Corso di Lingua Inglese

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1 Corso di Lingua Inglese Si ricorda a tutti gli studenti del 3 anno (immatricolati nell aa 2014/2015) che per potersi laureare dovranno superare la prova di idoneità in Lingua Inglese. Il Corso di Lingua inglese è tenuto dalla Prof.ssa Maria Cristina Grande e si svolgerà il Venerdi dalle in Aula Pasquini Edificio di Zoologia. mariacristina.grande@uniroma1.it

2 Il CLONAGGIO consiste nella moltiplicazione di un frammento di DNA appartenente ad un dato genoma. Ciò è possibile grazie a delle endonucleasi che provocano delle rotture interne a doppio filamento sul DNA in corrispondenza di specifiche sequenze nucleotidiche (Enzimi di Restrizione) e a una piccola molecola di DNA che serve da carrier (Vettore di Clonaggio). Successivamente si avrà la replicazione di questo DNA ricombinante (Clone) milioni di volte fornendo un gran numero di copie del clone stesso. Il risultato è l amplificazione selettiva di quel determinato frammento di DNA

3 ER di classe II Esistono tre classi principali di ER: quelli di tipo I, di tipo II e di tipo III. tipo I: attività di restrizione e metilazione sulla stessa molecola. Tagliano il DNA in modo casuale lontano dal sito di riconoscimento. tipo III: attività di restrizione e metilazione su sub-unità diverse. Non garantiscono sufficiente specificità di taglio. Nessuna delle due classi viene utilizzata in biologia molecolare a causa della loro aspecificità di taglio. Gli enzimi di classe II, invece, portano le due attività su molecole distinte e sono caratterizzati da una elevata specificità di taglio.

4 Enzimi di restrizione La scoperta degli enzimi di restrizione, avvenuta negli anni 70, è valsa ai suoi scopritori, Arber, Nathans e Smith, il conferimento del premio Nobel per la Fisiologia e Medicina. Gli ER riconoscono di solito sequenze palindromiche, tagliandole in posizioni specifiche. Una palindrome è una parola che si legge allo stesso modo sia da destra che da sinistra, per es. la parola radar oppure ala. Un sito di riconoscimento palindromico è una sequenza in cui il filamento superiore e inferiore, letti in direzione 5-3, sono uguali. Per es. la sequenza: 5 -GAATTC-3 3 -CTTAAG-5

5 Gli ER furono scoperti studiando il fenomeno della restrizione-modificazione. L introduzione in E.coli di DNA esogeno risultava nella sua rapida frammentazione in piccoli frammenti (restrizione). L analisi di un DNA virale rivelatosi capace di resistere alla degradazione, rivelò la presenza di alcune basi metilate. Si scoprì, quindi, l esistenza in E.coli di sistemi di restrizione/ modificazione capaci di metilare specifiche basi e, contemporaneamente, di tagliare le stesse basi quando non metilate. Con questo sistema E.coli è capace di degradare DNA esogeno tagliandolo in specifici siti di riconoscimento, mentre gli stessi siti presenti sul DNA endogeno non sono tagliati perché preventivamente metilati.

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7 Alcuni ER, isolati da batteri differenti, riconoscono sequenze di taglio Estremità diverse, ma blunt che producono estremità compatibili, come EcoRI e MefI Il risultato però..

8 Isoschizomeri Alcuni ER, detti isoschizomeri, isolati da batteri differenti, riconoscono la stessa sequenza di taglio. Alcuni di essi tagliano la sequenza nello stesse posizioni, mentre altri tagliano in posizioni differenti (Acc65I e KpnI) estremità 5 protruding estremità 3 protruding

9 Specificità e frequenza di taglio Il numero di basi riconosciute determina la frequenza media di taglio e la dimensione media dei frammenti generati. Enzimi che riconoscono sequenze più corte tagliano più frequentemente e quindi producono frammenti più numerosi e mediamente più corti, degli enzimi che riconoscono sequenze più lunghe (8 bp rare cutter). Ad es. l enzima AluI riconosce la sequenza AGCT. Assumendo che la distribuzione delle 4 basi sia casuale, in ogni posizione del DNA ci sarà 1 probabilità su 4 (25%) di trovare una A. Analogamente 1 probabilità su 4 di trovare una G, quindi la probabilità di trovare la sequenza AGCT sarà uguale a 1/4 n, dove n = numero di nucleotidi del sito di riconoscimento. 1/4 4 =1/256 basi, 1/4 6 = 1/4096, 1/4 8 = 1/55536 La maggior parte funziona in tamponi a ph 7/8, a 37 C. Un unità di un enzima di restrizione è la quantità di enzima richiesta per digerire completatamente 1 µg di DNA in un ora.

10 Estrazione di frammenti di DNA da gel Dopo aver digerito un DNA con enzimi di restrizione ed averne separato i frammenti risultanti su gel di agarosio, è possibile excidere dal gel, con un bisturi, specifiche bande di interesse e purificarle da gel. Esistono molti sistemi per purificare bande da gel, tra cui: elettroeluizione colonne a scambio ionico gel-filtration agarosio a basso punto di fusione

11 La Ligasi

12 La ligazione La ligazione va ottimizzata rispetto a: temperatura e tempo di reazione concentrazione del DNA: totale, dell inserto e del vettore. Temperatura Calcolata tenendo in considerazione che la stabilizzazione dell appaiamento tra estremità coesive è ottimale a basse temperature, mentre l attività enzimatica della ligasi è massima a 37 C. Si utilizza spesso una temperatura di 16 C per 12 ore. Concentrazione Basse concentrazioni di DNA totale favoriscono le reazioni di primo ordine (intramolecolare) come la ricircolarizzazione del vettore. Aumentare la concentrazione totale incrementando la concentrazione di vettore, peggiora la situazione, ma aumentare la concentrazione dell inserto aumenta la probabilità di avere vettori con inserti multipli.

13 In genere [DNA Tot] ng/µl rapporti molari I:V da 3:1 a 1:1 Vol. fin.= µl. N.B. si devono utilizzare i rapporti molari moli = g/pm Normalmente si considera statisticamente uguale il PM di ogni singolo paio di basi il cui peso medio è 660 Dalton, quindi moli = g/ 660 x bp Metafora delle pere da 100gr o da 250gr

14 Esempio Vogliamo ligare 50 ng di un vettore di 10 Kb con un inserto di 1 Kb, utilizzando rapporti molari I/V 1:1 e 3:1, in due reazioni separate. Rapporto I/V= 1:1 50 ng/10 kb = x ng/1 kb x ng = 50/10 x = 5ng Rapporto I/V= 3:1 x = 15 ng

15 Fosfatasi alcalina Quando vettore ed inserto sono tagliati con lo stesso enzima di restrizione, non si riesce ad evitare un elevata frequenza di ricircolarizzazione del vettore. P-5 AATTC HO-3 inserto TTAAG -5 P vettore TTAAG -5 P P-5 AATTC HO-3 vettore Una strategia consiste nell utilizzo di una fosfatasi, come ad esempio la fosfatasi alcalina (BAP), un enzima che rimuove il gruppo fosfato al 5 impedendo così l azione della ligasi. La defosforilazione del vettore con una fosfatasi impedisce la ricircolarizzazione del vettore, abbassando sensibilmente il background.

16 P-5 AATTC HO-3 inserto HO- AATTC HO-3 TTAAG -5 P vettore vettore TTAAG -OH + ligasi vettore OH HO inserto OH HO vettore

17 Clonaggio di un frammento con estremità blunt in un vettore con estremità sticky 5 protruding (es.ecori) FILLING IN Consiste nel riempire un estremità sporgente al 5 con la Klenow, una DNA polimerasi I modificata, in quanto priva dell attività 5-3 esonucleasica dttp 5 P G datp dgtp 5 P G TTAAG C AATTC 5 P C AATTC 5 P

18 Clonaggio di un frammento con estremità blunt in un vettore con estremità sticky 3 protruding (es. PstI) TRIMMING Non è possibile adoperare Klenow che, come tutte le polimerasi, sintetizza solo in direzione 5-3. Useremo, quindi l attività 3-5 esonucleasica di un enzima come la DNA polimerasi del fago T4. 5 P CTGCA G 5 P T4 DNA pol. 5 P C G 5 P

19 Clonaggio di un frammento con estremità blunt in un vettore con estremità sticky (BamHI), oppure con estremità blunt N.B. L efficienzà delle ligazioni blunt è abbastanza più bassa di quella di ligazioni con estremità sticky LINKERS LINKER: corti oligonucleotidi autocomplementari con un sito di restrizione 5 -CCGGATCCGG-3 Questo corto oligo ds va ligato con il frammento con blunt end Frammento SmaI + CCGGATCCGG-3 GGCCTAGGCC-5 Frammento SmaI CCGGATCCGG-3 GGCCTAGGCC-5 Frammento SmaI CCGGATCCGG-3 GGCCTAGGCC-5 + BamHI Frammento SmaI CCG-3 GGCCTAGGCC-5

20 Clonaggio di un frammento con estremità sticky BamHI in un vettore con estremità sticky EcoRI ADAPTERS coppie di brevi oligonucleotidi parzialmente complementari con estremità coesive differenti 5 -GATCCCCGGG-3 3 -GGGCCCTTAA-5 5 GATC 3 3 inserto CTAG 5 5 -GATCCCCGGG-3 3 GGGCCCTTAA-5 5 AATT 3 vettore 3 AATT 5 Annealing & ligazione GATC inserto GATCCCCGGG AATT CTAG GGGCCCTTAA vettore 3 AATT 5

21 Esercizio: 1. Dire che tipo di estremità producono i seguenti enzimi 2. Disegnare le estremità prodotte 3. Disegnare un linker EcoRI 4. Disegnare un adapter PstI-EcoRI Risposta 3 5 -GGATCC-3 3 -CCTAGG-5 5 -GAATTC-3 3 -CTTAAG-5 5 -CTGCAG-3 3 -GACGTC-5 BamHI EcoRI PstI 5 -AAAGAATTCTTT-3 5 -AAAGAATTCTTT-3 3 -TTTCTTAAGAAA-5 Risposta 4 5 -AATTCTTTCCCCTGCA-3 3 -GAAAGGGG-5 5 -GTTAAC-3 3 -CAATTG-5 SmaI 5 -AATTCTTTCCCCTGCA-3 3 -GAAAGGGG-5