dal 5% al 12-15%. Gli Afroamericani hanno una frequenza minore, pari al 1.4%. L elevato livello di omocisteina nel plasma è un fattore di rischio indipendente per l aterosclerosi coronarica e per una iperomocisteinemia non severa. L omozigosi C677T viene correlata ad un triplice aumento del rischio di disturbi cardiovascolari prematuri in pazienti con una iperomocisteinemia non severa, anche in assenza di altri fattori di rischio come ipertensione, iperlipidemia e diabete. PRINCIPIO DEL TEST DUPLICα RealTime MTHFR C677T Genotyping Kit è stato disegnato per riconoscere la mutazione puntiforme C677T nel gene che codifica per l enzima metilentetraidrofolato reduttasi (MTHFR). I reagenti per la reazione di amplificazione sono pronti all uso e suddivisi in due mix di reazione: AMPLIFICATION MIX: contenente Hot Start Taq DNA polymerase (modified antibody technology), nucleotidi, MgCl 2 e buffer. OLIGO MIX contenente i primers e le sonde fluorogeniche. La polymerase chain reaction (PCR) è una reazione che permette di amplificare una sequenza target di DNA generando numerose copie di un templato. La reazione si compone generalmente di tre fasi: denaturazione del DNA, annealing (appaiamento dei primers) ed estensione. Queste fasi, che si realizzano attraverso riscaldamenti e raffreddamenti automatizzati mediante un termociclatore, rappresentano un ciclo di amplificazione; la ripetizione in continuo del ciclo base porta alla produzione di

5 miliardi di frammenti del DNA in studio. Alla denaturazione del DNA che avviene ad alte temperature segue l appaiamento di specifici primers al DNA target. Durante la fase di estensione l enzima Taq polymerase riconosce le estremità 3' di questi primers ed utilizzando i nucleotidi trifosfati (dntps) polimerizza il DNA, creando in questo modo numerose copie del templato. In tutti i sistemi PCR Real-Time la rivelazione dell amplificato avviene utilizzando un marcatore fluorescente che nelle sonde fluorogeniche viene chiamato reporter. I kit DUPLICα RealTime permettono di rilevare direttamente una mutazione puntifome seguendo direttamente la crescita della fluorescenza associata a sonde oligonucleotidiche marcate con fluorofori. Due sonde oligonucleotidiche sono usate in questo saggio di discriminazione allelica, ed ognuna di esse consiste in una sequenza oligonucleotica che presenta all estremità 5 un marcatore fluorescente chiamato «reporter», mentre all estremità 3 lega un secondo marcatore chiamato «quencher». Il fluoroforo FAM (6-carbossi-fluoresceina) è covalentemente legato all estremità 5 della sonda rilevante l allele normale (Wild-Type); il fluoroforo HEX è covalentemente legato all estremità 5 della sonda rilevante l allele mutato. In entrambe le sonde i reporter sono mascherati (quenching) da BHQ-1 (Black Hole Quencher 1) legato all estremità 3 della sonda. Il quencher maschererà il segnale del reporter quando queste due molecole si trovano in prossimità, ovvero quando la sonda è intatta. Durante l amplificazione la sonda è distrutta dell attività 5-3 esonucleasica della Taq DNA polimerasi e la fuorescenza potrà essere rilevata dal sistema ottico dello strumento. La fluorescenza rilevata dallo strumento aumenta parallelamente all amplificazione del DNA. COMPOSIZIONE DEL KIT Questo Kit è stato disegnato per poter eseguire 32 reazioni. Il kit permette di effettuare 4 corse, ciascuna delle quali include: 5 campioni, 1 controllo Wild Type (Controllo 1), 1 controllo Mutato (Controllo 2) e 1 bianco di reazione. Real Time PCR Reagenti Amplification mix (400 ul) Oligo Mix* (400 ul) Control 1 (Controllo Wild Type) (>50 ul) Control 2 (Controllo Mutato) (>50 ul) Reaction blank (B) (>50 ul) *proteggere la provetta dalla luce Codice colore Tappo Blu Tappo Verde Tappo Rosso Tappo Giallo Tappo Bianco CONSERVAZIONE E STABILITÀ Tutti i reagenti devono essere conservati a -22 C/-18 C fino alla data di scadenza riportata sulla confezione. EuroClone Diagnostica Srlraccomanda di non scongelare e ricongelare il prodotto più di sei volte. Attenzione: dopo il completo scongelamento e prima dell utilizzo si raccomanda di centrifugare tutti i reagenti e risospenderli pipettandoli 3 volte. MATERIALE NECESSARIO NON FORNITO Micropipette 1-10 ul Micropipette ul Puntali con filtro Rack per tubi da 0.2 ml Micropiastra ottica per real time PCR Tubi per PCR da 0. 2 ml con tappi ottici Termociclatore per Real Time PCR PRECAUZIONI E RACCOMANDAZIONI DI UTILIZZO La strumentazione di laboratorio (pipette, tubi, etc.) non deve circolare da una stazione di lavoro all altra. Non utilizzare reagenti dopo la data di scadenza.

6 Miscelare i reagenti del kit prima dell utilizzo. Periodicamente verificare la precisione delle pipette, e il corretto funzionamento della strumentazione. Cambiare spesso i guanti. Lavare periodicamente il banco di lavoro con Ipoclorito al 5%. Utilizzare i guanti senza talco e evitare di lasciare ditate sui tappi ottici. Non scrivere sui tappi, questo potrebbe creare dei problemi nella rivelazione della fluorescenza. PROTOCOLLO OPERATIVO a) Estrazione del DNA Genomico Per l estrazione del DNA genomico EuroClone Diagnostica Srlraccomanda di usare: Fassst DNA Releaser (EMR057050) per sangue fresco (conservato fino a 24 ore a +2/+8 C) EuroClone Diagnostica SrlSpin DNA Purification Kit (EMR061050) per sangue congelato o conservato a +2/+8 C per più di 24 ore. Attenzione! Utilizzare sangue in soluzione anticoagulante EDTA. b) Programmazione del termociclatore Riferirsi allo specifico manuale dello strumento ma assicurarsi di impostare il seguente profilo termico: Profilo Termico: Tempo Temperatura Cicli 10 min 95 C 1 15 sec 95 C sec 62 C Acquisire Fluorescenza Si suggerisce, prima di allestire la miscela di reazione, di accendere e programmare il termociclatore per Real Time PCR. c) Preparazione della PCR mix Per ogni esperimento preparare una mix di PCR per i 2 controlli (1 e 2 ), 1 bianco di reazione, n campioni più uno. La mix deve essere preparata miscelando i reagenti nei rapporti volumetrici di seguito indicati: REAGENTI VOLUME (µl) Amplification mix 10 Oligo mix 10 DNA Estratto 5 Terminata la preparazione della mix, aliquotare 20ul della Master Mix nei tubi o nelle micropiastre per PCR e aggiungere in ogni tubo 5ul di DNA estratto e dei controlli; disporre i tubi all interno dello strumento e avviare il programma di amplificazione precedentemente impostato. Al termine del protocollo di amplificazione, rimuovere i tubi dal termociclatore. d) ANALISI ed INTERPRETAZIONE dei RISULTATI La fluorescenza di ogni canale indica l ibridazione di una sonda specifica per un allele: il CANALE 1 per FAM= sonda Wild Type, mentre il Canale 2 per HEX= sonda Mutata. Se un campione mostra una fluorescenza in FAM, il campione ha un allele Wild Type. Se il campione mostra una fluorescenza in HEX, il campione ha un allele Mutato. Perció, se viene rilevato solo il segnale FAM (Ct > 0) il campione é Omozigote Wild Type; mentre se viene rilevato solo il segnale HEX (Ct > 0) il campione é Omozigote Mutante. Infine, se sono rilevati sia FAM che HEX il campione é Eterozigote. La PCR risulta inibita se non viene rilevato nessun segnale. In questo caso il campione deve essere riestratto. Sono forniti il Controllo 1 (Wild Type) ed il Controllo 2 (Mutante) per impostare correttamente la linea soglia prima di analizzare i campioni. Dopo la corsa, la linea soglia deve essere impostata affinchè: il Controllo 1 risulti positivo in FAM e negativo in HEX, mentre il Controllo 2 risulti positivo in HEX e negativo in FAM.

7 Se si verificano queste due condizioni la corsa é valida ed é possible analizzare i dati, altrimenti la corsa non é valida. É responsabilitá dell operatore convalidare la corsa controllando che queste due condizioni si siano verificate. FAM HEX Risultato Ct > 0 Ct=0 Wild Type Ct = 0 Ct > 0 Mutato Ct > 0 Ct >0 Eterozigote Ct = 0 Ct = 0 Inibizione TROUBLESHOOTING Problema 1: Mancanza completa di segnale 1. E stato scelto il canale/filtro sbagliato. 2. Errore nel pipettaggio per omissione di un reagente o del campione. 3. Effetti inibitori del campione: DNA genomico con purificazione insufficiente e/o estrazione insufficiente. 4. Controllare la corretta conservazione del kit. 5. Controllare le prestazioni del termociclatore. Problema 2: Intensità di fluorescenza è troppo bassa 1. Deterioramento del fluoroforo e/o dei primer dovuto ad una cattiva condizione di conservazione del Kit. 2. Quantità di DNA troppo inferiore e/o di bassa purezza. Problema 3: Intensità di fluorescenza variabile 1. La master mix non è stata mescolata bene. 2. Bolle d aria presenti nei tubi da PCR. L acquisto di questo prodotto assicura all acquirente i diritti coperti da alcuni brevetti Roche allo scopo unico di offrire servizi di diagnostica umana in vitro. L acquisto di questo prodotto non concede nessun altro brevetto generale, diritto o licenza di alcun tipo, al di fuori dello specifico diritto di utilizzo. Rev 0 EER

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