Simplexa TM Dengue. Per uso diagnostico in vitro. REF MOL3100 Rev. C

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1 Simplexa TM Dengue REF MOL3100 Rev. C Test di RT-PCR in tempo reale per il rilevamento e la tipizzazione in vitro dei sierotipi 1, 2, 3 e 4 del virus dengue. Per uso diagnostico in vitro USO PREVISTO Il test di reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR) Simplexa TM Dengue di Focus Diagnostics deve essere utilizzato con lo strumento 3M Integrated Cycler per il rilevamento e la tipizzazione in vitro dei sierotipi 1, 2, 3 e 4 del virus dengue nel siero umano. RIASSUNTO E SPIEGAZIONE La febbre dengue (DF, dengue fever) è una malattia virale acuta autolimitante caratterizzata da febbre, cefalea, dolori corporei, eruzioni cutanee, linfoadenopatia e prostrazione. Nella sua forma più grave, la febbre emorragica dengue (DHF, dengue hemorragic fever), i pazienti infetti presentano febbre elevata e insufficienza renale, con conseguente sindrome shock da dengue (DSS, dengue shock syndrome), spesso fatale 1. Si stima che circa 2 milioni di persone siano a rischio di DF nel mondo e che 100 milioni di persone all anno siano infettate. 2,3 Questo dato, associato alle centinaia di migliaia di casi di DSS, fa sì che la dengue sia la malattia da arbovirus più importante al mondo. 4 La DHF è stata identificata per la prima volta negli anni '50 durante un'epidemia di dengue nelle Filippine e in Tailandia. Newll 1970 nove Paesi presentavano epidemie di DHF e oggi il numero è aumentato di oltre quattro volte e continua a crescere. Attualmente, i casi emergenti di DHF stanno causando un aumento delle epidemie di dengue nelle Americhe e in Asia dove tutti e quattro i virus dengue sono endemici e la DHF è diventata la principale causa di ospedalizzazione e morte dei bambini in diversi Paesi. 5 Il virus dengue (DV) è un virus a RNA a singolo filamento della famiglia Flavivirus ed è strettamente correlato al virus della febbre gialla, al virus dell encefalite giapponese e ad altri arbovirus del gruppo B. Esistono 4 ceppi di virus dengue, distinti dal punto di vista sierologico. L infezione con il ceppo 1 non protegge l ospite dall infezione da parte degli altri ceppi. In effetti, una relazione suggerisce che la DHF e la DSS si verifichino più frequentemente in persone che sono state infettate precedentemente da un altro ceppo. 6 La presenza di anticorpi anti-dv circolanti, non neutralizzanti e cross-reattivi può agire da fattore di stimolazione dell infezione. 6 Anticorpi non neutralizzanti e cross-reattivi contro altri flavivirus non-dv non sono però associati a una stimolazione dell infezione. 6 Il virus dengue può essere trasmesso ovunque si trovino le zanzare vettore, Aedes aegypti e Aedes albopictus. A. aegypti è localizzata principalmente nelle zone tropicali e subtropicali americane ed è indigena nella parte meridionale degli Stati Uniti. 4 Il principale vettore della DF in Asia è A. albopictus. Recentemente sono state documentate infezioni di dengue acquisite localmente a Key West, in Florida, e nella contea di Miami-Dade. 7 Storicamente, i casi sospetti di DF sono stati diagnosticati usando metodi sierologici. Nei sieri di pazienti con infezioni acute primarie si trovano generalmente anticorpi di tipo IgG e IgM specifici per il virus, mentre la risposta IgM può essere bassa o talvolta persino assente nella febbre dengue secondaria. 8 Nella famiglia Flavivirus esiste inoltre una forte reattività crociata. Di conseguenza, la risposta anticorpale può essere difficile da interpretare per quanto riguarda una febbre dengue acuta se non possono essere escluse altre infezioni da flavivirus mediante mezzi clinici, epidemiologici o di laboratorio. Recentemente sono stati sviluppati metodi di RT-PCR in tempo reale per rilevare il virus dengue nel sangue dei pazienti. La rilevazione dell RNA del virus dengue mediante PCR con trascrittasi inversa (RT-PCR) in campioni di siero umano è altamente indicativa di febbre dengue acuta. 9 Il virus dengue può essere rilevato nel sangue (siero) di pazienti per i primi 5 giorni circa di sviluppo dei sintomi. 10 PRINCIPI DELLA PROCEDURA Il test è una RT-PCR in tempo reale che differenzia i sierotipi 1 e 4 in una reazione (pozzetto) e i sierotipi 2 e 3 in un altra reazione (pozzetto). Il saggio prevede due fasi principali: (1) estrazione dell RNA dai campioni e (2) amplificazione dell RNA estratto usando sonde-primer fluorescenti bifunzionali e primer inversi. Il saggio amplifica quattro regioni specifiche del sierotipo: dengue 1 (gene NS5), dengue 2 (gene NS3), dengue 3 (gene NS5) e dengue 4 (gene capsidico). Per monitorare il processo di estrazione e rilevare l inibizione della RT-PCR si utilizza un controllo interno di RNA.

2 Simplexa Dengue Pagina 2 MATERIALI FORNITI Il kit Simplexa Dengue contiene reagenti a sufficienza per la sierotipizzazione di 100 campioni. Descrizione del kit Nome del componente REF SIMBOLO CE SULL ETICHETTA Nome abbreviato Colore Numero di Reazioni del tappo flaconcini per flaconcino /kit Volume per flaconcino Simplexa Dengue 1 & 4 Primer Mix MOL3101 REAG A PM Marrone 2 50/ µl Simplexa Dengue 2 & 3 Primer Mix MOL3102 REAG B PM Viola 2 50/ µl HS Master Mix MOL9060 REAG C MM Verde 4 50/ µl RT Mix MOL9103 REAG D RT Giallo 2 100/ µl Simplexa RNA Internal Control MOL2004 CONTROL IC IC Blu 2 50/ µl Simplexa Dengue Molecular Control MOL3103 CONTROL + MC Rosso 2 4/8 800 µl Componente del kit Simplexa Dengue 1 & 4 Primer Mix (PM) (Miscela di primer 1 & 4 Simplexa Dengue) Descrizione del componente Descrizione Primer fluorescenti marcati con colorante specifici per il rilevamento dell RNA del virus dengue sierotipo 1, dell RNA del virus dengue sierotipo 4 e del controllo interno. Target Dengue 1 (DV1) Fluoroforo sonda (colorante) Eccitazione Emissione Gene bersaglio FAM 495 nm 520 nm Gene NS5 Dengue 4 (DV4) CFR nm 610 nm Gene capsidico interno (RNA IC) Q nm 670 nm N/A Primer fluorescenti marcati con colorante specifici per la rilevazione dell RNA del virus dengue sierotipo 2, dell RNA del virus dengue sierotipo 3 e del controllo interno. Simplexa Dengue 2 & 3 Primer Mix (PM) (Miscela di primer 2 & 3 Simplexa Dengue) HS Master Mix (MM) (Miscela master HS) Simplexa RNA Internal Control (RNA IC) ( interno di RNA Simplexa ) Simplexa Dengue Molecular Control (MC) ( molecolare Simplexa Dengue) RT Mix (RT) (Miscela RT) Target Floroforo sonda (colorante) Eccitazione Emissione Gene bersaglio Dengue 3 (DV3) FAM 495 nm 520 nm Gene NS5 Dengue 2 (DV2) CFR nm 610 nm Gene NS3 interno (RNA IC) DNA polimerasi, tampone e dntp. RNA templato incapsulato. Sierotipi 1, 2, 3 e 4 del virus dengue inattivato. Enzima trascrittasi inversa, tampone. Q nm 670 nm N/A MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI 1. 3M Integrated Cycler con software Integrated Cycler Studio versione 4.2 o superiore 2. Universal Discs per utilizzo su Integrated Cycler 3. Nastro di copertura per Universal Disc 4. Acqua priva di nucleasi (raccomandata per l uso come controllo privo di templato (No-Template Control, NTC) 5. Micropipette singole, multicanale e/o a ripetizione con intervallo di precisione di 1-10 µl, µl e µl 6. Sistema Roche MagNA Pure LC e materiali di consumo associati. 7. Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (Roche N. Cat ) 8. Blocco di caricamento per Universal Disc 9. Congelatore (scongelamento manuale) impostato tra -10 e -30 C (per la conservazione dei componenti del kit)

3 Simplexa Dengue Pagina Congelatore (scongelamento manuale) impostato tra -10 C e -30 C (per la conservazione dei campioni, se necessaria) 11. Frigorifero da 2 C a 8 C (per i componenti del kit scongelati) 12. Cabina di biosicurezza (cappa a flusso laminare) per le estrazioni 13. Microcentrifuga 14. Miscelatore vortex 15. Puntali sterili monouso RNAsi/DNAsi-free con filtro barriera per aerosol per micropipettatore 16. Provette da 1,5 ml in polipropilene per microcentrifuga (provette RNAsi/DNAsi-free consigliate, ma non necessarie) e rack dedicati 17. Guanti monouso senza talco 18. Rack di raffreddamento per provette da 1,5 ml per microcentrifuga DURATA DI CONSERVAZIONE E MANIPOLAZIONE 1. Conservare i reagenti ad una temperatura compresa tra -10 e -30 C (non usare un congelatore no-frost). 2. Non utilizzare i kit o i reagenti dopo la data di scadenza. 3. Prima dell'uso, lasciare scongelare la miscela di primer, la miscela master HS, il controllo molecolare e il controllo interno di RNA a temperatura ambiente (circa C). 4. Dopo l aggiunta della miscela RT, utilizzare le miscele di reazione entro un ora. 5. Se l'impostazione della PCR non verrà eseguita subito dopo la preparazione delle miscele di reazione, conservare queste ultime a 2-8 C fino al momento di procedere (entro un'ora). 6. Dopo ogni uso, ricongelare la miscela RT (tra -10 C e -30 C) fino alla data di scadenza. 7. Una volta scongelati, conservare la miscela di primer, la miscela master HS, il controllo molecolare e il controllo interno dell RNA a una temperatura compresa tra 2 e 8 C per non oltre 30 giorni. 8. Non ricongelare la miscela di primer, la miscela master HS, il controllo interno di RNA o il controllo molecolare. 9. Non utilizzare insieme reagenti provenienti da lotti di kit differenti. AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Attenersi alle precauzioni standard. Tutti i campioni da analizzare e i controlli molecolari devono essere considerati come potenzialmente infettivi e manipolati di conseguenza. 2. Durante la manipolazione dei reagenti del kit, indossare dispositivi di protezione individuale quali, in modo non limitativo, guanti e camice da laboratorio. Lavarsi bene le mani una volta terminato il test. 3. Non pipettare con la bocca. 4. Non fumare, bere, mangiare, manipolare lenti a contatto o truccarsi nelle aree in cui siano in utilizzo i reagenti del kit e/o campioni umani. 5. Smaltire i reagenti del kit non utilizzati e i campioni da analizzare in base alle normative locali, regionali e nazionali. 6. Il flusso di lavoro in laboratorio deve procedere in maniera unidirezionale, partendo dalle aree di preamplificazione e spostandosi poi nell'area di amplificazione/rilevamento. Segue la sequenza di eventi che va dall'estrazione del campione all'amplificazione mediante PCR in tempo reale: Iniziare con l estrazione del campione, quindi configurare lo strumento per la PCR in tempo reale, preparare i reagenti e infine eseguire l amplificazione mediante PCR in tempo reale. Non scambiare forniture e apparecchiature tra le aree dedicate all estrazione e alla preparazione del campione. Non effettuare spostamenti tra un area e l altra. Le attrezzature e le apparecchiature usate per la preparazione dei campioni non devono essere impiegate per le attività di preparazione dei reagenti o per processare DNA amplificato o altre fonti dell acido nucleico bersaglio. Tutte le attrezzature e le apparecchiature di amplificazione devono essere mantenute nell area della strumentazione per PCR in tempo reale nel corso di ciascuna esecuzione. I dispositivi di protezione individuale, quali guanti monouso e camici da laboratorio, devono essere specifici per ogni area. 7. La contaminazione dei campioni da analizzare o dei reagenti può determinare risultati errati. Utilizzare tecniche asettiche. 8. Pipettare e manipolare i reagenti con cautela per evitare di mescolare i campioni con quelli dei pozzetti adiacenti. 9. Utilizzare tecniche di pipettamento adeguate e mantenere lo stesso tipo di tecnica per l'intera procedura per assicurare valori ottimali e riproducibili. 10. Non sostituire o miscelare reagenti provenienti da lotti di kit diversi o di altri produttori. 11. Non scambiare i tappi dei flaconcini di reagente. Questo può comportarne la contaminazione e compromettere i risultati del test. 12. Ogni deviazione da questo protocollo o l uso di tempi o temperature diversi da quelli specificati possono comportare risultati errati. 13. L impostazione del saggio deve essere eseguita a temperatura ambiente (in un intervallo compreso tra 18 e 25 C). Mentre si miscelano i reagenti, mantenere freddi gli enzimi utilizzando un blocco refrigerante. 14. Non riutilizzare gli Universal Discs già esposti ai campioni o ai reagenti dell analisi. 15. Smaltire il disco usato senza staccare o rimuovere il nastro di copertura. 16. Se sullo stesso disco sono configurati diversi kit o lotti Simplexa, è consigliabile testare i controlli molecolari di ogni kit. 17. La miscela master HS e la miscela RT contengono una percentuale di glicerolo superiore all'1% che può causare irritazione in caso di inalazione o contatto con la pelle. In caso di inalazione o contatto con la pelle, adottare le misure di primo soccorso.

4 Simplexa Dengue Pagina Si sconsiglia la conservazione protratta dei campioni estratti a temperature comprese tra 2 e 8 C, poiché non sono stati effettuati test per stabilire le prestazioni del test in queste condizioni. ISTRUZIONI PER L USO A. RACCOLTA DEI CAMPIONI L unico tipo di campione accettabile è il siero. Prelevare i campioni di sangue in modo asettico usando tecniche di puntura venosa approvate effettuate da personale qualificato. 11 Lasciare coagulare i campioni di sangue a temperatura ambiente prima di centrifugarli per separare il siero. Trasferire in modo asettico il siero in un contenitore sterile a chiusura ermetica per la cnservazione. Il siero separato non deve restare a temperatura ambiente per più di 8 ore. Se il saggio non verrà completato entro 8 ore, conservare il campione in frigorifero a 2 8 C. Se il saggio non verrà completato entro 48 ore, o per spedire i campioni, conservare a una temperatura pari o inferiore a -20 C. Non congelare/scongelare ripetutamente i campioni. 11 Scongelare e mescolare bene i campioni prima dell uso. B. ESTRAZIONE DEL CAMPIONE Estrazione mediante il metodo Roche MagNA Pure LC 1. Gli acidi nucleici vengono estratti dai campioni dei pazienti e dai controlli del test utilizzando il kit Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid e lo strumento Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor. Per eseguire l estrazione degli acidi nucleici utilizzando questo kit, fare riferimento alle istruzioni per l'uso del produttore. 2. Nel menu a discesa Protocol [Protocollo] sul sistema MagNA Pure LC, selezionare Total NA [Acidi nucleici totali], quindi Total NA Variable_elution_volume.blk dall elenco. In questo modo verranno caricate le impostazioni adeguate per la sessione. 3. Il Sample Protocol [Protocollo campione] deve essere Total NA Variable_elution_volume. 4. Impostare il Sample Volume [Volume campione] su 200 µl e il volume di eluizione su 50 µl. 5. Impostare il volume di diluizione su zero per tutti i campioni. 6. Verificare che il Post Elution Protocol [Protocollo post-eluizione] sia impostato su None [Nessuno]. 7. Verificare che i campioni e i controlli siano correttamente posizionati sulla cartuccia campione. 8. Miscelare con Vortex ogni campione e il controllo molecolare per 2-4 secondi e centrifugare brevemente, così che il contenuto scenda sul fondo della provetta. 9. Pipettare 200 µl di ogni campione, del controllo molecolare (MC) o del controllo privo di templato nella posizione corrispondente sulla cartuccia campione. 10. Controllare visivamente il livello dei campioni e dei controlli nella cartuccia campione per accertarsi che i campioni siano stati effettivamente aggiunti. 11. Miscelare 2 volte con colpi di Vortex il controllo interno di RNA e centrifugare brevemente per far scendere il contenuto sul fondo della provetta. 12. Pipettare 5 µl di controllo interno di RNA in ogni campione e in tutti i pozzetti di controllo. Sostituire i puntali tra un campione e l altro. 13. Trasferire la cartuccia campione contenente i campioni sullo strumento MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor e avviare la sessione di estrazione. 14. Una volta completata l estrazione degli acidi nucleici, la cartuccia contenente i controlli e i campioni dei pazienti estratti può essere rimossa dal MagNA Pure e sigillata. Prima dell'uso, conservare l'rna estratto a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C. A questa temperatura non è consigliata la conservazione a lungo termine dei campioni estratti. Conservare i campioni di RNA estratti al freddo durante il caricamento del disco. C. IMPOSTAZIONE DELLO STRUMENTO PER PCR IN TEMPO REALE 1. Fare riferimento al Manuale dell operatore dell Integrated Cycler per informazioni dettagliate su come configurare il software Integrated Cycler Studio e aggiungere una definizione dell analisi, impostare e analizzare le sessioni compiute con l Integrated Cycler. Nota: Vi sono due codici a barre distinti per l analisi; un codice a barre contiene la definizione d analisi per i sierotipi di dengue 1 & 4; il secondo codice a barre contiene la definizione d'analisi per i sierotipi di dengue 2 & 3. Sono necessari due segmenti di corsa per ottenere i risultati per tutti e quattro i sierotipi.

5 Simplexa Dengue Pagina 5 Disposizione del disco suggerita Per questa analisi sono necessari 2 segmenti Raggio 1 Raggio 2 Raggio 3 Raggio 4 Raggio 5 Raggio 6 Raggio 7 Raggio 8 Raggio 9 Raggio 10 Raggio 11 Raggio 12 A MC C8 C16 C24 C32 C40 MC C8 C16 C24 C32 C40 B C1 C9 C17 C25 C33 C41 C1 C9 C17 C25 C33 C41 C C2 C10 C18 C26 C34 C42 C2 C10 C18 C26 C34 C42 D C3 C11 C19 C27 C35 C43 C3 C11 C19 C27 C35 C43 E C4 C12 C20 C28 C36 C44 C4 C12 C20 C28 C36 C44 F C5 C13 C21 C29 C37 C45 C5 C13 C21 C29 C37 C45 G C6 C14 C22 C30 C38 C46 C6 C14 C22 C30 C38 C46 H C7 C15 C23 C31 C39 NTC C7 C15 C23 C31 C39 NTC Legenda: Miscela di reazione dengue 1 & 4 Miscela di reazione dengue 2 & 3 D. AREA DI PREPARAZIONE REAGENTI Area dedicata alla preparazione della miscela di reazione per il test Dengue. 1. Lasciare scongelare la miscela di primer e la miscela master HS a temperatura ambiente (tra 18 e 25 C circa). Prima di ogni uso, mescolare le miscele di primer, la miscela master HS e la miscela RT pipettando 6-8 volte, quindi centrifugare brevemente in modo che il contenuto scenda sul fondo della provetta. 2. Preparare il volume richiesto di ciascuna miscela di reazione in una provetta per microcentrifuga in polipropilene di adeguate dimensioni, pipettando il volume di ciascun componente. Volumi della miscela di reazione Miscela di reazione dengue 1 & 4 Voume Volume Reagente per 1 reazione per 10 reazioni HS Master Mix 4,0 µl 40 µl Simplexa Dengue 1 & 4 0,5 µl 5 µl Primer Mix RT 0,5 µl 5 µl Volume totale 5,0 µl 50 µl Volumi della miscela di reazione Miscela di reazione dengue 2 & 3 Volum Volume Reagente per 1 reazione per 10 reazioni HS Master Mix 4,0 µl 40 µl Simplexa Dengue 2 & 3 0,5 µl 5 µl Primer Mix RT 0,5 µl 5 µl Volume totale 5,0 µl 50 µl 3. Mescolare delicatamente ciascuna miscela di reazione pipettando 8-10 volte. 4. Centrifugare brevemente a bassa velocità in modo che il contenuto scenda sul fondo della provetta. 5. Procedere all impostazione della PCR. 6. Utilizzare le miscele di reazione entro un ora dalla preparazione. Se l'impostazione della PCR non verrà eseguita subito dopo la preparazione delle miscele di reazione, conservare queste ultime a 2-8 C fino al momento di procedere (entro un'ora). E. AREA DI AMPLIFICAZIONE MEDIANTE PCR IN TEMPO REALE Operare in un area dedicata alla preparazione dell Universal Disc a 96 pozzetti per il test Dengue. Quando si prepara il disco, utilizzare il blocco di caricamento per Universal Disc. Durante l'esecuzione della seguente procedura, fare riferimento all esempio di disposizione del disco nel paragrafo C: 1. Aggiungere 5,0 µl della miscela di reazione appropriata in ogni pozzetto. 2. Aggiungere 5,0 µl del controllo molecolare estratto a ciascun pozzetto MC.del disco 3. Aggiungere 5,0 µl del campione da analizzare estratto all appropriato pozzetto S del disco. 4. Aggiungere 5,0 µl del controllo privo di templato (No-Template Control, NTC) estratto a ciascun pozzetto NTC del disco. 5. Coprire il disco con il nastro di copertura per Universal Discs. 6. Aprire il coperchio dell Integrated Cycler. 7. Posizionare l Universal Disc sigillato sulla piastra. 8. Chiudere delicatamente il coperchio. 9. Fare clic su Run [Esegui]. 10. Fare clic su Start [Inizia].

6 Simplexa Dengue Pagina 6 F. ANALISI DEI DATI 1. Fare riferimento al Manuale dell operatore dell Integrated Cycler per informazioni dettagliate su come eseguire l analisi dei dati e su come esportare le sessioni, se necessario. LINEE GUIDA PER L ESAME DEI RISULTATI La refertazione dei risultati comprende tre passaggi. 1. Esame dei controlli per determinare se il segmento è valido. Se uno qualsiasi dei campioni programmati come controlli non è valido, il software Integrated Cycler Studio elimina l interpretazione dei risultati del paziente. 2. Esame della validità dei risultati relativi ai campioni dei pazienti. 3. Interpretazione dei risultati relativi ai pazienti. Se i controlli non sono validi, non è possibile interpretare i risultati dei pazienti. 1. Determinare la validità del segmento esaminando il controllo molecolare dengue, il controllo privo di templato e il controllo interno di RNA. \ privo di templato molecolare Criteri per stabilire la validità dei controlli (semplificati)* Segmento per Dengue 1 & 4 Segmento per Dengue 2 & 3 DV1 DV4 Ct RNA IC DV2 DV3 Ct RNA IC ,0, ,0, 0 40,0, 0 40,0, 0 Non applicabile (N/A) 40,0, 0 40,0, 0 Non applicabile (N/A) * Per una descrizione completa, leggere le note seguenti. a. privo di templato (NTC) (Segmento per Dengue 1 & 4) i. Se Ct=0 per DV1 e DV4 e Ct 40 per il controllo interno, il controllo è valido. b. privo di templato (NTC) (Segmento per Dengue 2 & 3) i. Se Ct=0 per DV2 e DV3 e Ct 40 per il controllo interno, il controllo è valido. c. molecolare (MC) (Segmento per Dengue 1 & 4) i. Se il risultato del Positivo è Ct = 0 per DV1 e DV4, il segmento d analisi è considerato non valido e non accettabile. Tutti i campioni dei pazienti devono essere rianalizzati. ii. Se i valori di Ct per DV1 e DV4 sono 40, ma 0, e il controllo privo di templato è valido, il segmento d analisi va considerato valido e accettabile. d. molecolare (MC) (Segmento per Dengue 2 & 3) i. Se il risultato del molecolare è Ct = 0 per DV2 e DV3, il segmento d analisi è considerato non valido e non accettabile. Tutti i campioni dei pazienti devono essere rianalizzati. ii. Se i valori di Ct per DV2 e DV3 sono 40, ma 0, e il controllo privo di templato è valido, il segmento d analisi va considerato valido e accettabile. 2. Esame dei risultati relativi ai campioni dei pazienti L esame dei risultati relativi ai campioni clinici deve essere eseguito dopo avere esaminato e determinato validi e accettabili i controlli molecolari e i controlli privi di templato. I risultati di DV1, DV4 e IC RNA e DV2, DV3 e RNA IC devono essere esaminati per ciascun segmento per ciascun campione del paziente. a. Per ogni risultato si dovrà esaminare la curva di amplificazione, con particolare attenzione nei casi in cui venga visualizzato il messaggio Data Quality [Qualità dei dati]. Una curva di amplificazione valida presenta un aumento esponenziale uniforme. Fare riferimento al manuale dell operatore per le azioni consigliate.

7 Simplexa Dengue Pagina 7 Curva di amplificazione valida Curva di amplificazione valida Curva di amplificazione non valida b. Se la curva di amplificazione è valida per il target, non è necessario che il controllo interno di RNA presenti un risultato positivo. 3. Interpretazione dei risultati Esempio DV1 valore Ct Interpretazione dei risultati Segmento per Dengue 1 & 4 Segmento per Dengue 2 & 3 DV4 RNA IC Interpretazione DV2 DV3 RNA IC Interpretazione valore Ct Valore Ct* valore Ct valore Ct Valore Ct* ,0, ,0, 0 0 N/A ,0, 0 N/A 4 40,0, 0 40,0, 0 N/A ,0, ,0, ,0, DV1 e DV4 DV1 Detected [Rilevato] DV4 Detected [Rilevato] DV1 e DV4 Detected [Rilevati] DV1 e DV4 DV1 e DV4 DV1 e DV4 Non valido, estrarre nuovamente e ripetere il segmento ,0, ,0, ,0, ,0, 0 40,0, 0 0 N/A 0 40,0, 0 N/A 40,0, 0 40,0, 0 N/A DV2 e DV3 DV2 e DV3 DV2 e DV3 DV2 e DV3 DV2 Detected [Rilevato] DV3 Detected [Rilevato] DV2 e DV3 Detected [Rilevati] N/A N/A N/A N/A 9 N/A N/A N/A N/A Ct = soglia ciclo. Detected [Rilevato] indica un valore Ct 40,0. rilevato] indica un valore Ct = 0 *Il rilevamento del controllo interno di RNA Simplexa non è necessario per la refertazione di un risultato rilevato. Non valido, estrarre nuovamente e ripetere il segmento. LIMITAZIONI 1. Per uso diagnostico in vitro. 2. Solo per l esportazione. 3. Il saggio è destinato all uso con campioni di siero; non è stato valutato con altri tipi di campione. 4. Il rilevamento dell acido nucleico virale dipende dalla correttezza delle operazioni di prelievo, manipolazione, trasporto, conservazione e preparazione del campione, compresa l estrazione. La mancata osservanza delle corrette procedure in una qualsiasi di queste fasi può produrre risultati errati.

8 Simplexa Dengue Pagina 8 5. Il test deve essere eseguito solo da personale adeguatamente formato e che abbia acquisito familiarità con le procedure d esame e l'interpretazione dei risultati. 6. Tutti i risultati derivanti da questo e da altri test devono essere messi in correlazione con l'anamnesi clinica, i dati epidemiologici e gli altri dati in possesso del medico che esamina il paziente. 7. La prevalenza dell infezione influisce sul valore predittivo del test. 8. Come accade per altri test, un risultato negativo non esclude la presenza di infezioni con virus dengue. 9. Si possono avere risultati falsi negativi quando il microrganismo infettante presenti mutazioni, inserzioni, delezioni o riarrangiamenti del genoma, o se il test viene eseguito in una fase molto precoce della malattia. 10. Si possono avere risultati falsi negativi se il campione contiene un numero inadeguato di microrganismi a causa di prelievo, trasporto o manipolazione non corretti. 11. Come accade per altri test, si possono avere risultati falsi positivi. In alcuni casi, può essere indicato ripetere il test o eseguirlo con un dispositivo differente. 12. Questo è un test qualitativo e non fornisce informazioni sul valore quantitativo del microrganismo rilevato. 13. Questo test non può escludere la presenza di malattie causate da altri patogeni batterici o virali. CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI COMPARAZIONE DEI METODI Un insieme di 179 campioni con risultati della PCR per il virus dengue precedentemente caratterizzati è stato fornito dall US Center of Disease Control and Prevention (CDC). I campioni sono stati analizzati con il saggio Simplexa Dengue e confrontati con i risultati precedenti riportati dal CDC. Tabella 1: Virus dengue 1 Confronto con risultati precedenti Risultato precedente CDC Simplexa Dengue DV1 n Rilevato Non rilevato Rilevato Non rilevato a 136 % Concordanza (osservati/attesi) IC al 95% PPA: 100,0%(32/32) IC 95%: da 89,3 a 100,0% NPA: 92,5%(136/147) IC 95%: da 87,1 a 95,8% PPA = Positive Percent Agreement ( Percentuale di concordanza positivi), NPA = Negative Percent Agreement (Percentuale di concordanza negativi) a In seguito a ripetizione dell analisi, 5 campioni su 11 sono stati rilevati mediante il saggio Simplexa Dengue e mediante un saggio interno all azienda basato sulle pubblicazioni del CDC. I restanti 6 non sono stati rilevati mediante il saggio basato sulle pubblicazioni del CDC. Tabella 2: Virus dengue 2 Confronto con risultati precedenti Risultato precedente CDC Simplexa Dengue DV2 N Rilevato Non rilevato Rilevato b Non rilevato b 148 % Concordanza (osservati/attesi) IC al 95% 96,7%(29/30) IC 95%: da 83,3 a 99,4% 99,3%(148/149) IC 95%: da 96,3 a 99,9% PPA = Positive Percent Agreement (Percentuale di concordanza positivi), NPA = Negative Percent Agreement (Percentuale di concordanza negativi) b I risultati sono rimasti invariati dopo ripetizione dell analisi. Tabella 3: Virus dengue 3 Confronto con risultati precedenti Risultato precedente CDC Simplexa Dengue DV3 N Rilevato Non rilevato Rilevato Non rilevato % Concordanza (osservati/attesi) IC al 95% 100,0%(29/29) IC 95%: da 88,3 a 100,0% 100,0%(150/150) IC 95%: da 97,5 a 100,0% PPA = Positive Percent Agreement (Percentuale di concordanza positivi), NPA = Negative Percent Agreement (Percentuale di concordanza negativi)

9 Simplexa Dengue Pagina 9 Tabella 4: Virus dengue 4 Confronto con risultati precedenti Risultato precedente CDC Simplexa Dengue DV4 N Rilevato Non rilevato Rilevato c Non rilevato d 133 % Concordanza (osservati/attesi) IC al 95% 97,4%(37/38) IC 95%: da 86,5 a 99,5% 94,3%(133/141) IC 95%: da 89,2 a 97,1% PPA = Positive Percent Agreement (Percentuale di concordanza positivi), NPA = Negative Percent Agreement (Percentuale di concordanza negativi) c I risultati sono rimasti invariati dopo ripetizione dell analisi d In seguito a ripetizione dell analisi, 2 campioni su 8 sono stati rilevati come DV4 mediante il saggio Simplexa Dengue e mediante un saggio interno all azienda basato sulle pubblicazioni del CDC. Un campione è stato rilevato come DV1 e un campione è stato rilevato come DV2 in entrambi i saggi. I due campioni rimanenti non sono stati rilevati in seguito a ripetizione dell analisi in entrambi i saggi. RIPRODUCIBILITÀ La riproducibilità del saggio Simplexa Dengue è stata valutata mediante tre diversi strumenti. Un insieme di campioni e il controllo molecolare sono stati analizzati in triplicato su ogni strumento due volte al giorno per un totale di cinque giorni. Il controllo negativo è stato analizzato una volta per ciascuna sessione. Ogni strumento è stato analizzato da un operatore che ha saggiato l intero insieme dei campioni due volte al giorno, per un totale di due gruppi di dati al giorno. La riproducibilità della risposta qualitativa dello strumento e una valutazione dei diversi componenti di variabilità del valore Ct sono riportate nelle tabelle seguenti. Tabella 5: Riproducibilità della risposta qualitativa Miscela di reazione 1 & 4 Miscela di reazione 2 & 3 DV1 DV4 To DV2 Nome del Tot Nome del Non Non campione ale Rilevato rilevato rilevato Rilevato tal Non campione Rilevato e rilevato Dengue-1 bassa Dengue-1 media Dengue-4 bassa Dengue-4 media Negativo negativo molecolare Dengue-2 bassa Dengue-2 media Dengue-3 bassa Dengue-3 media Non rilevato DV3 Rilevato Negativo negativo molecolare Tabella 6: Riproducibilità della risposta dello strumento (valori Ct) Componente della varianza Target Campione N Ct medio DV1 DV2 Tra strumenti Intersessione Inter-giorno /operatoridiversi Intra-test (ripetibilità) Totale DS %CV DS %CV DS %CV DS %CV DS %CV Dengue ,2 0,44 1,3 0,16 0,4 0,10 0,3 0,46 1,3 0,66 1,9 bassa Dengue ,5 0,54 1,6 0,22 0,7 0,00 0,0 0,29 0,9 0,65 1,9 media molecolare 90 34,3 0,49 1,4 0,26 0,8 0,00 0,0 0,38 1,1 0,67 2,0 Dengue ,5 0,33 1,0 0,19 0,6 0,19 0,6 0,37 1,1 0,57 1,7 bassa Dengue ,9 0,45 1,4 0,48 1,5 0,00 0,0 0,23 0,7 0,70 2,2 media molecolare 90 33,2 0,37 1,1 0,59 1,8 0,11 0,3 0,49 1,5 0,86 2,6

10 Simplexa Dengue Pagina 10 Target Campione N Ct medio DV3 DV4 Componente della varianza Tra strumenti Intersessione (ripetibilità) Intra-test Inter-giorno Totale /operatoridiversi DS %CV DS %CV DS %CV DS %CV DS %CV Dengue ,2 0,51 1,3 0,22 0,6 0,62 1,6 0,87 2,3 1,21 3,2 bassa Dengue ,0 0,58 1,7 0,63 1,9 0,00 0,0 0,26 0,8 0,89 2,7 media molecolare 90 33,4 0,54 1,6 0,42 1,3 0,00 0,0 0,29 0,9 0,75 2,2 Dengue ,4 0,00 0,0 0,24 0,7 0,00 0,0 0,79 2,2 0,82 2,3 bassa Dengue ,0 0,27 0,8 0,10 0,3 0,00 0,0 0,17 0,5 0,33 1,0 media molecolare 90 34,4 0,37 1,1 0,29 0,8 0,00 0,0 0,38 1,1 0,60 1,7 Ai risultati Non rilevati è assegnato un Ct di 40,1 ai fini dell analisi di riproducibilità SENSIBILITÀ ANALITICA / LIMITE DI RILEVAMENTO Il limite di rilevamento (LoD) per il saggio Simplexa Dengue è stato determinato utilizzando stock già quantificati di ceppi del virus dengue diluiti in serie in siero umano. Il limite di rilevamento per ogni test è stata definito come la concentrazione più bassa con un rilevamento 95% (almeno 19 replicati su 20). Tabella 7: Riassunto dei limiti di rilevamento Sierotipo dengue Ceppo virale Limite di rilevamento (LOD) (UFP/ml) Dengue-1 WHO WEST PAC 74 0,16 Dengue-2 WHO-S ,0 Dengue-3 WHO-CH ,2 Dengue-4 TVP-360 0,2 REATTIVITÀ ANALITICA Oltre ai ceppi esaminati per il LoD, è stata valutata nel saggio la corretta reattività di un ceppo aggiuntivo di sierotipo del virus dengue. Il materiale virale a concentrazione nota è stato addizionato a sieri umani negativi in diluizione singola alla concentrazione indicata nella tabella sottostante e analizzato in triplicato. Tutti i ceppi analizzati sono stati rilevati adeguatamente con la miscela di reazione appropriata. Tabella 8: Riassunto delle reattività analitiche Ceppo virale Concentrazione analizzata Rilevati / Totale Miscela di reazione 1 & 4 Miscela di reazione 2 & 3 DV1 DV4 DV2 DV3 Dengue 1, Hawaii non disponibile 3/3 0/3 0/3 0/3 Dengue 2, New Guinea C 1, TCID 50/ml 0/3 0/3 3/3 0/3 Dengue 3, H87 1, TCID 50/ml 0/3 0/3 0/3 3/3 Dengue 4, H241 Sm14 1, TCID 50/ml 0/3 3/3 0/3 0/3 CROSS-REATTIVITÀ La specificità analitica del dosaggio Simplexa è stata valutata testando la capacità di identificare in modo esclusivo il virus dengue, senza cross-reattività verso i microrganismi che sono strettamente correlati, che causano sintomi clinici simili o che sono presenti come flora normale nei tipi di campione in questione. Ciascuno dei ventotto (28) potenziali cross-reagenti è stato addizionato individualmente a siero umano negativo in concentrazioni clinicamente rilevanti. È stata testata anche la matrice non addizionata i per essere utilizzata come livello basale. I campioni sono stati testati in triplicato per vagliare la cross-reattività. Nei casi in cui è stato rilevato un segnale in uno qualsiasi dei canali di rilevamento (DV1, DV2, DV3, DV4) in uno qualsiasi dei tre replicati, sono stati testati a titolo di conferma altri 5 replicati. Non è stata rilevata alcuna cross-reattività.

11 Simplexa Dengue Pagina 11 Tabella 9: Riassunto della cross-reattività Cross-reagente Concentrazione analizzata Rilevati / Totale Miscela di reazione 1 & 4 Miscela di reazione 2 & 3 DV1 DV4 DV2 DV3 Liquido di coltura adenovirus (tipo 1) 1, DICT 50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 Liquido di coltura adenovirus (tipo 7A) 1, DICT 50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 Aspergillus sconosciuta 0/3 0/3 0/3 0/3 Virus BK 1, copie/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 Virus Chikungunya 1, DICT 50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 Citomegalovirus (CMV) 1, DICT 50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 Enterovirus 71 1, DICT 50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 Virus di Epstein Barr (EBV) 1, copie/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 virus dell epatite B 5, UI/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 virus dell epatite C 1, UI/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 Virus dell epatite D sconosciuta 0/3 0/3 0/3 0/3 HIV-1 1, copie/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 HIV-2 sconosciuta 0/3 0/3 0/3 0/3 HSV-1 1, DICT 50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 HSV-2 1, DICT 50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 HTLV-1 sconosciuta 0/3 0/3 0/3 0/3 Herpesvirus umano -6 1, DICT 50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 Herpesvirus umano -7 1, DICT 50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 Herpesvirus umano -8 1, DICT 50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 DNA di Mycobacterium tuberculosis 1, µg/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 Parechovirus 1, DICT 50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 parvovirus B19 1, UI/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 Rubella virus 1, DICT 50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 Virus dell encefalite di St. Louis 1, DICT 50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 Toxoplasma gondii 1, TachyzoitI/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 Virus varicella-zoster 1, copie/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 Virus del Nilo occidentale sconosciuta 0/3 0/3 0/3 0/3 Virus della febbre gialla 1, DICT 50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3 INTERFERENZE Non sono state valutate le prestazioni di questo test in presenza di sostanze potenzialmente interferenti. Il processo di estrazione automatizzata degli acidi nucleici rimuove efficacemente le impurità dal campione in quanto prevede l isolamento e il lavaggio degli acidi nucleici. I controlli interni avvisano l'utente finale della possibile inibizione della PCR; se tutti i target e il controllo interno non vengono rilevati il test non è valido. CONTAMINAZIONE DA CARRYOVER Il carryover dell amplificato è stato valutato per lo strumento e l'universal Disc utilizzando altri saggi. Questi studi hanno ricercato la presenza di contaminazioni in campioni altamente negativi. Ogni studio è stato impostato posizionando alternativamente su ogni disco un campione altamente positivo ed uno altamente negativo. L effetto da carryover è stato valutato confrontando il tasso di negativi osservato per i campioni altamente negativi con il tasso atteso, nelle normali condizioni di riproducibilità. Nei test eseguiti non è stato osservato alcun effetto dovuto a contaminazioni da carryover. CONTROLLO DI QUALITÀ Ogni laboratorio deve stabilire i propri intervalli di valori per il controllo qualità e la frequenza di tali controlli, in base alle leggi e ai regolamenti locali applicabili e alle buone pratiche di laboratorio standard.

12 Simplexa Dengue Pagina 12 BIBLIOGRAFIA 1 Halstead, SB Immunological parameters of togavirus disease syndromes. p In RW Schlesinger (ed.), The Toga Viruses. Academic Press, Inc., New York. 2 WHO, Dengue Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control, New edition (2009) WHO/HTM/NTD/DEN/ CDC 4 Gubler, DJ Aedes aegypti and Aedes aegypti-borne disease control in the 1990 s: top down or bottom up. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40: WHO 6 Halstead, SB Antibody, Macrophages, Dengue Virus Infection, Shock, and Hemorrhage: A Pathogenic Cascade. Rev. of Inf. Dis. 11:S830-S839 7 MMWR May 21, 2010 / 59(19); Laue T, Emmerich P, Schmitz H. Detection of dengue virus RNA in patients after primary or secondary dengue infection by using the TaqMan automated amplification system. J Clin Microbiol Aug; 37(8): Chang GJ, Trent DW, Vorndam AV, Vergne E, Kinney RM, Mitchell CJ. An integrated target sequence and signal amplification assay, reverse transcriptase-pcr-enzyme-linked immunosorbent assay, to detect and characterize flaviviruses. J. Clin. Microbiol Feb; 32(2): Muñoz-Jordán J.L., Collins CS, Vergne E, et al. Highly sensitive detection of dengue virus nucleic acid in samples from clinically ill patients. J Clin Microbiol 2009; 47: CLSI H18-A4. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline. 4th Ed. (2010). L uso delle sonde Scorpions per la diagnostica in vitro nell'uomo è coperto da una licenza concessa da DxS, Ltd a Focus Diagnostics, Inc. I coloranti Black Hole Quencher, CAL Fluor e Quasar sono marchi di fabbrica di Biosearch Technologies, Inc. ('BTI'). La tecnologia con colorante Black Hole Quencher, CAL Fluor e Quasar è concessa in licenza ai sensi dell accordo con BTI e tali prodotti sono venduti a solo scopo clinico, diagnostico o di ricerca e sviluppo. RAPPRESENTANTE AUTORIZZATO mdi Europa GmbH, Langenhagener Str , Langenhagen-Hannover, Germania INFORMAZIONI PER GLI ORDINI Telefono: Fax: ASSISTENZA TECNICA (800) (solo USA) (562) (562) (dall'estero) PI.MOL3100.OUS.IT Rev. C Data di redazione: 26 aprile 2012 Telefono: Fax: (800) (solo USA) (562) Visitate il nostro sito web all indirizzo (562) (dall estero) Cypress, California USA