ASPETTI QUALITATIVI E QUANTITATIVI DELLA PROTEOLISI NEL CORSO DELLA STAGIONATURA DEL FORMAGGIO RAGUSANO

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1 SCIENZA E TECNICA LATTIERO-CASEARIA, 54 (2), ASPETTI QUALITATIVI E QUANTITATIVI DELLA PROTEOLISI NEL CORSO DELLA STAGIONATURA DEL FORMAGGIO RAGUSANO V Fallico*, L Chianese 2, S Carpino 1, G Licitra 1 INTRODUZIONE Il Ragusano è un formaggio a pasta filata stagionato, prodotto secondo una tecnologia di tipo tradizionale nella regione Iblea della Sicilia [1]. Le peculiarità del processo di lavorazione e le caratteristiche qualitative della materia prima costituiscono elementi di unicità del formaggio, espressione di una tradizione casearia che nasce agli inizi del XIV secolo [2]. L utilizzo di utensili artigianali in legno e rame unito all impiego di latte vaccino intero crudo, veicolo del patrimonio di sapori ed aromi ereditati dai pascoli Iblei, conferiscono inequivocabili caratteri di tipicità al Ragusano. La protezione della denominazione d origine (DOP) [3], ottenuta nel 1996, ed il riconoscimento di tipicità, acquisito nel 1955 [4], costituiscono attestati importanti del legame tra qualità ed unicità del Ragusano ed il territorio d origine. Tradizionalmente prodotto con latte vaccino di sola razza Modicana, il Ragusano è, oggi, ottenuto da latte di provenienza variabile (Modicana nel 42% dei casi, Bruna svizzera nel 33%, Holstein nel 18% e razze miste nel rimanente 7% dei casi). Uno studio recente ha definito la composizione chimica del latte delle vacche di razza Modicana, Bruna e Holstein, nel periodo di produzione del formaggio Ragusano (Settembre-Luglio), individuando nel latte di Modicana le caratteristiche tecnologiche più idonee alla trasformazione casearia [1]. Appena prodotto, il formaggio è immerso in salamoia satura per un tempo tale da comportare un contenuto in sale, sulla sostanza secca, non superiore al 6%. Le forme sono, quindi, trasferite nei locali di stagionatura dove, appese a cavallo di travi di legno, stagionano sino ad un anno. Il formaggio semistagionato, maturato sino a 6 mesi, è ampiamente commercializzato come prodotto da tavola mentre il Ragusano stagionato 9-12 mesi è spesso utilizzato quale formaggio da grattugia. La genuinità del Ragusano DOP è difesa solo dai controlli analitici, previsti nell apposito disciplinare di produzione, quali la valutazione del contenuto minimo di grasso sulla sostanza secca, variabile dal 38% al 40% secondo il grado di maturazione [5]. L attribuzione della DOP sulla base * Corrispondenza ed estratti: tel , fax , enzofallico@corfilac.it 1 Consorzio di Ricerca Filiera Lattiero-Casearia (CoRFiLaC), Regione Siciliana, S.P. 25 Ragusa mare Km 5, Ragusa. 2 Dipartimento di Scienza degli Alimenti, Facoltà di Agraria, Università degli Studi di Napoli Federico II. Parco Gussone, Portici.

2 della semplice rispondenza a questo parametro costituisce un criterio di valutazione minimo ma, al tempo stesso, semplicistico delle caratteristiche che realmente contraddistinguono il formaggio prodotto secondo le norme disciplinari dal comune caciocavallo. L identificazione di marcatori o descrittori molecolari di tipicità del Ragusano DOP, consentirebbe di affiancare, in fase di controllo qualità del formaggio, ulteriori e più specifici parametri analitici di riferimento a quelli già previsti nel disciplinare di produzione. È noto che le peculiarità della materia prima e del processo produttivo di un formaggio ne determinano le caratteristiche strutturali ed organolettiche, influenzando direttamente i profili evolutivi dei principali meccanismi di maturazione [6]. La maturazione di un formaggio avviene tramite le molteplici attività enzimatiche che, presenti nella cagliata, promuovono la demolizione di zuccheri, grassi e proteine in composti molecolari più semplici [7]. In particolare la proteolisi, attraverso la degradazione del substrato caseinico in composti a basso peso molecolare (oligopeptidi ed amminoacidi liberi), spesso dotati di proprietà aromatiche, concorre alla formazione della texture e del flavour tipico di un formaggio [6]. L obiettivo del presente studio è di contribuire all individuazione dei parametri di tipicità del formaggio Ragusano, attraverso la definizione dei caratteri salienti del fenomeno proteolitico. A tal fine è stata valutata la composizione della frazione azotata del Ragusano durante la maturazione, facendo ricorso a metodi di frazionamento chimico e all elettroforesi su gel di poliacrilammide (disc-page) a ph alcalino. MATERIALI E METODI a) Prove sperimentali e campionatura - La ricerca è stata condotta su sei forme di Ragusano, esenti da difetti e di buona qualità, prodotte nel corso di altrettante prove sperimentali di caseificazione. Le lavorazioni sono state effettuate presso il caseificio sperimentale del Consorzio di Ricerca Filiera Lattiero-casearia (CoRFiLaC) di Ragusa secondo la medesima tecnologia di produzione (Fig. 1), nel periodo compreso tra gennaio e marzo. Il campionamento dei formaggi, eseguito secondo la tecnica del carotaggio, è stato effettuato a 0, 45, 90, 180 e 270 giorni, ricoprendo la zona del prelievo con uno strato di paraffina per evitare la comparsa di anomalie nel corso della maturazione. I campioni di formaggio sono stati, quindi, grattugiati, aliquotati in tubi cilindrici di plastica e conservati alla temperatura di 4 C sino al loro successivo utilizzo. b) Determinazioni analitiche - Sui campioni di formaggio sono state effettuate, in doppio, le seguenti determinazioni analitiche: Azoto totale (NT), secondo il metodo Kjeldahl [8]; Azoto solubile in tampone acetato a ph 4,6 (NS) ed in acido tricloroacetico al 12% (NNP) [9]. I risultati delle analisi, indicativi del tenore in azoto, sono stati moltiplicati per il fattore di conversione 6,38, in modo tale da riportare tutti i valori in percento di contenuto proteico. 2 Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

3 Figura 1 - Diagramma di flusso della tecnologia di produzione del formaggio Ragusano. Figure 1 - Flow chart of the Ragusano cheesemaking technology. Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

4 c) Elettroforesi verticale su gel di poliacrilammide a ph 8,6 (disc-page) - I campioni di formaggio erano sgrassati, liofilizzati, sciolti al 2% (p/v) in urea 9 M ed addizionati di β-mercaptoetanolo all'1% (v/v). Per l analisi elettroforetica erano utilizzati 6 µl del campione, preparato miscelando 100 µl della soluzione proteica in urea e β-mercaptoetanolo con 100 µl di glicerina (87%, p/v) e 10 µl di una soluzione acquosa di Blu di bromofenolo, come tracciante [10]. I campioni di caseina intera dei formaggi in esame sono stati preparati secondo la procedura di Aschaffenburg e Drewry (1959) [11]. La corsa elettroforetica, condotta a voltaggio costante di 220 Volts per circa sei ore, è stata realizzata con un apparecchio per elettroforesi verticale (PROTEAN II, Bio-rad), collegato ad un bagno termostatico Multitemp (Pharmacia LKB, Bromma, Svezia), per il raffreddamento a 10 C. La densità ottica delle bande, colorate secondo la procedura di Blakesly e Boezi (1977) [12], è stata determinata mediante densitometro GS-710 (Bio-Rad) equipaggiato con filtro verde. La concentrazione relativa delle proteine, espressa in percento di densità ottica totale d ogni singolo profilo, è stata calcolata integrando automaticamente le aree dei picchi sul densitogramma. d) Analisi statistica - Le percentuali residue delle caseine β ed α s1 sono state calcolate comparando, per ciascuno dei 6 formaggi, i valori relativi ai cinque stadi di maturazione analizzati (0, 45, 90, 180 e 270 giorni) con i valori medi delle frazioni native a 0 giorni. Questi valori sono stati, quindi, comparati mediante il modello statistico ANOVA (two-way) utilizzando il tipo di caseina (α o β: C) e lo stadio di maturazione (M) quali fixed main effects. X ij = C i + M j + (C i X M j ) + ε ij Tests of simple effects [13] sono stati usati all interno dell interazione C X M per misurare gli effetti del tipo di caseina in ciascuno dei cinque stadi di maturazione. Tutte le analisi sono state condotte utilizzando la procedura GLM con il software SAS v.8.2 (The SAS Institute, Cary, NC). RISULTATI E DISCUSSIONE 1) Evoluzione delle frazioni azotate nel Ragusano durante la stagionatura - In tabella 1 sono riportati i dati relativi alla ripartizione delle forme azotate nel Ragusano a diversi stadi di maturazione. I risultati delle analisi chimiche rivelano un intensa idrolisi della matrice caseinica fin dai primi mesi di stagionatura. La percentuale d azoto solubile a ph 4,6 (NS/NT) aumenta fino al sesto mese di maturazione, ove assume valori medi (28,03 ± 3,40%) comparabili a quelli di un Parmigiano-Reggiano più stagionato (26-27% a nove mesi) [14]. Il livello di NS rimane pressoché costante nel seguito della maturazione (Fig. 2). La frazione più consistente di NS è costituita da azoto non proteico (NNP), che ne compone il 72,94% (± 10,70 NNP/NS) già dopo 45 giorni. La produzione di peptidi a basso peso molecolare ed amminoacidi liberi prosegue nel corso della stagionatura, fino a 4 Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

5 Tabella 1 - Ripartizione delle frazioni azotate nel corso della stagionatura del Ragusano. Table 1 - Distribution of nitrogen fractions during Ragusano cheese aging. costituire l 86,67% (± 8,55) dell NS dopo nove mesi di maturazione. 2) Aspetti qualitativi della proteolisi (analisi mediante disc-page alcalina) - I profili elettroforetici di figura 3 mostrano le modifiche alla composizione qualitativa della frazione insolubile a ph 4,6 del Ragusano, generate dalla proteolisi nel corso della stagionatura. La caseina α s1 (α s1 -CN) è piuttosto idrolizzata sin dalle prime fasi di maturazione, come testimonia l intensità di banda del prodotto di neoformazione a mobilità elettroforetica superiore all α s1 -CN, che compare nel profilo a 45 giorni. È nota la specificità d azione della chimosina che, dopo la κ-caseina, idrolizza l α s1 -CN producendo il peptide ad elevata mobilità α s1 -I (α s1 (24-199)), insolubile a ph 4,6, ed il corrispettivo frammento solubile α s1 (1-23) [15]. Il livello del peptide α s1 -I aumenta sino a 90 giorni, superati i quali diminuisce debolmente nel seguito della stagionatura. Tale andamento è collegato alla comparsa di un nuovo prodotto che mostra mobilità anodica superiore al peptide as1-i e dovrebbe corrispondere al frammento α s1 -II (α s1 (24-169)), generato dall azione della chimosina sul peptide α s1 -I [15, 16]. Dalla progressiva idrolisi dell α s1 -CN potrebbe originare il frammento peptidico a mobilità intermedia tra le caseine α s1 e β. La banda potrebbe corrispondere al peptide α s1 -PL1 (α s1 f80-199), ritrovato ed identificato da Addeo et al. (1995) [17] nel Parmigiano-Reggiano, come principale prodotto di degra- Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

6 Figura 2 - Variazioni medie nella distribuzione delle forme azotate solubili (NS ed NNP) all'interno della frazione azotata totale (NT) del Ragusano al procedere della stagionatura. Figure 2 - Mean variations in soluble compounds distribution (SN ed NPN) of the total nitrogen fraction (TN) of Ragusano cheese during aging. dazione plasminica dell α s1 -CN. L idrolisi della b-caseina (β-cn) appare poco intensa nei primi mesi di stagionatura, a giudicare dalla sua intensità di banda e dai bassi livelli delle caseine γ 1 (β (29-209)), γ 2 (β ( )) e γ 3 (β ( )) [18, 19], identificate sulla piastra elettroforetica secondo le indicazioni riportate da Addeo et al. (1995) [17]. In realtà, sin dal profilo a 45 giorni, una banda migra nella stessa regione della β-cn, risultandone quasi indistinta a causa di una mobilità elettroforetica solo leggermente più elevata rispetto la caseina nativa. È stato dimostrato che la chimosina è in grado di idrolizzare la b- caseina bovina isolata producendo i peptidi β-i-cn (β (1-189/192)), β-ii-cn (β (1-163/165/167)) e β-iii-cn (β (1-127/139)), aventi mobilità elettroforetica più elevata rispetto la frazione nativa [20]. Bande analoghe sono state individuate nel formaggio Gouda, prodotto con differenti quantità di chimosina, e la loro intensità aumentava all aumentare della concentrazione del coagulante [21]. Il frammento migrante assieme la β-cn è, pertanto, 6 Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

7 Figura 3 - Elettroforesi su gel di poliacrilammide (disc-page) a ph 8,6 di campioni di Ragusano a diverso stadio di maturazione: profilo 1. Ragusano a 0 giorni; profilo 2. Ragusano a 45 giorni; profilo 3. Ragusano a 90 giorni; profilo 4. Ragusano a 180 giorni; profilo 5. Ragusano a 270 giorni. Figure 3 - Polyacrilamide gel electrophoresis (disc-page) at ph 8.6 of Ragusano cheese samples at different ages: lane 1. Ragusano 0 day; lane 2. Ragusano 45 days; lane 3. Ragusano 90 days; lane 4. Ragusano 180 days; lane 5. Ragusano 270 days. identificabile nel peptide β-i-cn e raggiunge il massimo livello apparente a 90 giorni, per poi diminuire nettamente nel seguito della stagionatura. Si potrebbe ipotizzare che, a partire dal terzo mese, il peptide β-i-cn diventi substrato d idrolisi della chimosina al pari della b-cn. Tuttavia, non sembrano comparire nei profili corrispondenti eventuali prodotti della sua degradazione, quali i peptidi β-ii-cn o β-iii-cn. La produzione delle γ- caseine, viceversa, aumenta nettamente dal terzo mese di maturazione e, a fine campionatura, l incremento maggiore è a carico del prodotto finale d idrolisi plasminica della β-cn, ovvero il peptide γ 3. Il frammento γ 1 raggiunge livelli apprezzabili dopo 90 giorni, superati i quali la sua concentrazione aumenta progressivamente, sino ai livelli della frazione γ 2 a fine maturazione. A questo stadio la β-cn è quasi completamente idrolizzata e le γ-caseine costituiscono i suoi maggiori prodotti di degradazione. Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

8 3) Aspetti quantitativi della proteolisi (analisi densitometrica dei profili PAGE) - In tabella 2 è riportata la composizione media della frazione caseinica del formaggio Ragusano nel corso della stagionatura, ottenuta mediante scansione densitometrica dei profili PAGE. Le caseine native costituiscono nella cagliata l 88% della frazione proteica totale e si riducono, per azione delle endoproteasi ed esopeptidasi presenti nel formaggio, al 16% del totale dopo nove mesi di stagionatura (Fig. 4). In figura 5 sono riportate le cinetiche di degradazione delle caseine β ed α s1, costruite sulla base dei dati densitometrici. L idrolisi di ambedue le caseine α s1 (R 2 = 0,9879) e β (R 2 = 0,9918), descritta da una cinetica di terzo ordine, è piuttosto intensa sin dalle prime fasi di stagionatura anche se contraddistinta da una diversa velocità di degradazione delle frazioni native. La β-cn è idrolizzata ad una velocità costantemente più elevata rispetto quella dell α s1 -CN cosicché la percentuale di frazione nativa, residua al nono mese di stagionatura, approssima un valore medio del 4% contro il rispettivo 29% dell α s1 -CN. L intensità della proteolisi a carico delle caseine b ed as1 è, tuttavia, maggiore nei primi tre mesi di maturazione, superati i quali l idrolisi dell α s1 -CN subisce un forte rallentamento mentre la β-cn continua ad essere costantemente idrolizzata sino alla quasi completa scomparsa. Il livello dei peptidi originati dalla β-cn cresce rapidamente tra 0 e 3 mesi (+29%), con una velocità di produzione nettamente superiore a quella dei peptidi derivanti dalla frazione α s1 (+15%) (Fig. 6). Dopo il terzo mese, l accumulo dei prodotti α s1 rallenta notevolmente originando, al nono mese di stagionatura, un incremento pari al 25% del valore iniziale, mentre la formazione dei β-peptidi rimane intensa (+48%). In figura 7 sono posti a confronto gli indici che descrivono l entità complessiva della proteolisi a carico delle frazioni β (prodotti β/β-cn) ed α s1 (prodotti α s1 /α s1 - CN). Fino a 90 giorni l azione delle proteasi è indifferentemente orientata su entrambe le caseine ma, a partire dal terzo mese, la β-cn diventa nettamente il substrato primario su cui si concentra l attività del sistema proteolitico attivo nel formaggio. La comparazione statistica (ANOVA) tra le percentuali residue delle caseine β ed α s1 ha confermato le differenze (P = 0,0001) nella proteolisi a carico delle due frazioni nel corso della stagionatura. L applicazione dei tests of simple effects ha consentito di valutare la correlazione caseine/età del formaggio, individuando negli stadi a 180 (P = 0,0001) e 270 giorni (P = 0,0002) le fasi della stagionatura in cui tali differenze emergono significativamente. a) Proteolisi della β-caseina - Da questi primi risultati emerge, quindi, che una stima approssimativa della proteolisi nel Ragusano può essere effettuata valutando il livello di degradazione della β-cn. In figura 8 sono riportati gli andamenti degli indici β-i-cn/β-cn e γ-cn-tot/β-cn, rispettivamente legati all azione della chimosina e della plasmina sulla β-cn. La produzione del peptide β-i-cn è poco consistente nel corso della maturazione, in considerazione del fatto che il valore dell indice è ancora pari a 8 Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

9 Tabella 2 - Percentuali relative (medie ± ds) dei principali componenti della frazione azotata insolubile a ph 4,6, e dei loro rapporti, nel Ragusano a diversi stadi di maturazione. Table 2 - Relative percentages (mean ± ds) of the ph 4.6-insoluble nitrogen fraction s main components, and their ratios, in Ragusano cheese at various stages of aging. Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

10 Figura 4 - Evoluzione nella composizione delle frazioni caseinica e peptidica del Ragusano dopo 9 mesi di stagionatura. Figure 4 - Evolution in the composition of the casein and peptidic fractions of Ragusano cheese after 9 months of aging. Figura 5 - Cinetiche di degradazione delle frazioni α s1 -CN ( ) e β-cn ( ) nel corso della stagionatura del Ragusano. Figure 5 - Cinetics of α s1 - ( ) and β-casein ( ) degradation during Ragusano cheese aging. 10 Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

11 Figura 6 - Cinetiche d'accumulo dei prodotti di degradazione delle caseine β ( ) ed α s1 ( ) nel corso della stagionatura del Ragusano. Figure 6 - Cinetics of β- ( ) and α s1 -casein ( ) degradation products formation during Ragusano cheese aging. Figura 7 - Confronto tra gli indici di proteolisi (prodotti/caseina nativa) delle frazioni β ed α s1 nel corso della stagionatura del Ragusano. Figure 7 - Comparison between β and α s1 fractions proteolysis indexes (products/native casein) during Ragusano cheese aging. Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

12 Figura 8 - Andamento dei rapporti γ-cn-tot/β-cn ( ) e β-i-cn/β-cn ( ), espresso in percentuali medie relative, nel corso della stagionatura del Ragusano. Figure 8 - Progress of γ-cn-totals/β-cn ( ) and β-i-cn/β-cn ( ) ratios during Ragusano cheese aging. 1,33 dopo 90 giorni e non va oltre 4,31 dopo 270 giorni. Le γ-caseine (γ-cn) costituiscono, invece, i principali prodotti d idrolisi della β-cn e rappresentano la frazione quantitativamente più importante dosata su piastra. Se ad inizio stagionatura, le γ-cn compongono solo una piccola quota della frazione proteica e peptidica complessiva (7,81%), dopo nove mesi di maturazione arrivano a costituirne il 51,25% (Tab. 2). Ne consegue che il dosaggio delle g-caseine può fornire, attraverso il rapporto γ-cn-tot/β-cn (Fig. 8), una misura dell idrolisi a carico della caseina b e, più in generale, costituire un parametro descrittore del grado di maturazione proteolitica del formaggio [22]. L indice di proteolisi γ-cn-tot/β-cn assume, nel Ragusano di età compresa tra 0 e 9 mesi, valori percentuali medi intorno a 11,8 (min. 0,2; max. 49,9), di gran lunga superiori a quelli riportati per il Parmigiano- Reggiano, stagionato nove mesi, dove il valore medio è intorno a 1,6 (min. 1,3; max. 2,7) [6]. Il ruolo della plasmina nella maturazione del Ragusano appare particolarmente importante e quest ipotesi sembra confermata anche dagli andamenti riguardanti la produzione delle singole γ-cn nel corso della maturazione (Fig. 9). Sin dalle prime fasi di maturazione, il contenuto in γ 2 -CN e γ 3 -CN è più elevato rispetto la frazione γ 1 e ciò denota un azione della plasmina particolarmente intensa, in grado di spingere l idrolisi della β-cn verso la produzione delle γ-cn terminali. Quest andamento diventa ancora più pronunciato nel corso della matura- 12 Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

13 Figura 9 - Andamento delle γ-caseine, espresso in percentuali relative medie, nel corso della stagionatura del Ragusano. Figure 9 - Progress of γ-caseins during Ragusano cheese aging. zione, contrassegnato dal progressivo accumulo di γ 2 -CN e γ 3 -CN e da livelli praticamente costanti della γ1-cn. Lo scarso incremento percentuale di questo peptide è dovuto alla sua frammentazione in γ 2 e γ 3 che ne controbilancia il contemporaneo accumulo derivante dall idrolisi della β-cn. L elevato best-fit (R 2 = 0,9996) della cinetica dell indice γ-cn-tot/β-cn suggerisce la possibilità di stabilire una correlazione tra il dosaggio di queste frazioni ed il grado di stagionatura del Ragusano. Tuttavia, la stima del contenuto totale in γ-cn può risultare, talvolta, complicata ed inficiata da errori, a causa della difficoltà di misurare quelle frazioni, quali γ 1 -CN e γ 2 - CN, che, sottoposte ad idrolisi durante la maturazione, possono essere poco abbondanti e difficilmente visibili sul gel. Allo scopo di ovviare a questo potenziale fattore d errore, sono stati posti a confronto i rapporti tra le singole g-caseine e la frazione nativa (Fig. 10). La cinetica del rapporto γ 3 - CN/β-CN mostra il best-fit più alto (R 2 = 0,9997), del tutto assimilabile a quello riportato dall indice γ-cn-tot/β-cn. Tra i prodotti di neoformazione, la γ 3 -CN costituisce l unica frazione in continuo incremento nel corso della stagionatura. In quanto prodotto finale di degradazione plasminica della β-cn, la γ 3 -CN non è soggetta ad ulteriore idrolisi durante la maturazione ed è, pertanto, destinata ad accumularsi in quantità elevate nel formaggio, come rilevato nel Parmigiano-Reggiano stagionato 24 mesi [6]. In teoria, quindi, sarebbe sufficiente dosare solo la γ 3 -CN, assieme la frazione β Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

14 Figura 10 - Andamento dei singoli rapporti γ-cn/β-cn nel corso della stagionatura del Ragusano. Figure 10 - Progress of individual γ-cn/β-cn ratios during Ragusano cheese aging. residua, per ricavare un indice attraverso cui stimare l età approssimativa del Ragusano. Il dosaggio della γ 3 -CN è estremamente più semplice e vantaggioso perché il frammento si accumula in notevoli quantità sin dai primi mesi di maturazione e può essere misurato anche nelle fasi più avanzate della stagionatura. b) Proteolisi dell α s1 -caseina - La figura 11 mette a confronto l andamento degli indici che, misurando la percentuale di accumulo dei peptidi prodotti dalla chimosina (α s1 -I e α s1 -II) e dalla plasmina (α s1 -PL1), delineano l azione delle due proteasi sulla frazione α s1. Una cinetica di secondo ordine descrive l incremento dei peptidi α s1 -I ed α s1 -II, lineare fino a 180 giorni e con una velocità d accumulo nettamente superiore rispetto quella del frammento α s1 -PL1. Ciò denota una netta preferenza d azione della chimosina nei confronti dell α s1 -CN, mentre la plasmina esercita un azione più blanda visibile solo più in là nel corso della maturazione. CONCLUSIONI L andamento dei parametri chimici individua nella maturazione del formaggio Ragusano due periodi caratteristici, nettamente scindibili per diversa intensità ed orientamento del fenomeno proteolitico. Tra 0 e 6 mesi, il costante incremento dell NS rivela l intensa proteolisi cui è sottoposta la matrice caseinica, idrolizzata in peptidi di piccolo e medio peso 14 Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

15 Figura 11 - Andamento dei rapporti α s1 -I-CN + α s1 -II-CN/α s1 -CN ( ) e α s1 -PL1/α s1 - CN ( ), espresso in percentuali medie relative, nel corso della stagionatura del Ragusano. Figure 11 - Progress of α s1 -I-CN + α s1 -II-CN/α s1 -CN ( ) and α s1 -PL1/α s1 -CN ( ) ratios during Ragusano cheese aging. molecolare [23]. Dal sesto mese in poi, è raggiunta una condizione d equilibrio tra i meccanismi di degradazione delle frazioni caseiniche e formazione dei peptidi solubili. Lo stesso fenomeno è stato osservato da Bertozzi e Panari (1993) [24] nel Parmigiano-Reggiano, dove la degradazione delle frazioni proteiche procede rapidamente fino a 8-10 mesi di maturazione, per poi rallentare nel seguito della stagionatura. Nel Ragusano, dopo il sesto mese di maturazione l evoluzione dinamica del processo riguarda la composizione dell azoto solubile, dove i peptidi di media taglia sono idrolizzati in oligopeptidi ed amminoacidi liberi per l azione di peptidasi batteriche che originano dalla lisi cellulare [7]. Livelli comparabili di lattococchi mesofili e lattobacilli termofili (~10 7 UFC/g formaggio) caratterizzano i primi stadi della manifattura del Ragusano. Le temperature raggiunte dalla cagliata durante la filatura, favoriscono la selezione dei gruppi termofili che sopravvengono sui mesofili nel seguito della maturazione (dati non pubblicati). Negli ultimi anni, sono stati caratterizzati gli enzimi proteolitici di cui sono dotati i lattococchi mesofili ed i lattobacilli termofili, ed il loro corredo di proteasi e peptidasi indicherebbe un possibile coinvolgimento in tutte le fasi d idrolisi della matrice caseinica. Tuttavia, è stato dimostrato che il sistema proteolitico dei batteri lattici agisce principalmente a livello di proteolisi secondaria, attraverso la degradazione dei peptidi della frazione solubile in oligopeptidi ed amminoacidi liberi Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

16 (NNP) [25, 26]. Gli elevati livelli di NNP riscontrati nel Ragusano, già a 45 giorni, suggeriscono un notevole contributo della microflora casearia alla proteolisi del formaggio sin dai primi stadi di maturazione. Questi risultati trovano conferma in studi preliminari di microscopia elettronica a scansione condotti sul Ragusano (dati non pubblicati). Le prime osservazioni hanno rilevato un evidente quanto precoce lisi cellulare, già dopo la fase di filatura, che costituisce la premessa per la liberazione di endoproteasi e peptidasi in grado di contribuire alla maturazione proteolitica del formaggio. Il ruolo della microflora endogena del latte, specie in assenza di colture starter, è stato, più volte, rimarcato nella proteolisi di formaggi quali il Manchego [27], il Cheddar [28] ed i tipo-svizzeri [29]. Data l assenza di colture starter, il contributo maggiore alla definizione del profilo peptidico del Ragusano è fornito, dunque, dalla microflora autoctona proveniente dalla materia prima e dall ambiente di lavorazione. Ciò attesta, indirettamente, l importanza della tecnologia di produzione nella definizione dei caratteri tipici del formaggio Ragusano. La costante produzione di oligopeptidi ed amminoacidi liberi nel corso della stagionatura si presta anche a valutazioni di carattere prettamente nutrizionale. Il formaggio presenta al sesto mese di maturazione una percentuale di NS pari al 28,03% (± 3,40) delle proteine totali. Questa frazione è, a sua volta, costituita da un elevata quota (83,51 ± 6,85%) di oligopeptidi ed amminoacidi liberi, forme azotate facilmente assimilabili dall organismo umano. La tabella 3 mette a confronto la composizione della frazione azotata del Ragusano con quella di alcune delle più comuni paste filate prodotte in Italia [30, 31]. Le percentuali di NS ed NNP del Ragusano sono tra le più elevate, ai vari livelli di maturazione. Il confronto, seppur empirico, dei dati riportati in letteratura rivela un livello di solubilizzazione, e quindi di assimilabilità, del contenuto proteico predigerito nel Ragusano che trova pochi riscontri in altre paste filate. Senza entrare nell ambito di una caratterizzazione del valore alimentare del Ragusano, è innegabile che questi dati forniscono un primo attestato delle potenziali proprietà nutrizionali del formaggio. L analisi densitometrica dei profili PAGE, relativi al formaggio stagionato fino a 9 mesi, rivela nette differenze (P = 0,0001) nella proteolisi a carico delle caseine β ed α s1. Analogamente a quanto avviene nei formaggi cosiddetti b-maturativi, quali Parmigiano-Reggiano [6, 24, 32] e Grana Padano [33], la β-cn rappresenta la frazione più idrolizzata nel corso della maturazione del Ragusano. Al nono mese di stagionatura, la percentuale residua di β-cn è pari in media al 4%, contro il residuo 29% dell α s1 -CN. Ne consegue un elevato accumulo dei principali prodotti β-derivati, le γ-caseine, che costituiscono anche la frazione peptidica più consistente a fine campionatura. La produzione delle singole γ-cn mostra, sin dalle prime fasi di maturazione, un andamento tipico contrassegnato dal progressivo accumulo di γ 2 -CN e γ 3 -CN e da livelli costanti della γ 1 -CN. Risultati simi- 16 Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

17 Tabella 3 - Confronto tra la composizione della frazione azotata del Ragusano e quella di altre paste filate in diverse fasi della stagionatura (3, 6 e 9 mesi). Table 3 - Comparison amongst the composition of nitrogen fraction in Ragusano and other pasta filata cheeses at different stages of aging (3, 6 and 9 months). Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

18 li sono stati riportati per il Parmigiano-Reggiano [34]. I patterns elettroforetici mostravano una rapida degradazione della β-cn durante i primi mesi di maturazione mentre l α s1 -CN era sottoposta ad una limitata idrolisi. Il continuo incremento delle caseine γ 2 e γ 3 e la contemporanea diminuzione di γ 1 -CN testimoniava, secondo gli autori, l importanza della plasmina nella maturazione del Parmigiano-Reggiano. Considerazioni analoghe possono essere fatte per il Ragusano, anche alla luce dei valori medi mostrati dall indice γ-cn-tot/β-cn, di gran lunga superiori a quelli riportati per il Parmigiano-Reggiano alla stessa epoca di stagionatura. Il confronto con il Parmigiano-Reggiano, oltre a mettere in risalto il ruolo della plasmina nella maturazione proteolitica del Ragusano, sottolinea anche l influenza della tecnologia di produzione. L intensa attività plasminica riscontrata nel Ragusano è, infatti, una probabile conseguenza dei tre trattamenti termici (~80 C) sequenziali che, innalzando la temperatura della cagliata fino a 49 C, determinano un progressivo aumento della sua concentrazione e conseguente attività. Dupont e Grappin (1998) [35] riportano un continuo incremento dell attività plasminica durante la fase di cottura nella produzione simulata del Comté. Anche nei formaggi maturi tipo-svizzeri l incremento della temperatura di cottura da 49,5 a 55,5 C diminuiva l azione della chimosina ma incrementava sia la concentrazione che l attività della plasmina, con concomitante idrolisi della β-cn in γ- caseine [36]. La presenza tra i prodotti d idrolisi del Ragusano del frammento α s1 -PL1, generato dall azione della plasmina sull α s1, costituisce un ulteriore conferma del ruolo ricoperto dall enzima nella maturazione proteolitica del formaggio. L α s1 -CN costituisce, dal canto suo, il principale target proteolitico della chimosina durante le prime fasi della stagionatura, fenomeno già osservato in altre varietà di formaggi [33]. Il peptide primario α s1 -I si accumula rapidamente nel Ragusano fino al terzo mese di stagionatura quando diventa, a sua volta, substrato d idrolisi da cui origina il frammento α s1 -II. Quest andamento evidenzia il ruolo svolto dalla chimosina nelle prime fasi della maturazione quando, attraverso la formazione dei peptidi primari, si avviano quelle modificazioni della matrice caseinica che determineranno poi le caratteristiche strutturali ed organolettiche del formaggio. La chimosina gioca un ruolo importante in entrambi i processi, poiché i peptidi primari α s1 -I e α s1 -CN (f1-23) contribuiscono direttamente alla definizione dei caratteri strutturali, attraverso l iniziale ammorbidimento della pasta, ed indirettamente alla produzione di aromi, fungendo da substrati per l azione delle proteasi e peptidasi batteriche [37]. Numerosi autori ritengono che la chimosina sia largamente inattivata dalle alte temperature (50-55 C) utilizzate per la manifattura del Parmigiano-Reggiano e dei formaggi svizzeri [38, 39]. Nel Gouda, con valori di ph simili ma temperature di cottura più basse, l enzima mantiene, viceversa, una considerevole attività [34]. I trattamenti termici previsti dalla tecnologia di produzione del 18 Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

19 Ragusano, che portano la temperatura della cagliata a 49 C durante la filatura, uniti ai lunghi tempi di sosta in cottura, suggeriscono una parziale inattivazione degli enzimi residui del caglio, prospettando l intervento di proteasi di diversa natura. Tuttavia, nella Mozzarella, un formaggio a pasta filata dalla tecnologia simile a quella del Ragusano, una discreta attività chimosinica sembra residuare dopo la fase di filatura [40]. La produzione e l accumulo del peptide β-i-cn nel Ragusano, d altronde, fornisce un ulteriore indizio circa la presenza di una consistente attività dell enzima nel formaggio. Non è azzardato il confronto tra il Ragusano, per la cui produzione è utilizzato caglio di agnello o capretto, e la letteratura scientifica soprammenzionata che invece delinea il ruolo della chimosina bovina nella proteolisi dei formaggi. Infatti, gli studi condotti sul coagulante proveniente da specie animali differenti hanno sinora dimostrato che gli enzimi proteolitici in essi presenti manifestano specificità d azione uguali o molto simili. Ad esempio, è stata comparata l attività delle chimosine e pepsine provenienti da 4 specie diverse (bovina, ovina, caprina e porcina) sulle rispettive β-caseine, senza che gli autori trovassero sostanziali differenze nei prodotti di proteolisi primaria formati e quindi nelle specificità d azione delle due proteasi [41]. Fox e McSweeney (1996) [42] attribuivano la produzione del peptide as1-i (α s1 (24-199)), derivante dall α s1 -CN, a bassi livelli di chimosina residua oppure all azione della catepsina D. Nell Emmental, la presenza del peptide α s1 -I, tipica dei patterns proteolitici del Ragusano, era attribuita all attività della catepsina D, una proteinasi acida del latte con specificità d azione su α s1 -CN e β-cn simile a quella della chimosina [43]. Come la chimosina, la catepsina D taglia il legame peptidico Phe 23 -Phe 24 dell α s1 -CN per produrre il peptide α s1 -I, spesso ritrovato nei formaggi rennet-free [44, 45]. Studi sulle cinetiche d inattivazione termica della catepsina D bovina hanno mostrato che l enzima mantiene il 45% della sua attività quando sottoposto alle temperature di cottura (50-55 C per min) tipiche dei formaggi Svizzeri [46]. Questi risultati supportano l ipotesi che, nelle varietà di formaggio ad elevata cottura, la catepsina D possa contribuire alla proteolisi nel corso della stagionatura [39, 47]. Sulla base di queste risultanze, il pattern di degradazione dell α s1 -CN nel Ragusano potrebbe essere spiegato da un attività chimosinica residua alla fase di manifattura, probabilmente rafforzata dall azione della catepsina D. L uso degli indici di proteolisi caseinici ha sinora delineato, in perfetto accordo con le diverse specificità d azione dei due enzimi, una netta preferenza d azione della plasmina nei confronti della β-cn mentre l α s1 -CN costituisce il substrato preferenziale d attacco della chimosina [15, 48, 49]. Studi futuri, orientati al dosaggio delle principali proteasi d interesse caseario, potranno chiarire l effettiva influenza del processo produttivo sull attività di questi enzimi nel Ragusano. Ulteriori studi dovranno essere compiuti per meglio definire i tratti salienti del fenomeno proteolitico, Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

20 confermando l identificazione dei peptidi di neoformazione e delle attività enzimatiche che li hanno generati. Tuttavia, i risultati di questo lavoro definiscono un profilo peptidico tipico del Ragusano, ponendo già l accento sui principali caratteri che ne definiscono la diversità e tipicità. L utilizzo di latte crudo, cagli naturali ed attrezzature tradizionali, indispensabili per la naturale concentrazione di microrganismi filocaseari autoctoni, costituiscono requisiti tecnologici fondamentali per garantire il corredo di enzimi necessario a sviluppare le qualità strutturali ed aromatiche del Ragusano. Infine, l elevato best-fit (R 2 = 0,9997) dell indice di proteolisi γ 3 - CN/β-CN suggerisce la possibilità di poter valutare, attraverso il dosaggio della frazione nativa e del peptide γ 3 -CN, l età approssimativa del Ragusano fino a nove mesi di stagionatura. Tale prospettiva potrebbe rivelarsi particolarmente utile nel controllo qualità del Ragusano DOP, quale strumento analitico garante dell effettiva età del formaggio commercializzato, a prezzi differenti, come semi-stagionato o stagionato. RIASSUNTO - L evoluzione della proteolisi nel corso della stagionatura del Ragusano D.O.P. è stata analizzata facendo ricorso a metodi di frazionamento chimico e all elettroforesi su gel di poliacrilammide (disc-page) a ph alcalino. L idrolisi della matrice caseinica in azoto solubile (NS), che consiste in peptidi di piccolo e medio peso molecolare, aumentava rapidamente da 45 giorni (9,48% NS/NT) a 6 mesi (28,03% NS/NT) di maturazione, per poi assestarsi su valori pressoché costanti (28%). La quota più consistente di SN era costituita da azoto non proteico (NNP), derivante dall idrolisi dei peptidi di media taglia in oligopeptidi ed amminoacidi liberi, che cresceva dal 72,94% (NNP/NS) a 45 giorni all 86,67% dopo 9 mesi. L analisi densitometrica dei profili PAGE delineava una comune cinetica (terzo ordine) di degradazione delle caseine β (R 2 = 0,9918) ed α s1 (R 2 = 0,9879). La comparazione statistica (ANOVA) tra le percentuali residue delle caseine β ed α s1 mostrava, tuttavia, che la proteolisi a carico delle due frazioni era significativamente differente (P = 0,0001) nel corso della maturazione, risultando più accentuata nel caso della β-cn. I tests of simple effects hanno individuato negli stadi a 180 (P = 0,0001) e 270 giorni (P = 0,0002) le fasi della stagionatura in cui tali differenze emergevano significativamente. La quota più consistente della proteolisi a carico delle caseine β ed α s1 avveniva, tuttavia, nei primi tre mesi di maturazione, al termine dei quali erano dosati su piastra rispettivamente il 44% ed il 56% di frazioni residue. Nei mesi successivi, la β-cn era costantemente demolita sino alla quasi completa scomparsa (4% di frazione residua dopo 9 mesi) mentre l idrolisi della frazione α s1 subiva un forte rallentamento (29%). L elevato accumulo delle g-caseine (51,25%) e dei peptidi α s1 -I (11,33%) ed α s1 -II (6,78%), generati dall azione della plasmina e della chimosina rispettivamente sulle caseine β ed α s1, dimostrava il ruolo ricoperto da entrambi gli enzimi nella proteolisi del Ragusano. Questi risultati 20 Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

21 contribuivano alla definizione di un profilo peptidico tipico del formaggio Ragusano, funzione delle differenti attività enzimatiche durante le varie fasi di stagionatura. La maturazione proteolitica produceva, nel Ragusano, un più alto contenuto di proteine predigerite che in altre paste filate allo stesso grado di stagionatura, prospettandone un valore nutrizionale potenzialmente più elevato. Infine, l utilizzo del rapporto γ 3 -CN/β- CN (R 2 = 0,9997) era suggerito quale indice analitico nel controllo di qualità del Ragusano DOP per valutare l effettiva età del formaggio fino a 9 mesi di stagionatura. Parole chiave: Ragusano, proteolisi, urea-page, densitometria, caseine, plasmina, chimosina ABSTRACT - Qualitative and quantitative aspects of proteolysis during PDO Ragusano cheese ageing. - Proteolysis evolution was investigated in six PDO Ragusano cheeses, produced using traditional technologies at Corfilac s experimental dairy center between January and March. Cheeses were sampled at 0, 45, 90, 180 and 270 days of age and analysed for nitrogen composition by chemical fractionation and urea-polyacrilamide gel electrophoresis (urea-page). Hydrolysis of the casein matrix into soluble nitrogen (SN), consisting of low and medium molecular mass peptides, increased markedly from 45 days (9.48% SN/TN) to 6 months (28.03% SN/TN). The SN fraction attained an asymptote of about 28% after 6 months. The larger fraction of SN was made up of non-protein nitrogen (NPN) consisting of oligopeptides and free amino acids, and derived from hydrolysis of the medium-sized peptides, which grew from 72.94% (NPN/SN) at 45 days to 86.67% at 9 months. Densitometric evaluation of the urea-page profiles showed a common third-order kinetic of β- (R 2 = ) and α s1 -casein (R2 = ) degradation. Analysis by ANOVA of residual intact b- and as1-casein percentages revealed significative differences (P = ) in their proteolysis, being the b-cn more hydrolized. Tests of simple effects showed that 180 (P = ) and 270 (P = ) days were the ripening stages where these differences meaningfully appeared. However, the larger fraction of β- and as1-casein proteolysis occurred during the early 3 months of ageing, resulting in 44% and 56% of intact native casein respectively. β-casein breakdown continued during following ripening times resulting in 4% of initial fraction after 9 months, whereas α s1 -casein hydrolysis strongly slowed, leaving 29% of native fraction intact. High levels of γ-caseins (51.25%), α s1 -I (11.33%) and α s1 -II (6.78%) peptides, produced by plasmin and chymosin action on b- and as1- casein respectively, attested to the role carried out by both enzymes in Ragusano proteolysis. These results helped to define the peptidic profile typical of Ragusano cheese as a function of the different enzymatic activities during various stages of ageing. Proteolytic ripening in Ragusano cheese appeared to produce a larger set of predigested proteins than in Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

22 other pasta filata cheeses at the same age, suggesting a potentially higher nutritional value. Finally, the use of γ 3 -CN/β-CN ratio (R 2 = ) was suggested as analytical index for quality control of PDO Ragusano cheese to evaluate the effective age of cheese up to 9 months. Keywords: Ragusano cheese, proteolysis, urea-page, densitometry, caseins, plasmin, chymosin Ringraziamenti: Gli autori desiderano ringraziare l Assessorato Agricoltura e Foreste della Regione Sicilia per i fondi a sostegno della presente ricerca, J Horne per il prezioso supporto scientifico ed i tecnici del Laboratorio latte e derivati del CoRFiLaC per il supporto tecnico. BIBLIOGRAFIA 1) Licitra G, Portelli G, Campo P, Longombardo G, Farina G, Carpino S, Barbano DM (1998). Technology to produce Ragusano cheese: a survey. J. Dairy Sci., 81, ) Licitra G, Campo P, Gurrieri MA, Piccitto I (1999). I formaggi tradizionali di Sicilia: Opere d arte che arricchiscono il Patrimonio dei Beni Culturali Italiani. Monografia del Consorzio Ricerca Filiera Lattiero- Casearia. 3) Gazzetta Ufficiale Comunità Europea (1996). Serie L 163, 2 Luglio CEE n 1263/96. Commissione del 1 Luglio Registrazione delle indicazioni geografiche e delle denominazioni di origine nel quadro della procedura di cui all art. 17 del Regolamento CEE n 2081/92. Lussemburgo. Gazzetta Ufficiale Comunità Europea, Bruxelles, Belgio. 4) Gazzetta Ufficiale Della Repubblica Italiana (1955). N 295, 22 Dicembre D.P.R. 30 Ottobre 1955 n Riconoscimento delle denominazioni circa i metodi di lavorazione, caratteristiche merceologiche e zone di produzione dei formaggi. 5) Gazzetta Ufficiale Della Repubblica Italiana (1995). N 133, 9 Giugno D.P.R. 2 Maggio Riconoscimento della Denominazione di Origine del formaggio Ragusano. 6) Addeo F, Moio L, Stingo C (1988). Caratteri tipici della proteolisi nel formaggio Parmigiano-Reggiano. Composizione della frazione caseinica. Estratto dagli Atti della giornata di studio: Ricerca triennale sulla composizione e su alcune peculiari caratteristiche del formaggio Parmigiano- Reggiano (Ed. Consorzio del Parmigiano-Reggiano), Reggio Emilia, Italia, ) Addeo F, Mucchetti G, Neviani E (1997). Gli aspetti biochimici della maturazione del formaggio con particolare riferimento alle varietà a pasta dura. Sci. Tecn. Latt.-Cas., 1, ) FIL-IDF Standard Method 20B (1993). Milk, Determination of nitrogen content. IDF, International Dairy Federation, Brussels, Belgium. 9) Bynum DG, Barbano DM (1985). Whole milk reverse osmosis retenta- 22 Fallico et al. (2003) Sci. Tecn. Latt.-Cas., 54 (2),

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