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1 Metodi e tecniche di laboratorio II. Genomica APPLICAZIONI DELLA REAL-TIME PCR

2 Diabetes and AM Project workflow

3 Results Transcriptomics at a glance 33 of the 92 (36% 36%) AM genes analyzed showed a significant variation (> 3 folds) of their expression with respect to controls in at least one time point either in both αtc1 and βtc1 or in only one of them; a more consistent induction of the AM in βtc1 (27 genes altered in at least one TP) than in αtc1 (17 gene).

4 Mutation detection kits DxS TheraScreen : K-RAS Mutation Kit (Roche) DxS TheraScreen : K-RAS Mutation Kit (in breve, il kit K-RAS) è un test diagnostico in vitro che consente di identificare sette mutazioni somatiche nell'oncogene K-RAS e di eseguire una valutazione qualitativa dello stato mutazionale. Deve essere utilizzato in ambiente di laboratorio su campioni di DNA estratti da tessuto colorettale fissato in formalina e incluso in paraffina.

5 Spesso nei carcinomi umani vengono riscontrate mutazioni dell'oncogene K-RAS. La presenza di tali mutazioni è correlata all'assenza di una risposta a determinate terapie antitumorali basate sugli inibitori del recettore del fattore di crescita epidermico (terapie anti-egfr) nei pazienti con carcinoma colorettale metastatico.

6 È possibile identificare sette mutazioni nel gene K-RAS su uno sfondo di DNA genomico wild-type utilizzando un saggio PCR real-time basato sulla tecnologia DxS Scorpions. Si tratta di un metodo estremamente selettivo. Se il numero di copie di DNA è sufficiente, è possibile determinare circa l'1% dei mutanti su uno sfondo di DNA genomico wild-type type.

7 Il kit K-RAS è in grado di identificare sette mutazioni K-RAS nei codoni 12 e 13 dell'oncogene K-RAS Il kit K-RAS utilizza i saggi PCR real-time associando due diverse tecnologie: ARMS e Scorpions.

8 La tecnologia ARMS (Amplification Refractory Mutation System) supporta l'amplificazione di specifici alleli o mutazioni. La Taq DNA polimerasi è estremamente efficace per distinguere tra un appaiamento corretto e un appaiamento errato all'estremità in 3 di un primer per PCR. È possibile eseguire un'amplificazione selettiva di specifiche sequenze mutate anche in campioni in cui le sequenze non mutate sono la maggioranza, in quanto: Quando il primer è perfettamente appaiato, l'amplificazione procede con la massima efficienza. Quando la base in 3 presenta un appaiamento errato, si osserva soltanto un'amplificazione di basso livello sullo sfondo.

9 La ARMS (Amplification Refractory Mutation System) PCR è un sistema per identificare mutazioni. Essenzialmente si fanno due PCR in parallelo, una con un primer specifico per l'allele normale e l'altra per quello mutato; il secondo primer è uguale per entrambe. I primer sono fatti, ovviamente, per legarsi solo alla variante allelica di interesse, in modo da non legarsi con l'altra. A questo punto puoi avere 3 casi (supposto che la reazione 1 sia con l'allele normale e la 2 con il mutato): 1) amplifico in 1 ma non in 2 -> omozigote wt 2) amplifico in 2 ma non in 1 -> omozigote mutato 3) amplifico in 1 e in 2 -> eterozigote

10 La tecnologia Scorpions consente di identificare il risultato dell'amplificazione. Il termine Scorpions è utilizzato per descrivere molecole a doppia funzione che contengono un primer per PCR legato covalentemente a una sonda. Il fluoroforo in questa sonda interagisce con un colorante quencher, anch'esso incorporato nella sonda, che sopprime la fluorescenza. Quando si verifica una reazione PCR e la sonda si lega all'amplicon, il fluoroforo e il quencher si separano, determinando un aumento della fluorescenza proveniente dalla provetta della reazione.

11 Analisi dei dati: metodo Ct Nei saggi real-time Scorpions, il numero di cicli di PCR necessari per rilevare un segnale fluorescente al di sopra del segnale dello sfondo è il parametro con cui vengono misurate le molecole bersaglio presenti all'inizio della reazione. Per conoscere i valori Ct dei campioni si calcola la differenza tra il valore Ct del saggio di mutazione e il valore Ct del saggio di controllo per lo stesso campione. I campioni vengono classificati come positivi alla mutazione se restituiscono un valore Ct inferiore al valore Ct 1% per il saggio.

12 Il kit K-RAS contiene otto saggi. Un saggio di controllo. Sette saggi di mutazione. Tutte le miscele di reazione contengono un saggio di controllo esogeno, o controllo interno, marcato con HEX (rilevato dal colorante JOE nel sistema ABI7900). In questo modo viene monitorata la presenza di eventuali inibitori, che potrebbero indurre risultati falsi negativi. Il saggio di controllo, marcato con FAM, serve per ottenere una valutazione del DNA totale in un campione. Il saggio di controllo amplifica una regione dell'esone 4 del gene K-RAS.

13 Ogni saggio di mutazione, marcato con FAM, contiene una molecola Scorpion e un primer ARMS che consentono di distinguere il DNA wildtype dall'eventuale DNA mutante rilevato con il saggio PCR real-time.

14 Protocollo per la valutazione dei campioni La miscela del saggio di controllo in eccedenza, fornita nel kit K-RAS, deve essere obbligatoriamente utilizzata per eseguire la valutazione del DNA totale nei campioni. Il saggio di controllo amplifica una regione dell'esone 4 del gene K-RAS. Preparare i campioni soltanto con il saggio di controllo, utilizzando la miscela standard come controllo positivo e l'acqua come controllo privo di templato. Notare che, per un uso ottimale dei reagenti del kit K-RAS, è opportuno raggruppare i campioni in batch. I controlli devono essere inclusi in tutte le sedute analitiche. Se si analizzano i campioni uno ad uno, il consumo di reagenti aumenta e, di conseguenza, il numero di campioni che è possibile analizzare con il kit K- RAS diminuisce.

15 Aggiungere immediatamente 5 µl di campione, miscela standard o acqua (per i controlli senza templato) nei pozzetti di reazione.

16 Per Assay selezionare Standard Curve (Absolute Quantification). Per Run Mode selezionare Standard Selezionare il pulsante Next per visualizzare una schermata in cui è possibile impostare i rilevatori. Aggiungere all'elenco un rilevatore FAM e un rilevatore JOE, senza impostare i soppressori (Quenchers = none ). Impostare Passive Reference su None e selezionare il pulsante Next. Selezionare l'intera piastra e attivare le caselle relative ai rilevatori FAM e JOE, in modo da garantire che siano monitorati entrambi i coloranti in ogni pozzetto. Selezionare il pulsante Finish.

17 ABI 7900

18 Interpretazione della valutazione dei campioni Valutare i valori Ct del controllo NTC per verificare che non vi siano contaminazioni in grado di indurre un'amplificazione positiva nel canale FAM (Ct < 40) o una reazione fallita del controllo esogeno nel canale HEX (nessun valore Ct), che indicherebbero un problema di impostazione. La miscela standard dovrebbe generare un Ct del saggio di controllo (canale FAM) compreso tra 26 e 29 sullo strumento ABI7900. Scartare i dati se uno di questi 2 controlli della seduta fallisce.

19 Ct del saggio di controllo tra 29 e 35: interpretare i dati con cautela, poiché le mutazioni di livello molto basso potrebbero non essere rilevate. Ct del saggio di controllo tra 35 e 38: nei campioni sono presenti poche copie di DNA amplificabile, mentre le mutazioni possono essere osservate più facilmente quando la maggior parte delle copie è mutata. Ct del saggio di controllo 38: respingere il campione, poiché il DNA è insufficiente e il kit K-RAS non sarà in grado di rilevare le mutazioni.

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21 Analisi dei campioni con lo strumento ABI 7900HT 1. Assicurarsi che il riferimento passivo sia impostato su none nella schermata di ispezione dei pozzetti. 2. Verificare che ogni pozzetto generi un segnale JOE dal saggio di controllo esogeno. a. Se il saggio di controllo esogeno genera un risultato positivo, proseguire con l'analisi. b. Se il saggio di controllo esogeno ha fallito ma la reazione FAM ha prodotto un'amplificazione forte, proseguire con l'analisi perché la causa del fallimento è stata l'attività competitiva della reazione FAM nei confronti della reazione del controllo esogeno. c. Se hanno fallito entrambe le reazioni (FAM e controllo esogeno), è necessario scartare i dati per la possibile presenza di inibitori che possono indurre risultati falsi negativi.

22 3. Nella scheda Amplification Plot selezionare tutti i pozzetti in uso e quindi selezionare il colorante FAM nell'elenco dei rilevatori. Utilizzare l'impostazione della linea di base automatica e il valore Ct manuale, quindi impostare la soglia manualmente al centro della fase esponenziale utilizzando la scala logaritmica per l'asse Y, come descritto nella guida dell'utente dello strumento ABI Analizzare i dati e calcolare il valore Ct nel seguente modo: Ct = [Ct saggio di mutazione campione] [Ct saggio di controllo campione]

23 1. Valori Ct di controllo: 1.1. il valore Ct di controllo deve essere 24 per evitare un sovraccarico del saggio Ct controllo < 29: il kit K-RAS è in grado di rilevare una mutazione minima, fino all'1%, in questi campioni Nei campioni con Ct di controllo 29, il kit non sarà in grado di rilevare una mutazione dell'1%, perché troppo bassa, tuttavia sarà in grado di rilevare mutazioni di livello più alto Ct di controllo 35: nel campione sono presenti solo poche copie di DNA amplificabile, mentre è più probabile osservare le mutazioni se la maggior parte delle copie è mutata Ct di controllo 38: il DNA è insufficiente e i dati non dovranno essere utilizzati.

24 2. Valori Ct della miscela standard 2.1. I valori Ct della miscela standard dovrebbero corrispondere a quelli riportati in Tabella (± 2): La miscela std. è un insieme di frammenti di DNA artificiali, rappresentatitvi dell Ex 4 di K-RAS e dei 7 diversi tratti genomici di K-RAS mutati. Pertanto, in base ai valori descritti in Tabella, costituisce un ulteriore controllo di reazione!

25 3. Valori Ct del campione: 3.1. Se il valore Ct del campione è superiore al valore 1% (come riportato nella Tabella precedente), il campione di DNA viene classificato come negativo alla mutazione o al di sotto dei limiti di sensibilità del kit K-RAS Se il valore Ct del campione è inferiore al valore 1%, il campione di DNA viene classificato come positivo alla mutazione Valori Ct di mutazione maggiori di o uguali a 38 dovranno essere considerati negativi o al di sotto dei limiti di sensibilità del kit.

26 ABI7900

27 Mutation detection kits: Allelic discrimination (Applied Biosystems) Definition: An Allelic Discrimination (AD) assay is a multiplexed (more than one primer/probe per reaction), end-point (data is collected at the end of the PCR process) assay that detects variants of a single nucleic acid sequence. The presence of two primer/probe pairs in each reaction allows genotyping of the two possible variants at the single-nucleic polymorphism (SNP) site in a target template sequence.

28 The actual quantity of target sequence is not determined. For each sample in an AD assay, a unique pair of fluorescent dye detectors is used, for example, two TaqMan MGB probes that target an SNP site. One fluorescent dye detector is a perfect match to the wild type (allele 1) and the other fluorescent dye detector is a perfect match to the mutation (allele 2). The Allelic Discrimination assay classifies unknown samples as: Homozygotes (samples having only allele 1 or allele 2) Heterozygotes (samples having both allele 1 and allele 2)

29 WT probe Mutant probe

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31 About AD Experiments AD Experiment Workflow After you design the experiment and isolate DNA, an AD experiment involves performing: A pre-read run on an AD plate document to determine the baseline fluorescence associated with primers and probes before amplification. An amplification run using an AQ plate document to generate real-time PCR data, which can be used to analyze and troubleshoot the PCR data for the AD experiment, if needed. A post-read run using the original AD plate document. The post-read run automatically subtracts the baseline fluorescence determined during the pre-read run, then assigns allele calls (automatically or manually) using the amplified data.

32 Workflow of the complete process

33 Quality of DNA Ensure that the DNA you use for the AD experiments: Is extracted from the raw material you are testing with an optimized protocol Does not contain PCR inhibitors Has an A260/280 ratio greater than 1.7 Is intact as visualized by gel electrophoresis Has not been heated above 60 C; heat can cause degradation

34 A reaction plate contains the following for an AD assay: No Template Controls (NTCs) Known genomic DNA controls (optional, not included in example experiment) Unknown genomic DNA samples

35 Preparing the Plate 1. Invert the reaction mix tube prepared in the previous section. 2. Centrifuge the tube briefly to spin down the contents and to eliminate air bubbles. 3. Pipette µl of reaction mix into each well in a 96-well reaction plate. 4. Dilute 1 to 20 ng of each purified genomic DNA sample into nuclease-free water for a total sample volume of µl. 5. Pipette µl of the following solutions into the indicated wells:

36 Creating an Allelic Discrimination (AD) Plate Document An AD plate document stores data collected from an AD run for a single reaction plate. An AD plate document also stores other information about the run, including sample names, markers, and detectors.

37 AD plate documents use: Detector In SDS software, a virtual representation of a TaqMan probe and primer set and associated fluorescent dye that detects a single target nucleic acid sequence. Markers A set of two detectors that discriminate between different alleles of a common locus. Allele 1 is detected by one detector (for example, FAM dye), and allele 2 is detected by the second detector (for example, VIC dye). Task A setting that you apply to the markers in a well of a plate document and that determines the way the SDS software uses the data collected from the well during analysis.

38 AD plate document markers use two types of tasks: Unknown Applied to markers of wells that contain PCR reagents for the amplification of target sequences. The SDS software indicates unknown targets with a U. No Template Control Applied to markers of wells that contain no target template. The SDS software indicates no template controls by an NTC. Exercise through SDS v. 2.3 software

39 1) Performing the Pre-Read Run 2) Performing the Amplification Run 3) Performing the Post-Read Run

40 Amplification Run

41 Evaluating Results After identifying the dye components, the SDS software determines the contribution of each dye in the raw data using the multicomponent algorithm. Cluster Variations: The SDS software plots the results of the allelic discrimination run on a scatter plot of Allele X versus Allele Y. Each well of the 96-well reaction plate is represented with an (Undetermined) on the plot. The clustering of points can vary along the horizontal axis (Allele X), vertical axis (Allele Y), or diagonal (Allele X/Allele Y). This variation is due to differences in the extent of reporter dye fluorescent intensity after PCR amplification.

42 Allelic Discrimination Plot

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