1. PRINCIPI GENERALI IL METODO A IMPULSI

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1 1. PRINCIPI GENERALI IL METODO A IMPULSI

2 LA RADIAZIONE EM CAMPO ELETTRICO OSCILLANTE CAMPO MAGNETICO OSCILLANTE Radiofrequenze n = MHz (In pratica: MHz)

3 Lo Spin Nucleare I I = 0, 1/2, 1, 3/2..6 Elementi con massa pari e numero atomico pari hanno spin nucleare I = 0 Elementi con massa dispari o numero atomico dispari hanno spin nucleare I 0 Neutroni pari dispari pari dispari Protoni pari dispari dispari pari I 0 intero semintero 12 C: 6p, 6n I = 0 16 O: 8p, 8n I = 0 Nuclei silenti 13 C: 6p, 7n I = ½ 1 H: 1p, 0n I = ½ 19 F: 9p, 10n I = ½ 31 P: 15p, 16n I = ½ 15 N: 7p, 8n I = ½ 2 H: 1p, 1n I = 1 14 N: 7p, 7n I = 1 Nuclei quadrupolari

4 MOMENTO ANGOLARE E MOMENTO MAGNETICO (p) m Il nucleo possiede massa e carica La sua rotazione intorno al suo asse («spinning») genera un momento angolare p e un momento magnetico m m = g p m = g p = g/2p I(I+1) 1/2 modulo g Rapporto giromagnetico (rad/tesla) h costante di Planck 6.626e -34 J s

5 Frequenza assoluta Sensibilità Relative Intrinseca Sensitivity Relativa c)

6 Sensibilità/Recettività La Sensibilità di un nuclide è una misura di quanto sia facile acquisire un segnale NMR di del nuclide indipendentemente dalla sua abbondanza relativa La Recettività è una misura di quanto sia facile acquisire un segnale NMR di un certo nuclide tenendo conto della sua abbondanza relativa. a = abbondanza relativa del nucleo X S x = sensibilità intrinseca del nucleo X (indipendente da a) R x = recettività R x = as x = ak(g x ) 3 I(I+1) Interessa in genere quanto sia facile rilevare un nucleo rispetto ad uno sensibile di riferimento Sensibilità relativa = s x S 1H Sensibilità del nucleo X rispetto ad H (nucleo sensibile) s 13C S 1H = g 13C 3 1 g 1H = = S -2 1H = 64 S 13C Recettività relativa = R 13C R 1H = g 13C g 1H 3 * = 1.67* 10-4 R 1H ~ 6000 R 13C A parità di condizioni (B0, strumento, concentrazione) il segnale 13C NMR è circa 6000 volte più basso di quello dell 1H!

7 Sensibilità/Recettività Dipendono da: 1. Numero quantico di spin 2. Rapporto giromagnetico (cioè dal nuclide) 3. Forza di B0 4. Differenza di popolazione fra gli stati di spin 5. Forza del segnale indotto nel receiver

8 QUANTIZZAZIONE DIREZIONALE

9 EFFETTO DEL CM STATICO B O SECONDO LA MECCANICA CLASSICA

10 Precessione del Momento Magnetico attorno alla Direzione del Campo Magnetico (meccanica classica) B o m B o m 0 = 2pn 0 = gb 0 (rad s -1 velocità angolare) n 0 = gb 0 2p

11 QUANTIZZAZIONE DIREZIONALE E = -m h gb 0 2p Energia degli stati di spin

12 FREQUENZE DI RISONANZA 1 H E 13 C

13 QUANTIZZAZIONE DIREZIONALE E PRECESSIONE Precessione di dipoli nucleari con spin I = ½ su un doppio cono, con angolo rispetto a z di 54 44

14 POPOLAZIONE E INTENSITÀ DEL SEGNALE L intensità del segnale NMR è proporzionale alla differenza di popolazione tra i due stati di spin La radiazione induce transizioni verso l alto (assorbimento) e verso il basso (emissione) ugualmente probabili, tali da mantenere l eccesso sullo stato a assorbimento emissione indotta eccesso di popolazione Affinché si abbia un segnale, ci deve essere un eccesso di popolazione di spin sul livello inferiore Saturazione = popolazioni uguali = nessun segnale

15 Statistica di Boltzmann Quando un insieme di nuclei con I = ½ è posto in un campo magnetico B 0, ciascuno spin assume una delle due possibili orientazioni, a o b. A temperatura ambiente, il numero degli spin che si dispone sul livello a energia minore (Na), supera di poco il numero di quelli che occupano il livello a energia superiore, (Nb). La statistica di Boltzmann ci dice che N - Nb N Na + = e E - kt = e gh - Bo 2pkT E = differenza di energia tra gli stati di spin k = costante di Boltzmann = x10-23 J/K T è la temperatura in Kelvin Tale rapporto è molto vicino all unità, a meno di una quantità vicina a

16 VETTORE MAGNETIZZAZIONE MACROSCOPICA Insieme di nuclei I = ½ in un CM esterno B 0 Na > Nb Na Nb

17 VETTORE MAGNETIZZAZIONE MACROSCOPICA Insieme di nuclei I = ½ in un CM esterno B 0 Na > Nb

18 L Equazione di Larmor Frequenza della radiazione incidente che causa la transizione: frequenza di Larmor E k n = h = g 2 p = kb o g 2p = Bo hn Rapporto giromagne tico Forza del campo magnetico g è una costante che contiene in sé le caratteristiche fisiche del nucleo ed è quindi diversa per ogni nucleo atomico (H, C, N, etc)

19 RISONANZA Registrazione dello spettro in onda continua CW = Continous wave

20 RISONANZA

21 IL MODELLO VETTORIALE B1 alternante lungo x è rappresentato come due vettori dello stesso modulo B1 che ruotano nel piano xy con frequenza v 1 (v L ) ma in direzioni opposte Di queste solo quella che ruota nello stesso verso dei dipoli nucleari può interagire con essi e quindi con Mo

22 VETTORE M 0 DOPO L IMPULSO NEL SISTEMA CARTESIANO DI LABORATORIO (per un campione ad es di CHCl 3, contenente cioè nuclei di 1 H tutti uguali, senza accoppiamenti)

23 VETTORE M 0 DOPO L IMPULSO NEL SISTEMA CARTESIANO DI LABORATORIO x,y,z M 0 precede intorno all asse z M 0 precede intorno a y B1 campo rotante DESCRIZIONE MOLTO COMPLICATA

24 VETTORE M 0 DOPO L IMPULSO NEL SISTEMA DI ASSI ROTANTI

25 VETTORE M 0 DOPO L IMPULSO NEL SISTEMA ROTANTE M 0 dopo a) impulso arbitrario q; b) impulso a 90 x ; c) impulso di 180 x

26 COERENZA DI FASE Spin in coerenza di fase A seguito dell impulso a 90 gli spin individuali si raccolgono lungo l asse y in fase Nota bene: il numero di spin in fase coerente è proporzionale a Na-Nb (cioè non tutti gli spin sono in coerenza di fase)

27 CALIBRAZIONE DELL IMPULSO A 90 Dipendenza del segnale NMR di un campione di H 2 O rispetto al pulse angle q. Nell esperimento si incrementa ogni volta la durata del tp di un ms. Il massimo dell ampiezza del segnale è ottenuto con un impulso a 90 lungo x (circa 8 ms) Per tp ms l ampiezza è zero, perché questa corrisponde a q = 180, per impulsi più lunghi il segnale diviene negativo

28 RILASSAMENTO Impulso a 90 Ripristino delle condizioni di equilibrio

29 RILASSAMENTO longitudinale Il rilassamento longitudinale ristabilisce la componente longitudinale della magnetizzazione lungo l asse z Si segue come varia (M 0 Mz) nel tempo. Esso diminuisce man mano che Mz si riallinea con z (M 0 M z ) t = (M 0 M z ) 0 exp -t/t1 ma M z = M 0 cosq z Per cui: (M 0 M z ) t = M 0 (1 cosq) exp -t/t1 M 0 Mz q M 0 - Mz Per q= 90 : (M 0 M z ) t = M 0 exp -t/t1 oppure (M z ) t = M 0 (1-exp(-t/T 1 ) Per t = T1 (M 0 M z ) T1 = M 0 exp -1 = 0.37M 0 Per t = 5T1 (M 0 M z ) 5T1 = M 0 exp -5 = M My y T 1 tempo necessario per un recupero del 63% di M 0 5T1 tempo necessario per il recupero completo

30 RILASSAMENTO longitudinale Avviene con meccanismo spin-lattice, cioè energia viene trasferita all intorno per interazione con campi magnetici fluttuanti alle stesse frequenze derivati dal moto browniano molecolare E detto perciò rilassamento entalpico Equazione di Bloch M z = M 0 (1-exp(-t/T 1 ) T 1 costante di tempo del rilassamento longitudinale T 1-1 costante di velocità del rilassamento longitudinale

31 RILASSAMENTO LONGITUDINALE 63% Al tempo t = T 1, il recupero di M lungo z è del 63% Il recupero è totale dopo t = 5T 1 Dipendenza del T1 dalla viscosità del campione. In genere la concentrazione ottimale è M

32 PERCHE DOBBIAMO PREOCCUPARCI DI T 1 AT Pulse delay PD 5T1

33 PERCHE DOBBIAMO PREOCCUPARCI DI T 1 Con un PD (Pulse Delay) troppo corti si perde nell intensità del segnale e quindi si perde la correttezza dell integrazione (importante nell 1 H)

34 MISURA DI T 1 INVERSION RECOVERY EXPERIMENT Inversion Recovery

35 INVERSION RECOVERY EXPERIMENT

36 INVERSION RECOVERY EXPERIMENT I t null M z = M 0 (1-2exp(-t/T 1 ) Rilassamento longitudinale t

37 RILASSAMENTO TRASVERSALE C è un altro modo con cui la Magnetizzazione macroscopica osservabile M 0 torna all equilibrio dopo l impulso a 90 x cioè attraverso un defasamento dei dipoli magnetici individuali che perdono la loro coerenza di fase, portando M xy a zero. Il defasamento è dovuto a differenze locali di CM nel campione che causano piccole differenze di frequenza di precessione degli spin. Nel piano xy: y y y y x x x x

38 RILASSAMENTO TRASVERSALE E un fenomeno che avviene con decadimento esponenziale descritto dall equazione di Bloch, e caratterizzato dalla costante di tempo T 2 Avviene con meccanismo spin-spin, senza scambi di energia con l esterno E detto perciò rilassamento entropico E dovuto a piccole differenze locali di CM nel campione che causano piccole differenze di frequenza di precessione degli spin portando a zero la componente trasversale della magnetizzazione.

39 DECADIMENTO ESPONENZIALE della magnetizzazione trasversale Per un campione di CHCl 3 (nuclei tutti uguali) Decadimento di un campione di CHCl3 quando n 1 = n L (frequenza di eccitazione corrisponde alla frequenza di Larmor dell H e quindi alla frequenza del sistema rotante el sistema rotante) Decadimento di un campione di CHCl3 In cui la n 1 n L n 1 n L = n

40 COSA DETERMINA IL RILASSAMENTO TRASVERSALE - Il rilassamento spin-spin - Le disomogeneità di campo Per cui si definisce un tempo effettivo T 2 * T 2 * = T 2 + T 2 ( B 0 ) quindi T 2 costante di tempo di rilassamento trasversale spin spin (intrinseco) T 2 ( B 0 ) costante di tempo di rilassamento dovuto alle disomogeneità di campo

41 COSA DETERMINA IL RILASSAMENTO TRASVERSALE

42 LINESHAPE Lorenziana Larghezza a mezza altezza * *

43 Relazione fra T 2 * e larghezza di riga Effetto della presenza di particelle ferromagnetiche (che accellerano il decadimento) sulla risoluzione dello spettro

44 T1/T2 - Il rilassamento ristabilisce l equilibrio dopo l impulso - Il rilassamento ristabilisce la componente longitudinale della magnetizzazione lungo l asse z e contemporaneamente fa diminuire la componente trasversale xy fino a portarla a zero z z z z z x y x y x y x y x y

45 T1/T2 R = 1/T velocità M z = M 0 (1-exp(-t/T2)) M y = M 0 (exp(-t/t2)

46 M = M 0

47 T 1 E IMPORTANTE PER: - INTEGRAZIONE - LA CALIBRAZIONE DELL IMPULSO - L IMPOSTAZIONE DEI PARAMETRI DELL ESPERIMENTO T 2 E IMPORTANTE PER: - INFLUENZA LA RISOLUZIONE (LARGHEZZA DELLA RIGA)

48 Determinazione di T 2 con una sequenza spin-echo

49 Determinazione di T 2 con una sequenza spin-echo

50 Determinazione di T 2 con una sequenza spin-echo My (t) = My 0 exp -t/t2 I (intensità) My I = I 0 exp -t/t2 t quindi lni = lni 0 -t/t2 t quindi lni t

51 LA TRASFORMATA DI FOURIER FT Ricapitoliamo cosa succede in un esperimento ad impulsi

52 LA TRASFORMATA DI FOURIER FT Ricapitoliamo cosa succede in un esperimento ad impulsi Il segnale emesso dagli spin nucleari è rilevato dal receiver come una corrente time-dependent, combinazione di un decadimento (rilassamento trasversale) e di un moto sinusoidale ( moto della magnetizzazione)

53 LA TRASFORMATA DI FOURIER FT Relazione fra t e n FID di un campione di CHCl3 con n 1 n L = Dn (frequenza di Larmor frequenza di riferimento) tempo frequenza 13 C del CH 3 OH (accoppiato) Per FID complessi è necessario fare la FT

54 LA TRASFORMATA DI FOURIER FT Componente Re Segnale in assorbimento Componente Im Segnale in dispersione Segnale in valore assoluto Dopo CORREZIONE DI FASE

55 Accumuli AT Pulse delay PD Pulse delay PD AT

56 CHEMICAL SHIFT La circolazione di elettroni genera CM locali che «schermano» i nuclei della molecola rispetto a B 0 secondo una costante di schermo s che dipende dall intorno chimico Beff = B 0 sb 0 = B 0 (1-s) 2.11 T 90 MHz s TMS: Hz CH 3 Br: Hz CH 2 Br 2 : Hz CHBr 3 : Hz Frequenze assolute

57 CHEMICAL SHIFT Hz d = ppm MHz TMS: 0.00 ppm CH 3 Br: 2.63 ppm CH 2 Br 2 : 4.90 ppm CHBr 2 : 6.82 ppm Con questo spettrometro 1 ppm corrisponde a 90 Hz

58 Equivalenza in Hertz di 1 ppm Frequenza dello strumento Equivalenza in Hz di 1 ppm 60 MHz 60 Hz 100 MHz 100 Hz 300 MHz 300 Hz 400 MHz 400 Hz Ogni unità di ppm rappresenta o una variazione di 1 ppm di B o (forza del campo magnetico, Tesla) o una variazione di 1 ppm nella frequenza di precessione (MHz) parte per milione di n MHz è n Hz n MHz 10 6 = n Hz 0 ppm

59 CHEMICAL SHIFT NEL MODELLO VETTORIALE Assumiamo che: n rif = n A La magnetizzazione di A è statica su y (sistema rotante) dopo l impulso a 90 Il chemical shift è misurato dalla differenza di frequenza n fra i due vettori. Sono queste differenze che noi mettiamo in relazione con la struttura delle molecole. Questa differenza è la grandezza che compare al numeratore nella definizione di d

60 CHEMICAL SHIFT NEL MODELLO VETTORIALE Altro esempio: In questo esempio la n rif non coincide con nessuna frequenza del campione 300 MHz n rif : n 1 : n 2 : n 3 : Hz Hz Hz Hz n 1 = 2000 Hz 6.7 ppm n 2 = 800 Hz 2.7 ppm n 3 = Hz ppm

61 ACCOPPIAMENTO NEL MODELLO VETTORIALE Doppietto: Tripletto: