RIASSUNTO E SPIEGAZIONE

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1 Simplexa BKV REF MOL2300 Rev. E Saggio basato su PCR in tempo reale destinato alla quantificazione in vitro del virus BK (BKV). Per uso diagnostico in vitro USO PREVISTO Il saggio Simplexa BKV di Focus Diagnostics è destinato alla quantificazione in vitro degli acidi nucleici del virus BK (BKV) in campioni di urina e/o di plasma mediante il 3M Integrated Cycler. Questo dosaggio, da utilizzarsi insieme all esame clinico e ad altri marcatori di laboratorio della progressione della malattia, è utile nella gestione clinica di pazienti infettati da BKV. Il saggio non è indicato per lo screening di donatori ed è esclusivamente per uso professionale. RIASSUNTO E SPIEGAZIONE Il virus BK (BKV) è un tipo di poliomavirus umano non rivestito, dotato di genoma a DNA circolare a doppio filamento di bp. Il BKV è stato identificato come appartenente alla famiglia dei poliomavirus nel 1971, dopo essere stato isolato dall urina di un paziente sottoposto a trapianto di rene. Il tasso mondiale di sieroprevalenza nell adulto è compreso tra il 70 e il 90% 1. Generalmente la sieroconversione avviene nell infanzia entro i 4 anni di età 2-7. Nell infezione primaria il virus passa dal circolo sanguigno nel rene, dove può produrre un infezione clinicamente latente 8. Solitamente il virus rimane dormiente, ma in determinate circostanze, ad esempio nei pazienti immunosoppressi o in caso di gravidanza, si può verificare una riattivazione intermittente. La riattivazione può produrre una varietà di manifestazioni, che vanno dalla viremia o viruria in forma subclinica, alla nefropatia e alla stenosi uretrale osservata in pazienti sottoposti a trapianto. La comparsa di una malattia clinicamente manifesta dovuta all infezione da BKV è rara ed è correlata al grado di immunosoppressione. Attualmente, oltre alla PCR, non esistono altri metodi affidabili di rilevamento e quantificazione del BKV. La coltura virale raramente è utile, perché, data la crescita lenta e la necessità di linee cellulari specializzate 9, non permette di ottenere in maniera tempestiva informazioni per la gestione del paziente. L uso di saggi sierologici è di utilità limitata, in quanto la maggior parte della popolazione è sieropositiva e la comparsa di una malattia legata al BKV dipende dalla riattivazione di un'infezione latente. 10 PRINCIPI DELLA PROCEDURA Il test è basato su un sistema di amplificazione e identificazione tramite PCR in tempo reale, che sfrutta una sonda-primer bifunzionale fluorescente per il rilevamento del DNA del BKV in campioni di urina e di plasma. Il saggio prevede due fasi principali: (1) estrazione del DNA dai campioni ottenuti dai pazienti e (2) utilizzo di una sonda-primer bifunzionale fluorescente che, insieme a un primer inverso, permette di amplificare un target specifico (per ciascun analita e per il controllo interno). Il saggio fornisce un risultato univoco; per identificare il DNA virale nel campione si utilizza come bersaglio una regione ampiamente conservata del gene VP2 del genoma di BKV. Un controllo interno permette di monitorare il processo di estrazione e rilevare l eventuale inibizione della PCR. Il segnale di amplificazione ottenuto per ogni campione viene messo a confronto con una curva di calibrazione e quantificato. MATERIALI FORNITI Il kit Simplexa TM BKV di Focus Diagnostics contiene reagenti sufficienti per 100 reazioni. Descrizione del kit Nome del componente REF SIMBOLO CE SULL ETICHETTA Nome abbreviato Colore Numero di del tappo flaconcini Reazioni per flaconcino /kit Volume per flaconcino Simplexa BKV Primer Mix MOL2301 REAG A PM Marrone 2 50/ µl Simplexa Master Mix MOL2000 REAG B MM Verde 2 50/ µl Simplexa Extraction & Amplification Control DNA MOL9001 CONTROL IC IC Blu 3 50/ µl Simplexa BKV Low Positive Control MOL2302 CONTROL + LPC Bianco 6 1/6 200 µl Simplexa BKV High Positive Control MOL2303 CONTROL ++ HPC Rosso 6 1/6 200 µl

2 Simplexa BKV pagina 2 Componente del kit Simplexa BKV Primer Mix (PM) (Miscela di primer) Descrizione del componente Descrizione Primer marcati con colorante fluorescente specifici per il rilevamento e la quantificazione di BKV e per il controllo interno. Target Fluoroforo sonda (colorante) Eccitazione Emissione Gene bersaglio BKV FAM 495 nm 520 nm Gene VP2 Controllo interno Q nm 670 nm Gene di A. thaliana Simplexa Master Mix (MM) (Miscela master) Simplexa Extraction & Amplification Control DNA (IC) (DNA di controllo per l estrazione e l amplificazione) Simplexa BKV Low Positive Control (LPC) (Controllo positivo basso) Simplexa BKV High Positive Control (HPC) (Controllo positivo alto) Simplexa BKV Barcode Card (Card con codice a barre) DNA polimerasi, tampone e dntp. Un frammento di DNA di 577 bp derivato dal gene codificante per la N-metiltransferasi della subunità grande della ribulosio-1,5-bifosfato carbossilasi/ossigenasi della pianta di Arabidopsis thaliana. Amplicone di BKV in una matrice di base di origine umana. Amplicone di BKV in una matrice di base di origine umana. Parametri specifici per il dosaggio. MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI 1. Simplexa BKV Quantitation Standard Set (set di standard di quantificazione) ( REF MOL2310) 2. 3M Integrated Cycler con software Integrated Cycler Studio versione 3.0 o superiore 3. Universal Discs per utilizzo su Integrated Cycler 4. Nastro di copertura per Universal Discs 5. a Sistema Roche MagNA Pure LC e materiali di consumo associati. 6. a Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (numero di catalogo Roche ) 7. b Strumento biomérieux NucliSENS easymag con reagenti e materiali di consumo associati 8. b Pipetta multicanale Biohit/bioMerieux 9. b Piastra con strip per saggio ELISA 10. Micropipette singole, multicanale e/o a ripetizione con range di accuratezza di 1-10 µl, µl e µl 11. Congelatore (scongelamento manuale) impostato tra -10 e -30 C (per la conservazione dei componenti del kit) 12. Congelatore (scongelamento manuale) impostato tra -10 C e -30 C (per la conservazione dei campioni) 13. Frigorifero da 2 a 8 C (per i campioni e i componenti del kit scongelati) 14. Cabina di biosicurezza (cappa a flusso laminare) per le estrazioni 15. Microcentrifuga 16. Miscelatore vortex 17. Puntali sterili monouso RNAsi/DNAsi-free con filtro barriera per aerosol per micropipettatore 18. Provette da 1,5 ml in polipropilene per microcentrifuga (provette RNAsi/DNAsi-free consigliate, ma non necessarie) e rack dedicato 19. Guanti monouso senza talco 20. Acqua priva di nucleasi, usata durante l estrazione e come No Template Control (NTC, controllo privo di templato) 21. Rack di raffreddamento per provette da microcentrifuga da 1,5 ml a Da utilizzarsi con la metodica di estrazione Roche MagNA Pure LC b Da utilizzarsi con la metodica di estrazione biomérieux easymag PERIODO DI VALIDITÀ E MANIPOLAZIONE 1. Conservare i reagenti ad una temperatura compresa tra -10 e -30 C (non usare un congelatore no-frost). 2. Prima dell uso, lasciare scongelare i reagenti a temperatura ambiente (tra 18 e 25 C circa). 3. Non utilizzare i kit o i reagenti dopo la data di scadenza. 4. Dopo l aggiunta della miscela master, utilizzare la miscela di reazione entro un ora. Conservare la miscela di reazione tra 2 e 8 C fino al momento dell impostazione della PCR. 5. Una volta scongelati, conservare la miscela di primer, la miscela master e il DNA del controllo di estrazione e amplificazione a una temperatura compresa tra 2 e 8 C per non oltre 30 giorni. 6. Non ricongelare la miscela di primer, la miscela master, il DNA del controllo di estrazione e amplificazione o i controlli positivi. 7. Non utilizzare insieme reagenti provenienti da lotti di kit differenti.

3 Simplexa BKV pagina 3 AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Per uso diagnostico in vitro. 2. Tutti i materiali di origine umana devono essere trattati come potenzialmente infettivi. I materiali di partenza da cui è stato derivato questo prodotto (inclusi i controlli) sono stati sottoposti a screening per l antigene di superficie dell epatite B e per la presenza di anticorpi contro l epatite C e HIV-1/2 (AIDS) con metodi approvati dalla FDA, e sono risultati negativi ai test. Siccome, però, nessun metodo conosciuto offre la totale certezza che i prodotti derivati da sangue umano non possano trasmettere questi o altri agenti infettivi, tutti i controlli, i campioni di siero e l attrezzatura che venga a contatto con questi campioni devono essere considerati potenzialmente infettivi e decontaminati o smaltiti seguendo le precauzioni necessarie per i materiali che pongono un rischio biologico. I CDC (Centers for Disease Control) e i National Institutes of Health statunitensi raccomandano di manipolare gli agenti potenzialmente infettivi in strutture con un livello di biosicurezza 2, 11,12 3. Durante la manipolazione dei reagenti del kit, indossare dispositivi di protezione individuale quali, in modo non limitativo, guanti e camice da laboratorio. Lavarsi bene le mani una volta terminato il test. 4. Non pipettare con la bocca. 5. Non fumare, bere, mangiare, manipolare lenti a contatto o truccarsi nelle aree in cui siano in utilizzo i reagenti del kit e/o campioni umani. 6. Smaltire i reagenti del kit non utilizzati e i campioni umani in base alle normative locali, provinciali e nazionali. 7. Il flusso di lavoro in laboratorio deve procedere in maniera unidirezionale, partendo dalle aree di preamplificazione e spostandosi poi nell'area di amplificazione/rilevamento: segue la sequenza di operazioni da eseguire dall estrazione del campione fino all amplificazione con PCR in tempo reale: Iniziare con l estrazione del campione, quindi configurare lo strumento per la PCR in tempo reale, preparare i reagenti e infine eseguire l amplificazione mediante PCR in tempo reale. Non scambiare forniture e apparecchiature tra le aree dedicate all estrazione e alla preparazione del campione. Non effettuare spostamenti tra un area e l altra. Le forniture e le apparecchiature usate per la preparazione dei campioni non devono essere impiegate per le attività di preparazione dei reagenti o per processare DNA amplificato o altre fonti dell acido nucleico bersaglio. Tutte le forniture e le apparecchiature per l amplificazione devono essere sempre tenute nell area dedicata alla strumentazione per PCR in tempo reale. I dispositivi di protezione individuale, quali guanti monouso e camici da laboratorio, devono essere specifici per ogni area. 8. La contaminazione dei campioni dei pazienti o dei reagenti può determinare risultati errati. Utilizzare tecniche asettiche. 9. Pipettare e manipolare i reagenti con cautela per evitare di mescolare i campioni con quelli dei pozzetti adiacenti. 10. Utilizzare tecniche di pipettamento adeguate e mantenere lo stesso tipo di tecnica per l'intera procedura per assicurare valori ottimali e riproducibili. 11. Non sostituire o miscelare reagenti provenienti da lotti di kit diversi o di altri produttori. 12. Non scambiare i tappi dei flaconcini di reagente. Questo può comportarne la contaminazione e compromettere i risultati del test. 13. Utilizzare unicamente il protocollo descritto nel presente foglio illustrativo. Ogni deviazione dal protocollo o l uso di tempi o temperature diversi da quelli specificati possono comportare risultati errati. 14. L impostazione del saggio deve essere eseguita a temperatura ambiente (in un intervallo compreso tra 18 e 25 C). Mentre si miscelano i reagenti, mantenere freddi gli enzimi utilizzando un blocco refrigerante. 15. Non riutilizzare Universal Discs già esposti ai campioni dei pazienti o ai reagenti. 16. Smaltire il disco usato senza staccare o rimuovere il nastro di copertura. 17. Se sullo stesso disco sono configurati diversi kit o lotti Simplexa, testare i controlli positivi e i controlli no template di ogni kit. 18. La miscela master contiene una percentuale di glicerolo > 1%, che può causare irritazione in caso di inalazione o contatto con la pelle. In caso di inalazione o contatto con la pelle, adottare le misure di primo soccorso. 19. Si sconsiglia la conservazione protratta dei campioni estratti a temperature comprese tra 2 e 8 C, poiché non sono stati effettuati test per stabilire le prestazioni del dosaggio in queste condizioni. 20. Se la confezione o il suo contenuto appaiono rotti o danneggiati, non usarli e contattare Focus Diagnostics. I recapiti si trovano nell ultima pagina di questo documento. ISTRUZIONI PER L USO A. PRELIEVO DEI CAMPIONI I tipi di campione utilizzabili sono l urina e il plasma. Per la raccolta del plasma, non adoperare provette contenenti l anticoagulante eparina. L eparina inibisce la PCR. B. AREA DI ESTRAZIONE DEI CAMPIONI Operare in un area dedicata all estrazione dei campioni e dei controlli. La preparazione dei campioni per l'estrazione deve essere eseguita in una cabina di biosicurezza. Estrazione mediante il metodo Roche MagNA Pure LC 1. Estrarre gli acidi nucleici dai campioni dei pazienti e dai controlli del dosaggio utilizzando il kit Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid e lo strumento Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor. Per eseguire l estrazione degli acidi nucleici utilizzando questo kit, fare riferimento alle istruzioni per l'uso del produttore.

4 Simplexa BKV pagina 4 2. Nel menu a discesa Protocol [Protocollo] sul sistema MagNA Pure LC, selezionare Total NA [Acidi nucleici totali], quindi Total NA Variable_elution_volume.blk dall elenco. In questo modo verranno caricate le impostazioni adeguate per la sessione. 3. Il Sample Protocol [Protocollo campione] deve essere Total NA Variable_elution_volume. 4. Impostare il Sample Volume [Volume campione] su 200 µl e il volume di eluizione su 50 µl. 5. Impostare il volume di diluizione su zero per tutti i campioni. 6. Verificare che il Post Elution Protocol [Protocollo post-eluizione] sia impostato su None [Nessuno]. 7. Verificare che i campioni e i controlli siano correttamente posizionati sulla cartuccia campione. 8. Miscelare ciascun campione e il controllo positivo alto (HPC) e basso (LPC) per 2-4 secondi con il vortex, quindi centrifugare brevemente per far sì che il contenuto raggiunga il fondo della provetta. 9. Pipettare 200 µl di ciascun campione, di LPC, di HPC e del controllo no template nella posizione corrispondente della cartuccia campione. 10. Controllare visivamente il livello dei campioni e dei controlli nella cartuccia campione per accertarsi che i campioni siano stati effettivamente aggiunti. 11. Miscelare 2 volte con colpi di vortex il controllo interno di estrazione ed amplificazione (IC) e centrifugare brevemente per far scendere il contenuto sul fondo della provetta. 12. Per ciascun set di 16 campioni (campioni 1-16), pipettare 100 µl di controllo interno in 6 ml di tampone di lisi in una provetta conica. Miscelare brevemente con il vortex. Aggiungere al vassoio corretto sullo strumento di estrazione MagNA Pure. o Se per esempio si estraggono più di 16 campioni (17-32 campioni), pipettare 200 µl di controllo interno in 12 ml di tampone di lisi in una provetta conica. Miscelare brevemente con il vortex. Aggiungere al vassoio corretto sullo strumento di estrazione MagNA Pure. 13. Trasferire la cartuccia campione sullo strumento MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor e avviare la sessione di estrazione. 14. Una volta completata l estrazione degli acidi nucleici, la cartuccia contenente i controlli e i campioni dei pazienti estratti può essere rimossa dal MagNA Pure e sigillata. Conservare il DNA estratto ad una temperatura compresa tra 2 e 8 C fino al suo utilizzo. Si sconsiglia di conservare i campioni estratti a questa temperatura per lunghi periodi. Mantenere i campioni di DNA estratti su un blocco refrigerante durante il caricamento del disco. Estrazione mediante il metodo biomérieux NucliSENS easymag 1. Per il funzionamento dello strumento e del software, fare riferimento al manuale d'uso NucliSENS easymag. 2. Sul software NucliSENS easymag, scegliere Generic template [Templato generico] con le seguenti impostazioni: Default Request [Richiesta predefinita]: Generic (o equivalente) Run Name Prefix [Prefisso nome sessione]: (come appropriato) Sample ID prefix [Prefisso ID campione]: (come appropriato) Sample Type [Tipo di campione]: Primary [Primario] Workflow Defaults [Valori predefiniti flusso di lavoro]: Reagent Tracking [Tracciamento reagenti]: On-board lysis Incubation [Incubazione di lisi integrata] On-board Silica Incubation [Incubazione silice integrata] Sample Addition Guidance Off [Aggiunta assistita campione disattivata] Tracciamento reagenti di lisi, silice, controllo interno disattivato 3. Inserire le informazioni sul singolo campione nella schermata Extraction Request [Richiesta estrazione] come indicato di seguito. Sample ID [ID campione]: (Inserire il nome del campione) Request [Richiesta]: Generic (o equivalente) Volume (ml): 0,200 Eluate [Eluato] (µl): 50 Type [Tipo]: Primary [Primario] Priority [Priorità]: Normal [Normale] Matrix [Matrice]: Other [Altro] 4. Creare una Extraction Run [Sessione di estrazione] nel software NucliSENS easymag in base al manuale d'uso. 5. Miscelare ciascun campione e il controllo positivo alto (HPC) e basso (LPC) per 2-4 secondi con il vortex, quindi centrifugare brevemente per far sì che il contenuto raggiunga il fondo della provetta. 6. Pipettare 200 μl di campione, di LPC, HPC o del controllo no template nei contenitori dei campioni. 7. Miscelare il controllo interno due (2) volte con colpi di vortex e centrifugare brevemente per far scendere il contenuto sul fondo della provetta. 8. Pipettare 5 µl di controllo interno in ogni campione e in tutti i pozzetti di controllo. Sostituire i puntali tra un pozzetto e l altro. 9. Caricare i contenitori dei campioni, i nuovi materiali monouso per l'aspiratore e i reagenti sullo strumento easymag in base al manuale d'uso. 10. Avviare la lisi integrata e incubare i campioni lisati per 10 minuti prima di aggiungere la miscela di silice magnetica.

5 Simplexa BKV pagina Durante il periodo di incubazione della lisi, preparare la miscela di silice magnetica. Mescolare la silice e diluire in acqua priva di nucleasi aggiungendo 1 parte di silice magnetica a 3 parti di acqua priva di nucleasi (per esempio, 270 μl di silice magnetica μl di acqua priva di nucleasi). Preparare un minimo di 135 μl di miscela di silice magnetica per campione. 12. Per trasferire la miscela di silice nei pozzetti della strip per ELISA, mescolare la miscela di silice magnetica e usare 1 puntale e la modalità operativa P2 della pipetta Biohit. Premere Start [Inizia] per aspirare 1050 μl di miscela di silice magnetica, quindi premere di nuovo Start [Inizia] scartando il primo colpo nella provetta della miscela di silice. Premere Start [Inizia] per erogare 125 μl di miscela di silice magnetica negli 8 singoli pozzetti della strip per ELISA. Se necessario, ripetere per le altre strip per ELISA. 13. Dopo i 10 minuti dell'incubazione di lisi, utilizzare 8 puntali (per ogni strip per ELISA) e la modalità operativa P3 della pipetta Biohit per trasferire 100 μl di miscela di silice magnetica nel contenitore di ogni campione. Posizionare i puntali nei pozzetti delle strip per ELISA e premere Start [Inizia] per miscelare e aspirare la miscela di silice magnetica. 14. Trasferire la miscela di silice magnetica nell appropriato contenitore del campione e posizionare il puntale nel campione al di sotto del livello del liquido. Premere Start [Inizia] per aspirare, distribuire e mescolare (x3) la silice magnetica e i campioni. Assicurarsi che il puntale rimanga sotto il livello del liquido, per garantire una miscelazione corretta. 15. Ripetere i passaggi 13 e 14 negli altri contenitori dei campioni. 16. Dopo l'aggiunta della miscela di silice magnetica a tutti i contenitori dei campioni, avviare la sessione di estrazione. 17. Al termine della sessione, togliere i contenitori dei campioni dallo strumento. Se i campioni non devono essere utilizzati subito, trasferirli in provette singole per ridurre al minimo la possibilità che la silice magnetica ricada nel campione. Conservare il DNA estratto a una temperatura compresa tra 2 e 8 C fino al suo utilizzo. Si sconsiglia di conservare i campioni estratti a questa temperatura per lunghi periodi. Tenere il DNA estratto su un blocco refrigerante durante il caricamento del disco. C. IMPOSTAZIONE DELLO STRUMENTO PER PCR IN TEMPO REALE 1. Fare riferimento al Manuale dell operatore dell Integrated Cycler per informazioni dettagliate su come configurare il software Integrated Cycler Studio e aggiungere una definizione dell analisi, impostare le sessioni e analizzare le sessioni compiute con l Integrated Cycler. Nota: Prima di eseguire una sessione predittiva, deve essere definita una curva standard valida (sessione di calibrazione). D. AREA DI PREPARAZIONE REAGENTI Area dedicata alla preparazione della miscela di reazione per il dosaggio Simplexa BKV. 1. Lasciare scongelare la miscela di primer e la miscela master a temperatura ambiente (tra 18 e 25 C circa). Ogni flaconcino compreso nel kit contiene reagente sufficiente per 50 reazioni. Prima di ogni uso, mescolare delicatamente la miscela di primer e la miscela master invertendo 6-8 volte, quindi centrifugare brevemente in modo che il contenuto raggiunga il fondo della provetta. 2. Preparare il volume richiesto di miscela di reazione in una provetta in polipropilene per microcentrifuga di dimensioni adeguate, pipettando il volume di ogni componente come indicato nella tabella sotto. Volumi della miscela di reazione Miscela di reazione Miscela di reazione Reagente Volume / 1 reazione Volume / 10 reazioni Simplexa Master Mix 4,0 µl 40 µl Simplexa BKV Primer Mix 1,0 µl 10 µl Volume totale 5,0 µl 50 µl 3. Mescolare delicatamente la miscela di reazione per inversione o pipettando 8-10 volte. 4. Centrifugare brevemente in modo che il contenuto raggiunga il fondo della provetta. 5. Procedere all impostazione della PCR. 6. Utilizzare la miscela di reazione entro un ora dalla preparazione. Se l impostazione della PCR non viene eseguita immediatamente, conservare la miscela di reazione preparata ad una temperatura compresa tra 2 e 8 C. E. AREA DI AMPLIFICAZIONE MEDIANTE PCR IN TEMPO REALE Operare in un area dedicata alla preparazione del disco universale a 96 pozzetti per il saggio Simplexa BKV. Durante l'esecuzione della seguente procedura, fare riferimento all esempio di layout del disco nella sezione C: 1. Aggiungere 5,0 µl di miscela di reazione a ogni pozzetto. 2. Aggiungere 5,0 µl dei controlli positivi estratti ai pozzetti HPC e LPC. 3. Aggiungere 5,0 µl del campione paziente estratto al giusto pozzetto S. 4. Aggiungere 5,0 µl del controllo no template estratto al pozzetto NTC. 5. Coprire il disco con il nastro di copertura per Universal Discs. 6. Aprire il coperchio dell Integrated Cycler. 7. Posizionare il disco universale sigillato sulla piastra. 8. Chiudere delicatamente il coperchio. 9. Fare clic su Run [Esegui]. 10. Fare clic su Start [Inizia].

6 Simplexa BKV pagina 6 F. ANALISI DEI DATI 1. Al termine della sessione, fare clic su Analyze [Analizza]. 2. Scegliere i coloranti (canali) uno alla volta o selezionarli tutti, spuntando la casella vicino ad ognuno di essi. 3. Premere il pulsante Print Preview [Anteprima di stampa] (in basso a destra) per rivedere una sintesi dei valori predittivi ottenuti. Spuntare la casella Include Graphs [Includi grafici] per includere un anteprima delle curve di amplificazione. Per includere il rapporto di calibrazione associato alla sessione predittiva, spuntare la casella Include Calibration Result [Includi risultato calibrazione]. Scorrere le pagine utilizzando i pulsanti freccia nell angolo superiore sinistro della finestra Print preview [Anteprima di stampa]. 4. Stampare o salvare il rapporto secondo le proprie necessità, cliccando su Print [Stampa] o su Save [Salva]. 5. Se necessario, esportare i valori ottenuti. CONTROLLO DI QUALITÀ Ogni laboratorio deve stabilire i propri intervalli per il controllo qualità e la frequenza di tali controlli, in base alle leggi e ai regolamenti locali applicabili e alle buone pratiche di laboratorio standard. REFERTAZIONE DEI RISULTATI 1. Validità della sessione Determinare se la sessione è valida esaminando i risultati per BKV e per il controllo interno (IC) per i pozzetti del controllo positivo basso (LPC), del controllo positivo alto (HPC) e del controllo no template (NTC). Perché la sessione sia valida, tutti e tre i controlli devono soddisfare i criteri di accettabilità. Se la sessione non è valida, tutti i campioni dei pazienti devono essere nuovamente analizzati. Criteri di accettabilità Controllo BKV DNA del controllo di estrazione e amplificazione (IC) Controllo no template (NTC) Non rilevato Rilevato Entro i valori di tolleranza indicati Controllo positivo basso (LPC) sull etichetta specifica per il lotto Non applicabile Entro i valori di tolleranza indicati Controllo positivo alto (HPC) sull etichetta specifica per il lotto Non applicabile L NTC soddisfa i criteri di accettabilità se BKV non viene rilevato e il controllo interno viene rilevato. La rilevazione di BKV nell NTC indica che i campioni potrebbero aver subito una contaminazione durante il processamento. L LPC soddisfa i criteri di accettabilità se al suo interno BKV viene rilevato entro i valori di tolleranza (come indicato sull etichetta specifica per il lotto); il controllo interno dovrebbe essere rilevato, ma ciò non rappresenta un requisito indispensabile. L HPC soddisfa i criteri di accettabilità se al suo interno BKV viene rilevato entro i valori di tolleranza (come indicato sull etichetta specifica per il lotto); il controllo interno dovrebbe essere rilevato, ma ciò non rappresenta un requisito indispensabile. 2. Interpretazione dei risultati Interpretazione dei risultati Esempio Valore BKV Valore IC Interpretazione 1 Non rilevato Rilevato BKV non rilevato BKV rilevato, sotto il limite inferiore di quantificazione (LloQ, 2 < 510 copie/ml N/A Lower Limit of Quantitation). 3 X copie/ml N/A BKV rilevato ad una specifica concentrazione. 4 > 1 x 10 8 BKV rilevato, al di sopra del limite superiore di copie/ml N/A quantificazione (UloQ, Upper Limit of Quantitation). 5 Non rilevato Non rilevato Non valido, estrarre nuovamente e ripetere. 3. Validità dei risultati ottenuti per i campioni Un campione è considerato valido se, alternativamente, 1. BKV non viene rilevato e il controllo interno è rilevato. 2. BKV viene rilevato. Non è necessario che il controllo interno sia rilevato per risultati positivi per BKV.

7 Simplexa BKV pagina 7 LIMITAZIONI 3. Per ogni risultato si dovrà esaminare la curva di amplificazione, con particolare attenzione a quelli per cui venga visualizzato il messaggio Data Quality [Qualità dei dati]. Una curva di amplificazione valida mostra un aumento esponenziale uniforme. Fare riferimento al manuale dell operatore per le azioni consigliate. 1. Il dosaggio deve essere eseguito solo da personale adeguatamente formato e che abbia acquisito familiarità con le procedure d esame e l'interpretazione dei risultati. 2. Il software 3M Integrated Cycler Studio mantiene in memoria il file dell'ultima calibrazione valida per quantificare i campioni ottenuti dai pazienti. L estrazione deve essere eseguita utilizzando per gli standard di quantificazione e i campioni ottenuti dai pazienti la stessa metodica; in caso contrario, si possono ottenere risultati errati. 3. Quando il test venga usato per il monitoraggio di un paziente, il metodo di estrazione utilizzato per preparare il campione della determinazione iniziale deve essere mantenuto per tutte le determinazioni seguenti. 4. Tutti i risultati derivanti da questo e da altri test devono essere messi in correlazione con l'anamnesi clinica, i dati epidemiologici e gli altri dati in possesso del medico che esamina il paziente. 5. La prevalenza dell infezione influisce sul valore predittivo del test. 6. Come accade per altri test, un risultato negativo non esclude la presenza di infezioni da BKV. 7. Si possono avere risultati falsi negativi quando il microrganismo infettante presenti mutazioni, inserzioni, delezioni o riarrangiamenti del genoma, o se il test viene eseguito in una fase molto precoce della malattia. 8. Si possono avere risultati falsi negativi se il campione contiene un numero inadeguato di microrganismi a causa di prelievo, trasporto o manipolazione non corretti. 9. Come accade per altri test, si possono avere risultati falsi positivi. In alcuni scenari, può essere indicato ripetere il test o eseguirlo con un dispositivo differente. 10. Questo test non può escludere la presenza di malattie causate da altri patogeni batterici o virali. 11. Le prestazioni di questo test nello screening dell urina o del plasma per la rilevazione di BKV non sono state definite. 12. Questo test non è destinato all uso come test di screening o come test diagnostico per la rilevazione della presenza di BKV nell urina o nel plasma. 13. Non sono state determinate le prestazioni di questo test in presenza di sostanze endogene o esogene potenzialmente interferenti. CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI CONFRONTO DI METODICHE Allo studio clinico di concordanza ha partecipato un sito di analisi interno. I risultati di riferimento sono stati generati utilizzando un test ad alte prestazioni sviluppato in laboratorio. Nell ambito dello studio, il saggio per il rilevamento e la quantificazione di BKV è stato eseguito su 150 campioni di plasma e 125 campioni di urina. I campioni sono stati estratti utilizzando la metodica di estrazione MagNa Pure. Sono stati inclusi nell analisi i campioni (75 di plasma e 55 di urina) i cui risultati ricadessero all interno dell intervallo riportabile combinato del test di riferimento sviluppato in laboratorio e del dosaggio Simplexa BKV. La regressione di Passing-Bablok ha dato una pendenza di 1,05 e un intercetta di -0,83 per il plasma e una pendenza di 1,05 e un intercetta di - 0,82 per l urina.

8 Simplexa BKV pagina 8 I campioni clinici con risultati compresi nell'intervallo di linearità del saggio Simplexa BKV sono stati testati anche con la metodica di estrazione easymag. Tali campioni hanno fornito risultati equivalenti a quelli estratti con la metodica MagNA Pure (pendenza di 0,98 e intercetta di -0,03 per il plasma e pendenza di 1,06 e intercetta di -0,4 per l urina). SENSIBILITÀ ANALITICA / LIMITE DI RILEVAZIONE Il limite di rilevazione (LoD, Limit of Detection) è stato calcolato creando campioni ad hoc da uno stock a concentrazione nota di un ceppo di BKV addizionato a matrici di plasma e di urina risultate clinicamente negative. Il pannello includeva controlli negativi (matrici di urina e di plasma non addizionate) e campioni a diverse concentrazioni, creati per diluizione seriale, intorno al LoD approssimato (ottenuti in una fase precedente del test). Per ogni combinazione di metodica di estrazione (easymag, MagNA Pure) e tipo di campione (plasma, urina) sono stati analizzati ventiquattro (24) replicati ottenuti da tre (3) diverse estrazioni e sessioni di PCR ad ogni livello, applicando l analisi Probit per determinare la concentrazione più bassa che potesse essere accuratamente rilevata con il 95% di probabilità. Il protocollo LoD è stato eseguito per ognuno dei due metodi di estrazione e tipi di campione. I singoli valori del LoD sono mostrati nella tabella sottostante. Il LoD, inteso come il LoD più elevato osservato tra tutti i metodi di estrazione e tipi di campione, è risultato pari a 510 copie/ml. Plasma Urina MagNA Pure easymag MagNA Pure easymag Copie/ml REATTIVITÀ ANALITICA / CROSS-REATTIVITÀ Diversi studi hanno indicato che i primer sono specifici per BKV e non danno reazioni crociate con altri microrganismi, inclusi HIV- 1, HIV-2, HSV-1, HSV-2, HHV-6, JCV, VZV, EBV, CMV, Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus, Candida, Enterobacter, Citrobacter, E.coli, Klebsiella e Proteus mirabilis. I database delle sequenze di acidi nucleici indicano inoltre che i primer sono specifici per BKV, e che essi non presentano omologie significative con le sequenze di altri patogeni o con il DNA umano. INTERFERENZA Non sono state valutate le prestazioni di questo test in presenza di sostanze potenzialmente interferenti. Il processo automatizzato di estrazione degli acidi nucleici mediante il sistema MagNA Pure o il sistema NucliSENS easymag rimuove efficacemente le impurità dal campione durante l isolamento e il lavaggio degli acidi nucleici, nel corso del processo di estrazione. I controlli interni avvisano l'utente finale di possibili eventi di inibizione della PCR; se il target e il controllo interno non vengono rilevati, il test non è valido. RIPRODUCIBILITÀ Lo studio di riproducibilità è stato eseguito da due operatori su due strumenti Integrated Cycler (un operatore per strumento), che hanno effettuato due sessioni al giorno per cinque giorni. Il pannello di riproducibilità comprendeva controlli (NTC, HPC e LPC), standard di quantificazione (da QS-1 a QS-5), pool negativi (matrici di urina e di plasma non addizionate con BKV) e pool positivi

9 Simplexa BKV pagina 9 per il virus BKV in matrici di urina e di plasma a tre diverse concentrazioni, e precisamente un pool a bassa concentrazione (addizionato con una concentrazione di BKV approssimativamente 2-4 volte il limite di rilevazione (LoD)), un pool a concentrazione intermedia (approssimativamente 8-10 volte il LoD) e un pool ad alta concentrazione (intervallo di rilevazione superiore del saggio). Per ogni campione del pannello sono stati eseguiti quattro replicati, per un totale di 80 determinazioni per ciascun membro del pannello preparato per lo studio. La tabella di seguito mostra i risultati di riproducibilità per ogni campione del pannello. Nome del campione Concentrazione attesa (copie/ml) Media geometrica (copie/ml) Riproducibilità di Simplexa BKV Media logaritmica (copie/ml) N. di risultati misurabili* Tra strumenti Deviazione standard Tra giorni Tra sessioni NTC 0 Non rilevato Non rilevato 0 Non applicabile (N/A) Nella stessa sessione Totale HPC 5,08 x ,81 x , ,026 0,012 0,025 0,024 0,045 LPC 6,32 x ,44 x , ,014 0,034 0,015 0,045 0,060 QS-1 4,70 x 10 8 >1 x 10 8 N/A 0 N/A QS-2 5,29 x ,35 x , ,016 0,021 0,024 0,024 0,043 QS-3 2,74 x ,56 x , ,000 0,021 0,014 0,021 0,032 QS-4 5,83 x ,89 x , ,005 0,025 0,017 0,047 0,056 QS-5 1,05 x ,02 x , ,008 0,031 0,000 0,083 0,089 Plasma Conc. alta 1,00 x ,11 x , ,016 0,009 0,026 0,019 0,037 Conc. intermedia Conc. bassa Campione negativo 5,00 x ,71 x , ,022 0,050 0,025 0,048 0,076 2,00 x ,44 x , ,063 0,050 0,000 0,098 0,126 0 Non rilevato Non rilevato 0 N/A Conc. alta 1,00 x ,75 x , ,000 0,104 0,014 0,013 0,105 Conc. intermedia Conc. bassa Campione negativo Urina 5,00 x ,87 x , ,000 0,061 0,022 0,081 0,104 2,00 x ,12 x , ,088 0,049 0,000 0,090 0,135 0 Non rilevato Non rilevato 0 N/A * Numero di risultati compresi nell intervallo di linearità del saggio Simplexa BKV. LINEARITÀ La linearità è stata determinata utilizzando campioni ad hoc da uno stock a concentrazione nota di un ceppo di BKV addizionato a matrici di urina e di plasma risultate clinicamente negative. Il pannello consisteva di 10 pool di copie note, che coprivano l'intervallo di linearità atteso. In questi pool, almeno 3 concentrazioni erano prossime al limite inferiore di quantificazione (LLOQ), 2 erano prossime al limite superiore di quantificazione (ULOQ) e le rimanenti erano distribuite in modo approssimativamente omogeneo tra il LLOQ e l ULOQ. Ogni campione è stato analizzato in modo casuale, in almeno 3 replicati. Il protocollo di linearità è stato eseguito per ognuno dei due metodi di estrazione. I singoli valori dell intervallo riportabile sono mostrati nella tabella sottostante. Plasma Urina MagNA Pure easymag MagNA Pure easymag copie/ml da 250 a da 250 a da 500 a da 250 a

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11 Simplexa BKV pagina 11 INTERVALLO RIPORTABILE Tutti i metodi di estrazione e tipi di campione erano lineari fino a copie/ml. L intervallo riportabile del saggio era basato sul LoD, dato che questo era più elevato della linearità ed è stato determinato come > 510 copie /ml e < copie/ml. I campioni superiori all intervallo di linearità saranno riportati come > copie/ml e quelli inferiori come <510. CONTAMINAZIONE DA CARRY-OVER Il carryover di amplificato è stato valutato per lo strumento e il disco universale in altri dosaggi. Questi studi hanno ricercato la presenza di contaminazioni in campioni altamente negativi. Ogni studio è stato impostato posizionando alternativamente su ogni disco un campione altamente positivo ed uno altamente negativo. L effetto da carryover è stato valutato confrontando il tasso di negativi osservato per i campioni altamente negativi con il tasso atteso, nelle normali condizioni di riproducibilità. Nei test eseguiti non è stato osservato alcun effetto dovuto a contaminazioni da carryover.

12 Simplexa BKV pagina 12 BIBLIOGRAFIA 1. Padgett, B.L. and Walker, D.L. (1973). "Prevalence of antibodies in human sera against JC virus, an isolate from a case of progressive multifocal leukoencephalopathy". J. Infect. Dis. 127 (4): Shah KV, Daniel RW, Warszawski RM. High prevalence of antibodies to BK virus, an SV40-related papovavirus, in residents of Maryland. J Infect Dis 1973; 128: Gardner SD. Prevalence in England of antibody to human polyomavirus (B.K.). BMJ 1973; 1: Mantyjarvi RA, Meurman OH, Vihma L, Berglund B. A human papovavirus (BK), biological properties and seroepidemiology. Ann Clin Res 1973; 5: Flaegstad T, Ronne K, Filipe AR, Traavik T. Prevalence of anti BK virus antibody in Portugal and Norway. Scand J Infect Dis 1989;21(2): Rziha HJ; Bornkamm GW; zur Hausen H. BK virus: I. Seroepidemiologic studies and serologic response to viral infection. Med Microbiol Immunol (Berl) 1978 Jul 4;165(2): AU Dei R; Marmo F; Corte D; Sampietro MG; Franceschini E; Urbano P 7. Age-related changes in the prevalence of precipitating antibodies to BK virus in infants and children. J Med Microbiol 1982 Aug;15(3): Arthur RR, Shah KV. Occurrence and significance of papovaviruses BK and JC in the urine. Prog Med Virol 1989; 36: Shah, KV. Polyomaviruses. IN: Virlogy (3 rd Ed), Fields, BN, Knope, DM, Howley, PM (Eds), Lipincott-Raven Publishers, Philadelphia p Gillespie, SM, Chang, Y, Lemkp, G, et al. Progressive multifocal leukoencephalopathy in persons infected with human immunodeficiency virus, San Francisco, Ann Neurol 1991; 30: NCCLS H18-A2. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline. 2nd Ed. (1999). 12. CDC-NIH Manual. (1999) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 4th ed. And National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of Laboratory Workers from Instruments, Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue (NCCLS M29-A). L uso delle sonde Scorpions per la diagnostica in vitro nell'uomo è coperto da una licenza concessa da DxS, Ltd a Focus Diagnostics, Inc. I coloranti Black Hole Quencher, CAL Fluor e Quasar sono a marchio Biosearch Technologies, Inc. ('BTI'). La tecnologia con colorante Black Hole Quencher, CAL Fluor e Quasar è concessa in licenza ai sensi dell accordo con BTI e tali prodotti sono venduti a solo scopo clinico, diagnostico o di ricerca e sviluppo. RAPPRESENTANTE AUTORIZZATO mdi Europa GmbH, Langenhagener Str , Langenhagen-Hannover, Germania INFORMAZIONI PER GLI ORDINI Telefono: Fax: (800) (solo USA) (562) (562) (dall'estero) PI.MOL2300.OUS.IT Rev. E Data di redazione: 10 novembre 2014 ASSISTENZA TECNICA Telefono: Fax: (800) (solo USA) (562) (562) (dall'estero) Visitate il nostro sito web all indirizzo Cypress, California 90630, Stati Uniti