CARATTERIZZAZIONE DI UNA SOLUZIONE OTTENUTA DA CAGLIO IN PASTA ARTIGIANALE D AGNELLO, IMPIEGATA NELLA PRODUZIONE DEL PECORINO DI PICINISCO

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1 SCIENZA E TECNICA LATTIERO-CASEARIA, 59 (5), CARATTERIZZAZIONE DI UNA SOLUZIONE OTTENUTA DA CAGLIO IN PASTA ARTIGIANALE D AGNELLO, IMPIEGATA NELLA PRODUZIONE DEL PECORINO DI PICINISCO Katya CARBONE 1 *, Barbara FERRI 1, Giuliano PALOCCI 1, Donata SETTINERI 1, Carmela TRIPALDI 1 INTRODUZIONE Il Pecorino di Picinisco è un formaggio tradizionale laziale per il quale è stata presentata richiesta per il riconoscimento della DOP [1]. Nel disciplinare è definito che deve essere utilizzato caglio in pasta di capretto o d agnello proveniente esclusivamente da animali allevati nella zona di produzione. Le tecniche di preparazione del caglio in pasta artigianale descritte dai vari Autori o sperimentate sono molteplici ed influenzano tanto il corredo proteolitico quanto quello lipolitico [2]. Nell area di produzione del Pecorino di Picinisco è diffuso l utilizzo di caglio in pasta di produzione aziendale, preparato con modalità differenti tra azienda ed azienda, sia per quanto riguarda l uso dell intero cagliolo, ovvero solo del suo contenuto interno (gemma), sia per la tecnica di preparazione e stagionatura [1, 3, 4]. Inoltre, da studi condotti nella zona di Picinisco è risultata diffusa anche la pratica di preparare una soluzione di caglio, qualche giorno prima dell utilizzo in caldaia, da utilizzare poi per un periodo più o meno lungo. Tale soluzione è utilizzata da decenni anche nella preparazione della Feta greca [5] Obiettivo di questa ricerca è stato quindi quello di analizzare le caratteristiche chimico-fisiche e biochimiche, nonché la stabilità temporale, di una soluzione acquosa ottenuta da caglio in pasta d agnello di produzione artigianale utilizzata nella produzione del Pecorino di Picinisco. MATERIALI E METODI a) Preparazione della soluzione coagulante La soluzione è stata preparata macerando un cagliolo intero (stagionato mediante salatura ed asciugatura per 90 gg) in acqua, nel rapporto 1:5 (p/v). La sospensione è stata quindi filtrata e la soluzione derivante mantenuta a 4 C per tutta la durata della prova (15 giorni). b) Determinazione delle proteine solubili totali Il contenuto proteico solubile totale dell estratto enzimatico è stato determinato mediante il metodo di Bradford [6], usando IgG bovina come standard. * Corrispondenza ed estratti: katya.carbone@entecra.it 1 Consiglio per la ricerca e sperimentazione in agricoltura-centro di ricerca per le produzioni delle carni ed il miglioramento genetico. Via Salaria 31, Roma.

2 c) Saggi enzimatici L attività lipolitica della soluzione di caglio è stata determinata con il metodo titrimetrico, (Reagent Chemicals ACS Specification, [7] con alcune modifiche [4]), utilizzando tre diversi substrati ed incubando la miscela di reazione a 37 C. (i) Triacetina (C3). La miscela di reazione consiste di Tris-HCl 150mM, ph 7,4 e triacetina 330mM. (ii) Tributirrina (C4). La miscela di reazione è ottenuta disperdendo 9,7 ml di tributirrina in 3,0 ml di acetonitrile - utilizzato come agente solubilizzante [8]- e portando a volume con tampone Tris/HCl 150 mm, ph 7,6. (iii) Trioleina (C18). L attività lipolitica è determinata utilizzando un substrato ottenuto miscelando 2,5 ml di acqua deionizzata, 1,00 ml di tampone (Tri-HCl 200mM, ph 7,7) e 3,0 ml di substrato emulsionato (trioleina in 3% (v/v) acetonitrile [8]). Si definisce un unità enzimatica quella che idrolizza 1,0 microequivalente di acido grasso da un trigliceride, in 1 ora, alle condizioni sopraccitate. d) Elettroforesi in condizioni denaturanti (SDS-PAGE) I campioni proteici sono stati corsi su un gel elettroforetico di poliacrilammide al 10% in condizioni denaturanti (SDS PAGE), seguendo il metodo di Laemnli [9] ed utilizzando come marker molecolare il Broad Range (MM) della Bio-rad (Bio-rad laboratories, Milano, Italia). Le corse elettroforetiche (sono state eseguite tre replicate della corsa) sono state effettuate a 200V per 75 min. I campioni sono stati diluiti 1:1 (v/v) con tampone denaturante (Tris-HCl 62,5 mm, ph 6,8; 20% glicerolo, 2% SDS, 5% b-mercaptoetanolo) e bolliti a 95 C per 5 min, quindi caricati in ciascun pozzetto alla stessa concentrazione (20 mg proteina/pozzetto). Dopo la separazione elettroforetica, i gels sono stati colorati per 2 ore a temperatura ambiente con una soluzione allo 0,1 % di Coomassie Brilliant Blue R250. Quindi le bande elettroforetiche sono state visualizzate con una soluzione al 7,5% di acido acetico e 5% di metanolo (v/v). RISULTATI E DISCUSSIONE I dati ottenuti (Tab.1) mostrano un elevata attività lipolitica su C4, di molto superiore a quella del corrispondente cagliolo in pasta. Le attività lipolitiche Tabella 1 Confronto tra i parametri chimico fisici e biochimici medi della soluzione di caglio e del caglio in pasta di provenienza. Table 1 Rennet solution vs rennet paste: a comparison between the average physicochemical and biochemical values. 2 Carbone et al (2008) Sci Tecn Latt-Cas, 59 (5),

3 della soluzione su C3 e C18 sono invece inferiori rispetto ai valori trovati per la tributirrina e pressoché simili tra loro, ma comunque maggiori di quelle del cagliolo di provenienza (per il quale, però è stato possibile analizzare solo l attività su C18). Le attività lipolitiche sono stabili nel tempo, ad eccezione di quella su C4 che decresce sensibilmente dopo 15 giorni (-26%). L andamento temporale del ph mostra una leggera acidificazione della soluzione rispetto alle condizioni iniziali (Tab.2). Il profilo elettroforetico mostra bande di peso molecolare compreso tra 45 e 31 kda e al di sotto di 14,4 kda, simili a quelle evidenziate nell esterasi da fegato di maiale, utilizzata come confronto di un preparato enzimatico a carattere esterasico. Si evidenzia inoltre una banda BSA-like, già riportata da altri Autori (Fig. 1) [10]. È da evidenziare che durante la trasformazione di questo formaggio la dose di soluzione utilizzata è inferiore rispetto a quella adoperata sia di caglio in pasta che di caglio liquido commerciale, il che fa presumere che l attività coagulante della soluzione sia più elevata. Tabella 2 Variazioni del ph della soluzione nel tempo. Table 2 ph trend of the rennet solution during the trial. Figura 1 Profili elettroforetici di una soluzione di caglio d agnello in pasta. Figure 1 Electrophoretic profile of the rennet solution. Carbone et al (2008) Sci Tecn Latt-Cas, 59 (5),

4 CONCLUSIONI I risultati ottenuti, sebbene preliminari, mostrano come questa pratica è, da un punto di vista biochimico, un vero e proprio processo di estrazione e purificazione dei complessi enzimatici presenti nei caglioli, permettendo di ottenere in tal modo un concentrato proteico che aumenta le prestazioni della preparazione in termini lipolitici. RIASSUNTO Il presente lavoro riporta i dati relativi all analisi chimica, chimico fisica e biochimica di una soluzione acquosa ottenuta da caglio d agnello in pasta prodotto artigianalmente ed utilizzato nella produzione del Pecorino di Picinisco (formaggio tradizionale del Lazio). I risultati ottenuti evidenziano come l usanza artigianale di macerare il caglio in pasta in acqua produca l estrazione selettiva dei componenti enzimatici presenti nel caglio di partenza, operando in tal modo un vero e proprio processo di purificazione enzimatica. L effetto finale è una soluzione arricchita in componenti lipolitiche ad attività maggiore di quella del caglio di partenza, con un ottima stabilità temporale dell estratto. Parole chiave: caglio d agnello, Pecorino di Picinisco, lipolisi SUMMARY Characterization of an enzymatic solution obtained from artisanal lamb paste and employed in Pecorino of Picinisco manufacture. In the present work we show data obtained with the chemical, physicochemical and biochemical analyses of a water solution coming from artisanal lamb rennet paste, normally used in the Pecorino of Picinisco manufacturing process. Obtained results clearly show how the artisanal procedure of rennet maceration in water translates itself into a real enzymatic purification process. The final result is a solution rich in lipolytic components with a higher enzymatic activity than the one of the starting rennet. Keywords: lamb rennet, Pecorino di Picinisco, lipolysis Ringraziamenti: Poster presentato al I Congresso Lattiero-Caseario AITeL. Bologna, 12 giugno 2008 Acquisizioni scientifiche e valorizzazione del latte e dei derivati: aspetti genetici, ambientali e tecnologici. BIBLIOGRAFIA 1) Tripaldi C, Angelucci M, Saltalamacchia F, Scossa A, Di Marco A (2004). Formaggi tradizionali del Lazio. Aspetti tecnologici e caratteristiche chimicofisiche. Sci. Tec. Cas. Ric., 8, ) Carbone K., Ferri B., Tripaldi C., Palocci G., Settineri D. (2008). Il caglio in pasta: effetti delle tecniche di preparazione sull attività enzimatica e ruolo della frazione lipolitica. Sci. Tecn. Latt.-Cas, 59, ) Tripaldi C, Di Bernardini R, Carbone K, Angelucci M, Settineri D (2006). Primi risultati di un indagine sul formaggio tradizionale Pecorino di Picinisco. Sci. Tecn. Latt.-Cas., 57, Carbone et al (2008) Sci Tecn Latt-Cas, 59 (5),

5 4) Ferri B (2007). Caratteristiche chimiche ed enzimatiche del caglio in pasta d agnello artigianale in relazione alle tecniche di produzione. Tesi di Laurea Specialistica, Università degli studi della Tuscia di Viterbo. 5) Moatsou G, Moschopoulou E, Georgala Aik, Zoidou E, Kandarakis I, Kaminarides S, Anifantakis E (2004). Effect of artisanal liquid rennet from kids and lambs abomasa on the characteristics of Feta cheese. Food Chem., 88, ) Bradford M (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem., 72, ) Reagent Chemical ACS Specification. (1993), 8th ed., 95. 8) Plou FJ, Sogo M, Calvo V, Burguillo FJ, Ballestreros A (1997). Kinetic and enantioselective behavior of isoenzymes A and B from Candida rugosa lipase in the hydrolysis of esters. Biocatalysis and. Biotransformations, 15, ) Laemnli UK (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, ) D Souza TM, Oriel P (1992). Purification and characterization of lamb pregastric lipase. Appl. Biochem. Biotech., 36, Carbone et al (2008) Sci Tecn Latt-Cas, 59 (5),

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