DUPLICα RealTime HAEMOCHROMATOSIS H63D Genotyping Kit
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1 DUPLICα RealTime HAEMOCHROMATOSIS H63D Genotyping Kit For Professional Use Only - For SmartCycler EER006032_IFU_REV.00D_ENITA h: EER tests C V INTENDED USE DUPLICa RealTime HAEMOCHROMATOSIS H63D Genotyping Kit is a test with the DNA-based detection of the nucleotide substitution in EDTA collected peripheral whole blood samples. SUMMARY Hereditary haemochromatosis (HH) is an inherited autosomal recessive disorder of iron metabolism. Due to excessive intestinal absorption, iron accumulates in parenchymal cells of the liver, pancreas, heart and other organs with resulting damage to their structure and impairment of their function. It is one of the most common genetic diseases in caucasians with a prevalence of nearly 1 in 300. Although the symptoms of the disease are often nonspecific, much of the organ damage is irreversible once it has occurred. Early detection and therapy is therefore very important as a part of preventive medicine. The discovery of the responsible gene HFE in 1996 enabled molecular analysis to be included in the diagnostic strategy for HH. A number of different HFE mutations have been reported so far. The majority of HH cases (52 96%) in European regions are associated with a homozygous g.845g>a mutation within exon 4 of the HFE gene, which results in amino acid change at position 282 from cysteine to tyrosine (C282Y). A second mutant allele g.187c>g detected with relatively high frequency occurs within the exon 2 of the HFE gene where aspartate replaces histidine at aminoacid position 63 (H63D). The contribution of this allele to iron overload is most relevant in the case of combined heterozygosity with C282Y allele (C282Y/ H63D). The third common mutation of HFE is g.193a>t substitution in exon 2 (serine replaced by cysteine in the protein sequence, S65C) and was shown to be generally benign, although a C282Y/S65C genotype may confer a slight increase in disease risk, contributing to a mild disease phenotype. PRINCIPLE OF THE TEST DUPLICa RealTime HAEMOCHROMATOSIS H63D Genotyping Kit was designed to identify a C187G nucleotide substitution in HFE gene. Two reaction mixes are provided for the amplification: AMPLIFICATION MIX: Hot Start Taq DNA polymerase, nucleotides, MgCl 2 and buffer. OLIGO MIX: primers and fluorogenic probes. In the PCR procedure trace amounts of DNA can be quickly and repeatedly copied to produce a quantity sufficient to investigate using conventional laboratory methods. There are three basic steps involved in the PCR process: denaturation, annealing, extension. Denaturation to promote single-strandedness of the template DNA is achieved by heating to approximately 94 C. The temperature is then lowered significantly to promote base-pairing (annealing) of the primer to the template. The DUPLICa RealTime assay allows the direct detection of a nucleotide substitution by monitoring the increase in fluorescence of a dye-labelled oligonucleotide probe. Two dye-labelled probes are used in this allelic discrimination assay, one probe specific for each allele in the two-allele system. Each probe consists of an oligonucleotide with a 5 -report dye and a 3 -quencher. FAM (6-carboxy-fluorescein) is covalently linked to the 5 -end of the probe for detection of the wild-type allele. HEX (hexachlorofluorescein) is covalently linked to the 5 end of the probe of detection of the mutant allele. Each of these two reporters is quenced by a molecule linked through a linker arm at the 3 -end of each probes. Quencer can mask the reporter
2 fluorescent only when located at a short distance. This happens when the probe is intact. Once amplification occurs, the probe is destroyed by the 5-3 exonuclease activity of the Taq DNA polymerase and the fluorescence will be detected by the optical system. The fluorescence detected by instrument increases the DNA amplification. REAGENTS PROVIDED Each kit contains sufficient reagents to perform 32 tests when used in for 4 sessions with 5 samples,1 normal control (C1),1 mutated control (C2) and one blank reaction each. Kit Content Reagents Amplification mix (400 ml) Oligo Mix* (400 ml) Control 1 (Wild Type) (>50ml) Control 2 (Mutated) (>50 ml) Reaction blank (B) (>50 ml) *store the tube far from light Color Code Blue Cap Green Cap Red Cap Yellow Cap White Cap STORAGE AND HANDLING All reagents must be stored at -22 C/-18 C. All reagents can be used until the expiry date printed on the labels. Euroclone recommends freezing and thawing the products at most six times. Warning: after complete thawing and before using the kit is recommended to spin all reagents and to resuspend them by pipetting 3 times. REAGENTS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED Micropipette 1-10 ml Micropipette ml Sterile filter tips Rack for 0.2 ml tubes Optical tubes or microplate for Real Time PCR Thermal cycler for Real Time PCR PRECAUTIONS AND WARNINGS Do not use the reagents after the expiry date. Mix the reagents of the kit before use. Periodically verify the calibration of micropipettes and instrumentation. Change gloves frequently. Laboratory equipments (pipettes, tips etc.) should not be moved from one working area to another. Periodically wipe the working area with 0,5% sodium hypochlorite. Use powder-free gloves. Do not leave fingerprints on optical caps. Do not write on caps as this may interfere with fluorescence detection. OPERATING PROCEDURE a) DNA purification For genomic DNA purification EuroClone Diagnostica recommends to use: -DUPLICα Prep NA Body Fluid kit ref. EDI for automated purification with DUPLICα Prep Automatic Extractor (ref. EDI001). For manual purification: -Fassst DNA Releaser (EMR057050) for fresh peripheral blood (i.e. stored for up to 24 hours at +2/+8 C). -Spin DNA Purification Kit (EMR061050) for frozen blood or stored at +2/+8 C for more than 24 hours. The range of genomic DNA that can be used for each real time reaction is ng. Attention! Use blood samples in EDTA anti-coagulant solution.
3 b) Thermal Cycler set up Refer to the specific handbook of the equipment used but be sure to set the following thermal profile. Thermal Profile Time Temperature Cycles 10 min 95 C 1 15 sec 95 C sec 58 C Fluorescent Reading Switch on the instrument and set up the thermal profile before preparing the reaction mix. c) Preparation of PCR mix For each experiment prepare a PCR mix for the 2 controls (1 and 2), 1 reaction blank and n+1 samples. The reagents of the PCR mix have to mixed under this ratio: REAGENT VOLUME (ml) Amplification mix 10 Oligo mix 10 Extracted DNA 5 After a mix preparation, aliquot 20μl of Master Mix in the tubes or in the microplates for PCR than add in each tube 5μl (correspondent to ng) from the extracted DNA or control DNA and set in order the tubes in the instrument and start the program of amplification setting before. At the end of the program remove the tubes from the thermocycler. d) ANALYSIS and INTERPRETATION of the RESULTS The fluorescence in each channel indicates the hybridisation of the allelic specific probes: Channel 1 for FAM= Wild Type probe and Channel 2 for HEX= Mutated probe. If a sample shows a fluorescence in FAM, the sample has Wild Type allele. If a sample shows a fluorescence in HEX, the sample has Mutated allele. Therefore, if a signal only a FAM signal (Ct > 0) is detected the sample is Homozygous Wild Type, whereas if a signal only a HEX signal (Ct > 0) is detected the sample is Homozygous Mutated. Finally, if both FAM and HEX are detected the sample is Heterozygous. Condition in which no signal is detected indicates PCR inhibition. In this case, the sample must be re-extracted. Control 1 (Wild Type) and Control 2 (Mutated) are provided in order to properly set the threshold line before samples analysis. After the run, the threshold line has to be set so that: Control 1 results positive in FAM and negative in HEX, whereas Control 2 results positive in HEX and negative in FAM. If these two conditions have been met, the run is valid and it is possible to analyse the data; otherwise the run is not valid. It is responsibility of the user to validate the run by checking that these conditions have been met. Result Interpretation Table Ct FAM channel Ct HEX/VIC channel Results detected not detected Wild Type not detected detected Mutated detected detected Heterozygous not detected not detected Inhibition
4 TROUBLESHOOTING Problem 1: No signal 1. Wrong channel/filter was chosen. 2. Pipetting error due to omitted reagents or samples. 3. Inhibitory effect of the sample: genomic DNA with a insufficient purification and/or insufficient extraction. 4. Check if the kit was correctly stored. 5. Verify the performance of the thermal cycler. Problem 2: Fluorescence intensity too low 1. Deterioration of dyes and/or primers in the reagents due to unsuitable storage conditions. 2. Very low starting amount and/or purity of genomic DNA. Problem 3: Fluorescence intensity varies 1. The prepared PCR master mix is not well mixed. 2. Air bubbles trapped in the PCR tubes. THE PURCHASE OF THIS PRODUCT GRANTS THE PURCHASER RIGHTS UNDER CERTAIN ROCHE PATENTS TO USE IT SOLELY FOR PROVIDING HUMAN IN VITRO DIAGNOSTIC SERVICES. NO GENERAL PATENT OR OTHER LICENSE OF ANY KIND OTHER THAN THIS SPECIFIC RIGHT OF USE FROM PURCHASE IS GRANTED HEREBY
5 DUPLICα RealTime HAEMOCHROMATOSIS H63D Genotyping Kit EER006032_IFU_REV.00D_ENITA h: EER tests Ad esclusivo uso professionale - SmartCycler C V FINALITA D USO DUPLICa RealTime HAEMOCHROMATOSIS H63D Genotyping Kit è un test di amplificazione di acidi nucleici in vitro per la ricerca della variante allelica C187G nel gene umano HFE in DNA genomico estratto da campioni clinici di sangue intero periferico raccolto in EDTA. INTRODUZIONE L emocromatosi ereditaria (HH) è una malattia ereditaria autosomica recessiva del metabolismo del ferro. A causa di un eccessivo assorbimento intestinale, il ferro si accumula nelle cellule del parenchima del fegato, pancreas, cuore e altri organi, con conseguenti danni alla loro struttura e la compromissione della loro funzione. Si tratta di una delle più comuni malattie genetiche nella popolazione caucasica, con una prevalenza di circa 1 su 300. Anche se i sintomi della malattia sono spesso aspecifici, gran parte del danno all organo è irreversibile una volta che si è verificato. Una diagnosi e una terapia precoce sono quindi molto importanti per una efficace azione di medicina preventiva. Nel 1996 la scoperta del gene responsabile HFE, ha fatto in modo che l analisi molecolare potesse essere inclusa nella strategia diagnostica per la HH. Finora sono state segnalate un certo numero di differenti mutazioni del gene HFE. La maggior parte dei casi di HH (52-96%) nelle regioni europee sono associati ad una mutazione in omozigosi g.845g>a all interno dell esone 4 del gene HFE, che si traduce nel cambiamento di un aminoacido in posizione 282 da cisteina in tirosina (C282Y). Un secondo allele mutante g.187c>g rilevato con frequenza relativamente elevata si verifica all interno del esone 2 del gene HFE dove un aspartato sostituisce una istidina in posizione 63 (H63D). Il contributo di questo allele al sovraccarico di ferro nell organismo, è più rilevante nel caso di eterozigosi combinata con l allele C282Y (C282Y/H63D). La terza mutazione comune di HFE è la sostituzione g.193a>t nell esone 2 (una serina sostituita da una cisteina, S65C) ed ha dimostrato di essere generalmente benigna, anche se un genotipo C282Y/S65C può conferire un leggero aumento del rischio di malattia, contribuendo ad un fenotipo di malattia lieve. PRINCIPIO DEL TEST DUPLICa RealTime HAEMOCHROMATOSIS H63D Genotyping Kit è stato disegnato per riconoscere la puntiforme sostituzione nucleotidica A193T nel gene HFE. I reagenti per la reazione di amplificazione sono pronti all uso e suddivisi in due mix di reazione: AMPLIFICATION MIX, contenente Hot Start Taq DNA polimerasi, nucleotidi, MgCl 2 e buffer. OLIGO MIX, contenente i primers e le sonde fluorogeniche. La polymerase chain reaction (PCR) è una reazione che permette di amplificare una sequenza target di DNA generando numerose copie di un templato. La reazione si compone generalmente di tre fasi: denaturazione del DNA, annealing (appaiamento dei primers) ed estensione. Queste fasi, che si realizzano attraverso riscaldamenti e raffreddamenti automatizzati mediante un termociclatore, rappresentano un ciclo di amplificazione; la ripetizione in continuo del ciclo
6 base porta alla produzione di miliardi di frammenti del DNA in studio. Alla denaturazione del DNA che avviene ad alte temperature segue l appaiamento di specifici primers al DNA target. Durante la fase di estensione l enzima Taq polimerasi riconosce le estremità 3 di questi primers ed utilizzando i nucleotidi trifosfati (dntps) polimerizza il DNA, creando in questo modo numerose copie del templato. In tutti i sistemi di PCR Real-Time la rivelazione dell amplificato avviene utilizzando un marcatore fluorescente che nelle sonde fluorogeniche viene chiamato reporter. I kit DUPLICa RealTime permettono di rilevare una mutazione puntifome seguendo direttamente la crescita della fluorescenza associata a sonde oligonucleotidiche marcate con fluorofori. Due sonde oligonucleotidiche sono usate in questo saggio di discriminazione allelica, ed ognuna di esse consiste in una sequenza oligonucleotica che presenta all estremità 5 un marcatore fluorescente chiamato «reporter», mentre all estremità 3 lega un secondo marcatore chiamato «quencher». Il fluoroforo FAM (6-carbossi-fluoresceina) è covalentemente legato all estremità 5 della sonda rilevante l allele normale (Wild-Type); il fluoroforo HEX è covalentemente legato all estremità 5 della sonda rilevante l allele mutato. In entrambe le sonde i reporter sono mascherati (quenching) da una molecola dark quencher legata all estremità 3 della sonda. Il quencher maschererà il segnale del reporter quando queste due molecole si trovano in prossimità, ovvero quando la sonda è intatta. Durante l amplificazione la sonda è distrutta dell attività 5-3 esonucleasica della Taq DNA polimerasi e la fuorescenza potrà essere rilevata dal sistema ottico dello strumento. La fluorescenza rilevata dallo strumento aumenta parallelamente all amplificazione del DNA. COMPOSIZIONE DEL KIT Questo Kit è stato disegnato per poter eseguire 32 reazioni se utilizzato in 4 sessioni analitiche con 5 campioni, 1 controllo Wild Type (Controllo 1), 1 controllo Mutato (Controllo 2) e 1 bianco di reazione ciascuna. Contenuto del Kit Reagenti Amplification mix (400 ml) Oligo Mix* (400 ml) Control 1 (Controllo Wild Type) (>50 ml) Control 2 (Controllo Mutato) (>50 ml) Codice colore Tappo Blu Tappo Verde Tappo Rosso Tappo Giallo Reaction blank (B) (>50 ml) * la provetta deve essere conservata lontano dalla luce Tappo Bianco CONSERVAZIONE E STABILITÀ Tutti i reagenti devono essere conservati a -22 C/-18 C fino alla data di scadenza riportata sulla confezione. EuroClone Diagnostica raccomanda di non scongelare e ricongelare il prodotto più di sei volte. Attenzione: dopo il completo scongelamento e prima dell utilizzo si raccomanda di centrifugare tutti i reagenti e risospenderli pipettandoli 3 volte. MATERIALE NECESSARIO NON FORNITO Micropipette 1-10 ul Micropipette ul Puntali con filtro Rack per provette da 0.2 ml Micropiastra ottica per Real Time PCR Provette per PCR da 0.2 ml con tappi ottici Termociclatore per Real Time PCR PRECAUZIONI E RACCOMANDAZIONI DI UTILIZZO La strumentazione di laboratorio (pipette, provette, etc.) non deve circolare da una stazione di lavoro all altra. Non utilizzare reagenti dopo la data di scadenza. Miscelare i reagenti del kit prima dell utilizzo. Periodicamente verificare la precisione delle pipette e il corretto funzionamento della strumentazione. Cambiare spesso i guanti. Lavare periodicamente il banco di lavoro con ipoclorito di sodio al 0,5%. Utilizzare i guanti senza talco e evitare di lasciare impronte sui tappi ottici. Non scrivere sui tappi, questo potrebbe creare dei problemi nella rivelazione della fluorescenza.
7 PROTOCOLLO OPERATIVO a) Purificazione del DNA Genomico Per la purificazione del DNA genomico EuroClone Diagnostica raccomanda: - DUPLICα Prep Body Fluid kit (ref. EDI004200) per DUPLICa PREP Automatic Extractor (ref. EDI001) nel caso di purificazione automatica. Nel caso di purificazione manuale: -Fassst DNA Releaser (ref. EMR057050) per sangue fresco (conservato fino a un massimo di 24 ore a +2/+8 C). -EuroClone Diagnostica Spin DNA Purification Kit (ref. EMR061050) per sangue congelato o conservato a +2/+8 C per più di 24 ore. La quantità di DNA da utilizzare per ogni reazione è di ng. Attenzione! Utilizzare sangue in soluzione anticoagulante EDTA. b) Programmazione del termociclatore Riferirsi allo specifico manuale dello strumento ma assicurarsi di impostare il seguente profilo termico: Profilo Termico Tempo Temperatura Cicli 10 min 95 C 1 15 sec 95 C sec 58 C Acquisire Fluorescenza Prima di allestire la miscela di reazione, accendere e programmare il termociclatore per Real Time PCR. c) Preparazione della PCR mix Per ogni esperimento preparare una mix di PCR per 2 controlli (Control1 e Control 2), 1 bianco di reazione (B) e n+1 campioni. La mix deve essere preparata miscelando i reagenti nei rapporti volumetrici di seguito indicati: REAGENTI VOLUME (ml) Amplification mix 10 Oligo mix 10 DNA Estratto 5 Terminata la preparazione della mix, aliquotare 20ul della Master Mix nelle provette o nella micropiastra per PCR e aggiungere in ogni provetta/pozzetto 5ul di DNA estratto e dei controlli; disporre i le provette o la piastra all interno dello strumento e avviare il programma di amplificazione precedentemente impostato. Al termine del protocollo di amplificazione, rimuovere le provette o la piastra dal termociclatore. d) ANALISI ed INTERPRETAZIONE dei RISULTATI La fluorescenza di ogni canale indica l ibridazione di una sonda specifica per un allele: il CANALE 1 per La fluorescenza di ogni canale indica l ibridazione di una sonda specifica per un allele: il CANALE 1 per FAM= sonda Wild Type, mentre il Canale 2 per HEX/VIC= sonda Mutata. Se un campione mostra una fluorescenza in FAM, il campione ha un allele Wild Type. Se il campione mostra una fluorescenza in HEX/VIC, il campione ha un allele Mutato. Perció, se viene rilevato solo il segnale FAM (Ct > 0) il campione é Omozigote Wild Type; mentre se viene rilevato solo il segnale HEX/VIC (Ct > 0) il campione é Omozigote Mutante. Infine, se sono rilevati sia FAM che HEX/VIC il campione é Eterozigote. La PCR risulta inibita se non viene rilevato nessun segnale. Sono forniti il Controllo 1 (Wild Type), il Controllo 2 (Mutato) e il Bianco di Reazione (B) per impostare correttamente la linea soglia prima di analizzare i campioni. Dopo la corsa, la linea soglia deve essere impostata affinchè: il Controllo 1 risulti positivo in FAM e negativo in HEX/VIC, mentre il Controllo 2 risulti positivo in HEX/VIC e negativo in FAM. Il Bianco di Reazione deve essere negativo sia nel canale FAM che nel canale HEX/VIC. Se si verificano queste tre condizioni la corsa é valida ed é possible analizzare i dati, altrimenti la corsa non é
8 valida. É responsabilitá dell operatore convalidare la corsa controllando che queste condizioni si siano verificate. Tabella di Interpretazione dei Risultati Ct FAM channel Ct HEX/VIC channel Risultato rilevato non rilevato Wild Type non rilevato rilevato Mutato rilevato rilevato Eterozigote non rilevato non rilevato Inibizione TROUBLESHOOTING Problema 1: Mancanza completa di segnale 1. E stato scelto il canale/filtro sbagliato. 2. Errore nel pipettaggio per omissione di un reagente o del campione. 3. Effetti inibitori del campione: DNA genomico con purificazione insufficiente e/o estrazione insufficiente. In questo caso provare a diluire il campione 1:10 prima di ritestarlo; se questo non dovesse essere sufficiente ri-estrarre il campione. 4. Controllare la corretta conservazione del kit. 5. Controllare le prestazioni del termociclatore. Problema 2: Intensità di fluorescenza troppo bassa 1. Deterioramento del fluoroforo e/o dei primer dovuto ad una cattiva condizione di conservazione del Kit. 2. Quantità di DNA troppo bassa e/o di scarsa purezza. Problema 3: Intensità di fluorescenza variabile 1. La master mix non è stata mescolata bene. 2. Bolle d aria presenti nei tubi da PCR. L ACQUISTO DI QUESTO PRODOTTO ASSICURA ALL ACQUIRENTE I DIRITTI COPERTI DA ALCUNI BREVETTI ROCHE ALLO SCOPO UNICO DI OFFRIRE SERVIZI DI DIAGNOSTICA UMANA IN VITRO. L ACQUISTO DI QUESTO PRODOTTO NON CONCEDE NESSUN ALTRO BREVETTO GENERALE, DIRITTO O LICENZA DI ALCUN TIPO, AL DI FUORI DELLO SPECIFICO DIRITTO DI UTILIZZO. EER006032_IFU_REV.00D_ENITA /1
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