DETERMINAZIONE DEL LISOZIMA DA BIANCO D UOVO NEL FORMAGGIO: UN APPROCCIO MEDIANTE TECNICHE DI CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO

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1 SCIENZA E TECNICA LATTIERO-CASEARIA, 60 (3), DETERMINAZIONE DEL LISOZIMA DA BIANCO D UOVO NEL FORMAGGIO: UN APPROCCIO MEDIANTE TECNICHE DI CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO Giorgio PANARI 1 *, Simona FILIPPI 1 INTRODUZIONE Da quando è stato autorizzato nella tecnologia casearia, la determinazione del lisozima da bianco d uovo rappresenta uno strumento necessario per controllare la conformità dei formaggi alle leggi che disciplinano l uso e l etichettatura di questo additivo e per verificare l autenticità di prodotti per i quali l uso non è consentito, come il Parmigiano-Reggiano. Oltre ai saggi biologici, basati sull attività litica del lisozima sulle cellule del Micrococcus lysodeikticus, sono stati proposti metodi basati sulla HPLC ma la loro applicazione presenta elementi di problematicità dovuti alla difficoltà di estrarre il lisozima dal formaggio e alla bassa sensibilità dei sistemi di rilevazione che utilizzano l assorbimento nell UV [1]. Nella ricerca si è studiato la possibilità di estrarre in modo quantitativo il lisozima con l uso di resine a scambio ionico e la determinazione HPLC con una colonna a scambio ionico forte. MATERIALI E METODI a) Estrazione del lisozima 5 g di formaggio sono spappolati in mortaio con 10 ml di sodio citrato 0,1M e, quindi, trasferiti quantitativamente in un beker con 85 ml di tampone fosfato M/15 ph 6,5. Si lascia in agitazione per 2-3 ore e si elimina il grasso affiorato con una spatola. 50 ml della sospensione vengono aggiunti a 2,5 g di una resina a scambio cationico debole contenente gruppi carbossilici (Biorex 70 Biorad), previamente condizionata con il tampone fosfato. Si lascia in agitazione per 12 ore. Dopo aver decantato la fase acquosa, la resina è trasferita in una colonna di vetro, aiutandosi con il tampone fosfato. Dopo che la resina si è sedimentata e il tampone è defluito fino alla sommità della colonna, si aggiungono 15 ml di NaCl 1M nel tampone fosfato e si eluisce il lisozima, raccogliendo frazioni da 1-2 ml in provette graduate. b) Verifica dell efficacia della procedura Delle frazioni raccolte dalla resina che provenivano da un campione di formaggio fatto con l aggiunta di lisozima e di aliquote degli estratti prelevate prima e dopo il trattamento con la resina, è stata valutata l attività litica su cellule di Micrococcus lysodeikticus mediante * Corrispondenza ed estratti: panari@parmigiano-reggiano.it 1 Consorzio Formaggio Parmigiano-Reggiano. Via Kennedy 18, Reggio Emilia.

2 diffusione in agar 1% [2]. Nei pozzetti, del diametro di 2 mm, si inserivano 20 µl. Le frazioni che mostravano attività litica sono state riunite per la successiva analisi mediante HPLC. Lo stesso procedimento è stato applicato a campioni di Parmigiano-Reggiano, raccogliendo l eluito dalla resina con le stesse modalità. c) Determinazione del lisozima mediante HPLC Gli estratti eluiti dalla resina sono stati analizzati mediante HPLC usando una colonna a scambio cationico forte (SCX - Polymer) e un detector UV a 280 nm. Per l eluizione si sono usati un tampone morfolin-etan-solfonato ph 6 (A) e una soluzione di NaCl 1M nello stesso tampone (B) e si è adottato un gradiente lineare da B 5% a B 80% in 25 minuti. Il picco del lisozima da bianco d uovo è stato individuato mediante il confronto con il cromatogramma di soluzioni di lisozima puro (Sigma). Per verificare la presenza del lisozima bovino in campioni di formaggi ottenuti senza l aggiunta di lisozima da bianco d uovo, anziché la diffusione in agar, che aveva portato a interpretazioni contradditorie, probabilmente per i lunghi tempi necessari allo sviluppo di aloni, sono state raccolte frazioni da 0,4 ml dell eluito dalla colonna HPLC e a queste sono state aggiunte sospensioni allo 0,03% di cellule di Micrococcus lysodeikticus in tampone fosfato, valutando la loro chiarificazione nel tempo. RISULTATI E DISCUSSIONE La figura 1 riproduce la foto in negativo di una lastra per la valutazione dell attività litica nelle diverse fasi della procedura di estrazione. Nei pozzetti sono state inserite le sospensioni del formaggio prelevate prima del trattamento con la resina carbossilica (E 1 ) e dopo il trattamento (E 2 ) e il liquido che defluiva dalla colonna di vetro (E 3 ), durante il trasferimento della resina stessa. I pozzetti contrassegnati con la lettera F corrispondono alle frazioni eluite con NaCl 1M, raccolte in successione. Infine, si sono applicate soluzioni contenenti quantità note di lisozima, rispettivamente 17 mg/ml (S 1 ) e 22 mg/ml (S 2 ), e un bianco (S 0 ), costituito dal tampone fosfato. La figura mostra che, dopo le prime due frazioni (F 1 e F 2 ), che rappresenta- Figura 1 Fotografia in negativo di una lastra di diffusione in agar (per le sigle vedi testo). Figure 1 Photograph in the negative of a lysoplate assay (for the abbreviations see text). 262 Panari et Filippi (2009) Sci Tecn Latt-Cas, 60 (3),

3 no al volume morto della colonna e non hanno attività, quelle successive (da F 3 a F 7 ) producono aloni di lisi. I loro diametri sono più larghi rispetto a quello di E 1 e mettono in evidenza una concentrazione del lisozima nelle frazioni che eluiscono dalla resina. L assenza di alone in E 2 e la somma delle attività litiche provano che il lisozima è stato recuperato in modo efficiente. Nella figura 2 sono riportati i profili HPLC degli estratti recuperati dalla resina carbossilica, provenienti da un campione di formaggio prodotto con l aggiunta di lisozima da bianco d uovo e da un campione di Parmigiano-Reggiano. Il grafico a mette in evidenza che con il metodo di estrazione adottato si ottengono soluzioni per la cromatografia liquida con un alto grado di purificazione e questo fatto ha consentito l uso di rivelatori UV. Nel grafico b il rettangolo grigio Figura 2 Profilo HPLC degli estratti ottenuti da formaggi prodotti (a) con l uso di lisozima e (b) senza l uso di lisozima (Parmigiano-Reggiano). Figure2 Chromatograms of the extracts obtained from samples of cheese produced (a) with and (b) without egg white lysozyme (Parmigiano-Reggiano). Panari et Filippi (2009) Sci Tecn Latt-Cas, 60 (3),

4 indica i tempi ritenzione delle frazioni che hanno mostrato attività litica verso le sospensioni delle cellule di Micrococcus lysodeikticus. I picchi che appaiono in questa zona hanno un area molto inferiore a quella del lisozima da bianco d uovo che compare nell altro grafico e probabilmente corrispondono al lisozima bovino. Una conferma potrebbe venire dalle prove di estrazione di questo enzima dal latte, attualmente in corso. Inoltre, i tempi si ritenzione di questi picchi, benché siano molto prossimi a quelli del lisozima da bianco d uovo, non sembrano coincidere esattamente. CONCLUSIONI La sperimentazione vuole essere un contributo alla definizione di metodi utili alla valutazione del lisozima da bianco d uovo aggiunto nella tecnologia casearia. La metodica oggetto della ricerca è piuttosto laboriosa e non si presta a lavori di routine. Tuttavia, essa consente di estrarre in modo efficiente il lisozima dal formaggio e di ottenere estratti abbastanza concentrati e purificati per la determinazione HPLC anche con rivelatori UV e potrebbero permettere di distinguere il lisozima da bianco d uovo da quello del latte bovino. RIASSUNTO Si riportano i risultati di una ricerca che si proponeva di sperimentare tecniche cromatografiche per l estrazione del lisozima dal formaggio e la successiva determinazione mediante HPLC. L additivo è stato estratto dal formaggio con una resina carbossilica a scambio cationico debole utilizzando la tecnica batch ed è stato recuperato con NaCl 1M in tampone fosfato, dopo aver trasferito la resina in una colonna di vetro. Il recupero del lisozima è stato valutato determinando l attività litica di aliquote degli estratti e delle frazioni eluite dalla colonna mediante diffusione in agar contenente cellule di Micrococcus lysodeikticus. Le frazioni eluite dalla resina carbossilica sono state, quindi, analizzate mediante HPLC usando una colonna cromatografia a scambio cationico forte. La metodica oggetto della sperimentazione, benché piuttosto laboriosa, consente di estrarre in modo efficiente il lisozima dal formaggio e di ottenere estratti abbastanza purificati per la determinazione HPLC anche con rivelatori UV. La ricerca vuole essere un contributo alla definizione di metodi per la valutazione del lisozima da bianco d uovo aggiunto nella tecnologia casearia, al fine di controllare la conformità dei formaggi alle leggi che disciplinano l uso e l etichettatura di questo additivo e per verificare l autenticità di prodotti per i quali l uso non è consentito, come il Parmigiano-Reggiano. Parole chiave: formaggio, lisozima da bianco d uovo, scambio ionico, HPLC SUMMARY Determination of the egg white lysozyme in cheese: an approach by ion exchange chromatographic techniques. The aim of this work was to study chomatographic techniques for the determination of egg white lysozyme (EWL) in dairy products in order to contribute to the definition of analytical methods to 264 Panari et Filippi (2009) Sci Tecn Latt-Cas, 60 (3),

5 evaluate the correct use and labelling of this additive (E 1105) and verify the authenticity of the cheeses where its use is not allowed, as Parmigiano-Reggiano cheese. EWL was extracted by a weakly acidic cation exchange resin, containing carboxylic groups, using the batch method, and recovered by eluition with NaCl 1M in phosphate buffer. Then the EWL was determined by HPLC, using a strong cation exchange column. The recovery of EWL was evaluated by lysoplate assay using the cells of Micrococcus lysodeikticus and resulted fairly good. Furthermore the extracts were purified enough to use UV detection in HPLC analysis and could allow to distinguish the bovine lysozyme from EWL. Keywords: cheese, egg white lysozyme, ion exchange chromatography, HPLC Ringraziamenti: Poster presentato al I Congresso Lattiero-Caseario AITeL. Bologna, 12 giugno 2008 Acquisizioni scientifiche e valorizzazione del latte e dei derivati: aspetti genetici, ambientali e tecnologici. BIBLIOGRAFIA 1) Pellegrino L, Tirelli A (200). A sensitive HPLC method to detect hen s egg white lysozyme in milk and dairy products. Int. Dairy J., 10, ) Osserman EF, Lawlor DP (1966). Serum and urinary lysozyme (muramidase) in monocytic and monomyelocytic leucemia. J. Experimental Medicine, 124, Panari et Filippi (2009) Sci Tecn Latt-Cas, 60 (3),

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