Caciocavallo Podolico : profilo proteico in funzione del tempo di maturazione
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- Antonia Romeo
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1 Caciocavallo Podolico : profilo proteico in funzione del tempo di maturazione Matassino D. 1, Inglese F. 1, Rillo L. 1,Romagnuolo F. 1, Di Luccia A. 2 1 Consorzio per la Sperimentazione, Divulgazione e Applicazione di Biotecniche Innovative (ConSDABI) - NFP.I. FAO - Centro di Scienza Omica per la Qualità e per l Eccellenza nutrizionali- Piano Cappelle, Benevento - consdabi@consdabi.org 2 Dipartimento di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell Ambiente (DiSAAA),Università di Foggia, Foggia. RIASSUNTO - Il processo di maturazione di un formaggio è un fenomeno complesso caratterizzato da un insieme di eventi chimico-fisici, biochimici e biologici tra loro strettamente connessi. Gli enzimi endogeni del latte, gli enzimi dello starter, gli enzimi del caglio nonché quelli della microflora filocasearia e inquinante sono gli agenti principali dei suddetti eventi. Uno dei più complessi eventi biochimici è la idrolisi delle caseine che porta alla formazione di peptidi ad alto peso molecolare insolubili in acqua i quali, nel corso della maturazione, sono ulteriormente frammentati a piccoli peptidi e ad amminoacidi liberi. In questa nota si riportano alcuni risultati ottenuti analizzando 18 Caciocavalli di Bovino Grigio Autoctono Italiano (BovGrAI-già Podolica) derivanti da latte di massa, per ogni tempo di maturazione (1-- mesi). I Caciocavalli sono stati stagionati nelle stesse condizioni microambientali. L analisi, nei limiti del campo di osservazione ha mostrato una variazione del numero di spots sui gel e una variazione del volume % in relazione al tempo di maturazione. Parole chiave: Caciocavallo, spettrometria di massa, proteolisi, β-caseina. INTRODUZIONE Durante la maturazione del formaggio le modificazioni fisico-chimiche e biochimiche si evolvono in rapporto alle caratteristiche del substrato, a quelle della grande varietà dei prodotti primari e secondari che via via si formano nonché alla natura degli agenti responsabili delle trasformazioni. Gli agenti principali di tali trasformazioni sono enzimi naturali del latte, batteri e relativi enzimi dello starter, enzimi del caglio nonché enzimi della microflora inquinante. Le caseine (α S1 -CN, α S2 -CN, β-cn e κ-cn) rappresentano la parte più complessa ed eterogenea delle sostanze azotate totali presenti nel latte e la loro idrolisi inizia con la formazione di peptidi ad alto peso molecolare, insolubili in acqua, a opera degli enzimi endogeni del latte (principalmente plasmina e catepsina D), del caglio (chimosina e pepsina) e della flora microbica; tali peptidi, nel corso della maturazione, sono ulteriormente frammentati a oligo e piccoli peptidi e ad amminoacidi liberi principalmente a opera delle endo e delle esopetidasi della microflora presente nel formaggio. La diversità e il numero di peptidi dipendono dalla eterogeneità caseinica (varianti genetiche, grado di fosforilazione e di glicosilazione), dall efficacia dell attività enzimatica e dalla microflora tipica e/o selezionata che si sviluppa nel latte; inoltre, il progressivo rilascio di tali peptidi conferisce a ogni formaggio locale aromi gustativi e olfattivi tipici nonché proprietá nutrizionali ed extranutrizionali con conseguente effetto nutraceutico (attivatore del sistema immunitario, favorente l assorbimento del calcio, ipotensivo, antimicrobico, analgesico). I tempi e i modi con cui avviene la proteolisi sono rivelabili dal profilo e dalla quantità dei frammenti I prodotti come nel caso del Grana Padano dove i frammenti γ-cn, α s1 e α II s1 -CN, derivanti dall idrolisi della β-cn e della α s1 -CN, sono considerati marker di qualitá e di stagionatura (Gaiaschi et al., 2000 e 2001). Il Caciocavallo Podolico è un formaggio semiduro a pasta filata tipico dell Italia Meridionale, stagionato, normalmente, per 12 mesi e ottenuto a partire da latte intero crudo, caglio (di vitello per ottenere formaggi di gusto delicato, di capretto o di agnello per ottenere formaggi dal gusto piccante) e sale. Ha forma ovoidale con crosta sottile, liscia e lucida che si presenta ricoperta da una muffa bianco-grigiastra quando la maturazione è molto avanzata (oltre i 12 mesi). All interno, il Caciocavallo ha pasta omogenea e compatta di colore bianco crema se relativamente fresco o giallo paglierino con pasta friabile e scagliosa quando è ben stagionato; esso è
2 caratterizzato da un sapore molto aromatico, piacevole, da piccante a molto piccante a seconda del tempo di maturazione. SCOPO Scopo di questo lavoro è stato quello di approfondire il biochimismo dei processi proteolitici che avvengono durante la maturazione del formaggio. MATERIALI E METODI Preparazione del campione, analisi elettroforetica e analisi dell immagine La frazione caseinica, estratta in accordo con Aschafferrburg e Drewry (1957) e Krause et al. (1989), è stata analizzata mediante elettroforesi bidimensionale (2DGE); le analisi sono state condotte in doppio. Le immobiline DryStrips -NL (18cm) sono state idratate (8 M Urea, 0.5 % CHAPS, 0.2 % DTT, 0.5 % IPG Buffer) e sottoposte a prima dimensione (IEF-IPG) in IPGphor (Amersham-Pharmacia Biotech). La elettroforesi in seconda dimensione è stata realizzata secondo la procedura di O Farrell (1975) in gradiente di gel di poliacrilamide (SDS-PAGE) (T=9-18%; C=2.5) utilizzando un Ettan Twelve System (Amersham-Pharmacia Biotech). La corsa elettroforetica è stata eseguita in accordo alle istruzioni della casa costruttrice. Le mappe bidimensionali (2-DGEm) sono state scannerizzate con Image Scanner (Amersham-Pharmacia Biotech) e sottoposte ad analisi dell immagine mediante il software Image Master 2D-Platinum al fine di al fine di evidenziare nelle stesse: il numero degli spot; il volume % di ogni singolo spot (inteso come volume dello spot diviso il volume totale degli spot presenti sulla mappa). Digestione triptica Gli spot, opportunamente selezionati, sono stati digeriti in situ con tripsina in accordo alla procedura di Shevchenko et al. (199). Spettrometria di massa MALDI -TOF I digesti triptici sono stati analizzati con spettrometro di massa Ettan MALDI-TOF/PRO (Amersham-Pharmacia Biotech). RISULTATI Le mappe elettroforetiche bidimensionali confrontate, mediante analisi dell immagine, a differenti tempi di maturazione (1, e mesi) hanno mostrato un marcato dinamismo delle frazioni caseiniche espresso da un differente numero di spots (Tabella 1). Sono stati rivelati frammenti della β- CN identificati come [β-cn f(29-209)] derivanti dalla proteolisi primaria della β-cn a opera della plasmina, costituenti il gruppo A, e frammenti con peso molecolare di ~12 kda, tra i quali γ2-cn [β-cn f(-209)] e γ-cn [β-cn f(8-209)] derivanti dalla proteolisi primaria e secondaria, costituenti i gruppi B e C, rispettivamente (Figura 1-Tabella 2). In particolare, gli spots appartenenti al gruppo A mostrano una diminuzione di volume durante la maturazione in concomitanza con un incremento del volume degli spots appartenenti ai gruppi B e C (Grafico 1); tale aumento è ascrivibile alla proteolisi primaria sulla β-cn e a quella secondaria sulle proteine del gruppo A. E da evidenziare, inoltre, la presenza di peptidi, non ancora identificati, caratterizzati da un pi acido (ph 4 5) e da un basso peso molecolare (MW kda) (Figura 1); tali peptidi, evidenti a inizio maturazione (1 mese), diminuiscono di intensità al procedere della stessa.
3 Tabella 1. Variazione del numero di spots [(minimo, massimo, media ( x ), deviazione standard (σ) e coefficiente di variazione (c.v., %)] a diversi tempi di maturazione.. Campioni N di spots Tempo di N maturazione min max x ± σ (mesi) c.v., % Comuni IPG 9% % 7 B A 4 5 A C ph 4-5; MW14-15 KDa Figura 1. 2-DGE relativa al Caciocavallo Podolico a 1 mese di maturazione. Nei riquadri in nero i gruppi relativi alle frazioni della β-cn. In rosso il gruppo di peptidi a basso peso molecolare e a basso punto isoelettrico.
4 Tabella 2. Identificazione mediante spettrometro di massa MALDI-TOF delle proteine presenti nel Caciocavallo Podolico. In rosso gli spots comuni a tutti i campioni, ulteriormente suddivisi in gruppi (A, B, C). Spot n Proteine identificate Gruppo γ-cn A C γ2-cn β-cn fragment Para Κ-CN αs1-cn αs1-i peptide β-cn fragment αs2-cn B Grafico 1. Variazione del volume percentuale totale degli spots entro il gruppo in funzione del tempo di maturazione. CONCLUSIONI Il profilo osservato è indice di un dinamismo nel corso del processo di maturazione ed evidenzia il fenomeno della proteolisi primaria e secondaria. Queste ultime rappresentano un fattore determinante la qualità e la peculiarità del formaggio stesso in quanto sono influenzate sia dalle caratteristiche del latte destinato alla caseificazione sia da vari parametri del diagramma di flusso; qualsiasi cambiamento verificatosi in uno dei parametri si riflette, infatti, in modificazioni qualiquantitative dei frammenti caseinici che si generano durante la maturazione. Inoltre, la variazione del volume delle proteine comprese nei gruppi potrebbe rappresentare un utile indicatore del tempo di maturazione del Caciocavallo Podolico come evidenziato da altri autori per il Grana Padano (Gaiaschi et al., 2001) e per il formaggio Comté (Dupont et al., 200).
5 Lavoro eseguito con contributo interregionale Maso-GIS e del MiPAAF Si ringraziano gli allevatori e la Cooperativa Agricola Molara - Zungoli (AV) OPERE CITATE ASCHAFFERRBURG, R. and DREWERY, J New procedure for the routine determination of the various non-casein proteins of milk. 15 Int. Dairy Congr.,, DUPONT, D., ROLET-REPECAUD, O. and SENOCQ, D A new approach to monitoring proteolysis phenomena using antibodies specifically directed against the enzyme site on its substrate. Anal. Biochem. 15, 17 (2) : FOX PF Proteolysis during cheese manufacture and ripening. J. Dairy Sci.,72: GAIASCHI, A., BERETTA, B., POIESI, C., CONTI, A., GIUFFRIDA, MG., GALLI, CL. and RESTANI P Proteolysis of α s -casein as a marker of Grana Padano cheese ripening. J. Dairy Sci., 8: GAIASCHI, A., BERETTA, B., POIESI, C., CONTI, A., GIUFFRIDA, M.G., GALLI, C.L. and RESTANI P Proteolysis of β-casein as a marker of Grana Padano cheese ripening. J. Dairy Sci., 84:0 5 MATASSINO, D., GIGANTE, G., INGLESE, F., SERLUCA, G. and DI LUCCIA, A Proteomic approach to the study of proteolysis in Podolian caciocavallo cheese. Ital. J. Animal Sci. (suppl. 1), 45. O FARRELL, P.H High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem., 250, SOUSA, M.J., ARD, Y. and MCSWEENEY P.L.H Advances in the study of proteolysis during cheese ripening. Int. Dairy J., 11:
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