NMR - 2D INTENSITA VS FREQUENZA INTENSITA VS FREQUENZA1 VS FREQUENZA2

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1 NMR - 2D

2 NMR - 2D INTENSITA VS FREQUENZA INTENSITA VS FREQUENZA1 VS FREQUENZA2

3 NMR - 2D Spettri shift correlati: chemical shift su entrambi gli assi Spettri J correlati: J su un asse TIPO DI ACCOPPIAMENTO: OMONUCLEARE (H-H, C-C) SCALARE (ATTRAVERSO LEGAMI, J) DIPOLARE (ATTRAVERSO LO SPAZIO, NOE) SCAMBIO CHIMICO ETERONUCLEARE (C-H)

4 COME SI GENERA LA SECONDA DIMENSIONE NEL SINGLE PULSE: PREPARAZIONE-IMPULSO-FID(t 2 ) NEI MULTIPULSE: PREPARAZIONE-IMPULSO-EVOLUZIONE(t 1 fisso)-impulso-acquisizione(t 2 ) Nel 2D-NMR: t1 variabile (incrementi da ms a s) mixing time (dipende dall esperimento)

5 COME SI GENERA LA SECONDA DIMENSIONE Es: sistema a 1 spin (CHCl3, CH3COCH3, etc. Spettro S(t2) singoletto Applico la seguente sequenza, registrando una serie di spettri, ciascuno con N scans, al variare di t1 In questo caso non c è mixing che serve per i sistemi accoppiati t 1 L intensità rilevata dipende dalla posizione in cui si trova M 0 sen360n t 1 C è una moduklazione (variazione sinusoidale ) del segnale lungo t1

6 COME SI GENERA LA SECONDA DIMENSIONE t 1 Evoluzione in base al chemical shift C è una modulazione (variazione sinusoidale ) del segnale lungo t1, condizione per creare la seconda dimensione

7 COME SI GENERA LA SECONDA DIMENSIONE S k nt 1 = 0 nessun segnale nt 1 = 90 massimo etc nt 1 = 90 n Decadimento con T 2 * S 1 S 2

8 COME SI GENERA LA SECONDA DIMENSIONE FT FT t 1 n 1 n 2 n 2 n2 IL SEGNALE MODULATO COME FUNZIONE DI t1 VIENE RILEVATO COME FUNZIONE DI t2

9 COME SI GENERA LA SECONDA DIMENSIONE S 1 (t 11, t 2 ) S 2 (t 12, t 2 ) FT t 2 S 1 (t 11, n 2 ) S 2 (t 12, n 2 ) S 3 (t 13, t 2 ) S 3 (t 1k, n 2 ) S k (t 1k, t 2 ) S k (t 1k, n 2 )

10 COME SI GENERA LA SECONDA DIMENSIONE S 1 (t 11, t 2 ) S 2 (t 12, t 2 ) S 3 (t 13, t 2 ) S k (t 1k, t 2 ) FT t 2 S 1 (t 11, n 2 ) S 2 (t 12, n 2 ) S 3 (t 13, n 2 ) S k (t 1k, n 2 ) n 2 chemical shift del CHCl3 In questo caso n 1 = n 2 Matrice di k righe e w colonne (w = n di data points) FT S(t1, t2) S (t1, n 2 ) FT S(t1, n 2 ) S (n 1, n 2 ) I dati sono stati trattati in modo da avere una funzione S(n 1, n 2 ) FT t 1 S 1 (n 1, n 2 ) S 2 (n 1, n 2 ) S 3 (n 1, n 2 ) S k (n 1, n 2 )

11 NMR - 2D Stacked plot Contour plot

12 NMR - 2D Sistema AX non accoppiato Anche in questo caso le frequenze sono uguali nelle due dimensioni per i due picchi diagonale

13 NMR - 2D I due casi precedenti non sono utili rispetto allo spettro NMR-1D perché i due assi riportano le stesse informazioni (n 1 = n 2 ) Gli spettri 2D sono utili se i loro segnali mettono in relazione (correlano) informazioni diverse sui due assi cioè quando n 1 n 2 Questo avviene solo se la magnetizzazione che evolve a frequenza n 1 nel tempo t 1 evolve a una frequenza diversa n 2 nel tempo t 2 cioè quando n 1 n 2. Ci deve essere un cambiamento nella frequenza di precessione e questo succede nel mixing time

14 NMR - 2D Preparation: di durata > T1, può comprendere degli impulsi che preparano l esperimento allineando i nuclei in un certo modo, seguiti da impulsi di perturbazione Evoluzione: la magnetizzazione evolve sulla base del ch shift e/o della J Mixing time: interazioni come accoppiamenti lungo legami o nello spazio che sono responsabili Dell informazione nello spettro

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16 NMR - 2D 1. CORRELAZIONI OMONUCLEARI SHIFT CORRELATE

17 COSY CORRELATION SPECTROSCOPY H-H MA ANCHE ALTRI NUCLEI SENSIBILI. CORRELAZIONE OMONUCLEARE INDIVIDUA ACCOPPIAMENTI SCALARI (ALTERNATIVA ALLO SPIN DECOUPLING) Sistema AX : d A, d X, J AX F dipende da J AX q dipende da d A

18 COSY CORRELATION SPECTROSCOPY H-H MA ANCHE ALTRI NUCLEI SENSIBILI. CORRELAZIONE OMONUCLEARE INDIVIDUA ACCOPPIAMENTI SCALARI (ALTERNATIVA ALLO SPIN DECOUPLING) Sistema AX F dipende da J AX q dipende da d A Il secondo impulso (mixing pulse) ruota le componenti d A dipendenti di My su z e z Trasferimento di polarizzazione da A ad X e da X ad A L ammontare dello scambio dipende da t1 che viene variato in maniera incrementale Il FID per ogni esperimento contiene segnali di A e X modulati da due frequenze (d A, d X ), Per cui le due FT in t2 e in t1 genera al massimo 2 2 segnali di coordinate

19 COSY n A n X n X n A Diagonal peaks Diagonal (d A, d A ); (d X, d X ) Cross (d A, d X ); (d X, d A ) Cross peaks

20 COSY: come leggere lo spettro f 2 f 1 I picchi contenuti sulla diagonale corrispondono allo spettro monodimensionale.

21 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro f 2 f 1 Le macchie simmetricamente disposte al di fuori della diagonale mettono in correlazione due diversi valori di frequenza e quindi due valori diversi di spostamento chimico. Questi cross-peak indicano che i protoni corrispondenti sono accoppiati tra loro.

22 COSY: come leggere lo spettro f 2 f 1 Le macchie simmetricamente disposte al di fuori della diagonale mettono in correlazione due diversi valori di frequenza e quindi due valori diversi di spostamento chimico. I cross-peaks indicano che i protoni corrispondenti sono accoppiati tra loro.

23 COSY: come leggere lo spettro f 2 f 1 Le macchie simmetricamente disposte al di fuori della diagonale mettono in correlazione due diversi valori di frequenza e quindi due valori diversi di spostamento chimico. I cross-peaks indicano che i protoni corrispondenti sono accoppiati tra loro.

24 COSY: come leggere lo spettro Si parte da un picco di cui si conosce l attribuzione per stabilire le correlazioni.

25 COSY: come leggere lo spettro

26 COSY: come leggere lo spettro Si rintraccia il picco relativo sulla diagonale

27 COSY: come leggere lo spettro Si traccia una retta ortogonale all asse sino a incontrare un cross peak

28 COSY: come leggere lo spettro Dal cross peak si traccia una linea ortogonale alla prima per andare a incrociare sulla diagonale il picco correlato

29 COSY: come leggere lo spettro Dal cross peak si traccia una linea ortogonale alla prima per andare a incrociare sulla diagonale il picco correlato

30 COSY: come leggere lo spettro Dal picco sulla diagonale si torna sull asse delle frequenze identificando il picco correlato al 7 che corrisponde ai protoni in 6

31 COSY: come leggere lo spettro Dal picco sulla diagonale attribuita agli idrogeni in posizione 6 si traccia un segmento ortogonale all'asse delle frequenze sino ad incontrare i cross peak

32 COSY: come leggere lo spettro Un cross peak è relativo all accoppiamento con 7, l altro deve essere relativo all accoppiamento con 5

33 COSY: come leggere lo spettro Per identificare sulla diagonale il picco dei protoni in 5 si traccia un nuovo segmento a partire dal nuovo cross peak

34 COSY: come leggere lo spettro

35 COSY: come leggere lo spettro

36 COSY: come leggere lo spettro

37 COSY: come leggere lo spettro

38 A3 A4 A2 A5 A6 A6 B5 B6 B6

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40 COSY LONG RANGE H2 H4 H3

41 COSY90

42 DQF COSY (DOUBLE QUANTUM FILTER COSY)

43 COSYb MIXING PULSE <90

44 COSY45 MIXING PULSE 45

45 TOCSY 2D TOCSY 1D grande semplificazione dello spettro Svantaggi: possono essere necessari molti esperimenti (tanti quanti i segnali da irraggiare) Irraggiamento selettivo non sempre facile

46 TOCSY 2D

47 TOCSY 2D

48 TOCSY 2D

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50 TOCSY 2D

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52 INADEQUATE Accoppiamenti 13C-13C, sistemi AX o AB 1D 90 x t 180 y t 90 x D - 90 x - FID 2D 90 x t 180 y t 90 x t 1-90 x - FID Contemporaneamente si può applicare BBD su 1H per evitare accoppiamenti eteronucleari La sequenza 90 -t-90 (a parte l impulso rifocalizzante) crea coerenza doppio quantica Non rappresentabile ma che coctituisce un filtro doppio quantico (come in DQF-COSY) per Eliminare le transizioni 12C-13C In t 1 evolve la magnetizzazione doppio quantica che viene riconvertita in SQ osservabile dall ultimo Impulso

53 INADEQUATE-2D I segnali dei satelliti sono modulati durante t1 dalla frequenza n DQ = n A + n X La FT(t 1 ) da uno spettro 2D in cui le coordinate lungo l asse n1 corrispondono alle frequenze Doppioquantiche n DQ = n A + n X per ogni coppia 13C-13C Per ogni coppia 13C-13C ottengo due doppietti Spettro del butanolo

54 INADEQUATE-2D n 2 n 1

55 INADEQUATE-2D n 1

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57 NMR - 2D 2. CORRELAZIONI ETERONUCLEARI SHIFT CORRELATE

58 H,C-COSY C,H-COSY Informazione: quale C è attaccato a quale protone Differenza: nel primo caso il nucleo osservato è il 13C (poco sensibile) Nel secondo caso il nucleo osservato è il H (molto sensibile)

59 H,C-COSY: HETCOR Heteronuclear Correlation Si inverte la popolazione dell 1H, si ha trasferimento di polarizzazione su 13 C di entità variabile con t1 Sequenza:

60 H,C-COSY: HETCOR Heteronuclear Correlation Si inverte la popolazione dell 1H, si ha trasferimento di polarizzazione su 13 C di entità variabile con t1

61 H,C-COSY: HETCOR Heteronuclear Correlation Si inverte la popolazione dell 1H, si ha trasferimento di polarizzazione su 13 C di entità variabile con t1

62 H,C-COSY: HETCOR Heteronuclear Correlation

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64 C,H-COSY: HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlation HETCOR Stesse informazioni Minor tempo di acquisizione Procedura inversa. Si induce coerenza (90x) sul canale del nucleo insensibile Si rileva il nucleo più sensibile HMQC

65 C,H-COSY: HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation INEPT Stesse informazioni Minor tempo di acquisizione 1H 90 x t-180 x 90 y t 1 /2-180 y t 1 /2 90 x t 180 x t-fid (t2) 13C t-180 x t-90 x t 1 90 x t 180 x t-bb

66 C,H-COSY: HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation Stesse informazioni Minor tempo di acquisizione

67 H,C-COSY

68 C,H-COSY

69 HETCOR

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72 HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence FILTRA GLI ACCOPPIAMENTI 1 J CH SI VEDONO GLI ACCOPPIAMENTI 2 J CH E 3 J CH

73 HSQC HMBC

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75 Non si osservano costanti dirette

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77 NOESY-2D NOE NOESY 2D ROESY 2D

78 NOESY-2D SISTEMA AX OMONUCEARE

79 NOESY-2D I picchi correlati attraverso NOE sono in antifase rispetto alla diagonale Confrontare con COSY

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81 NOESY-2D ROESY 2D PER MACROMOLECOLE (O IN LIQUIDI VISCOSI) I PICCHI DI CORRELAZIONE HANNO LA STESSA FASE DEI DIAGONALI PER MOLECOLE DI DIMENSIONI INTERMEDIE ( Da) NOE=0 Si usa la sequenza ROESY 2D L IMPULSO SPIN LOCK DEVE ESSERE FORTE PER CONTENERE TUTTE LE FREQUENZE E DI UNA FASE DIFFERENTE DI 90 RISPETTO AL PRIMO IMPULSO (QUINDI SU y) PER BLOCCARE LA MAGNETIZZAZIONE SU QUESTO ASSE SCAMBIO DI ENERGIA AVVIENE FRA MAGNETIZZAZIONI TRASVERSALI E NON LONGITUDINALI FT(t1,t2) DA LO SPETTRO ROESY CON PICCHI DIAGONALI E CROSSPEAKS DI SEGNO OPPOSTO

82 (EXSY EXCHANGE SPECTROSCOPY) Stesso esperimento del NOESY 2D ma la correlazione (il trasferimento di popolazione) avviene per scambio chimico

83 NOESY-2D Scambio lento H2O - OH

84 PRINCIPALI SEQUENZE 2D

85 J RESOLVED NMR 2D Gli esperimenti J resolved separano l informazione del chemical shift (n 1 ) da quella della J (n 2 ) lungo le due dimensioni dello spettro consentendo l assegnazione esatta di chemical shift e J di multipletti sovrapposti nello spettro 1D 1. HETERONUCLEAR (C-H) J-RESOLVED 2D Derivano dalla variazione periodica del segnale del 13 C durante t 1 ad opera della J CH (frequenza di modulazione) Si usa una sequenza uguale alla 1D J-MODULATED SPIN ECHO, con t 1 variabile in maniera incrementale. Il decoupler è acceso ad intermittenza, in particolare viene spento durante la seconda metà del t 1.

86 J RESOLVED NMR 2D 1. HETERONUCLEAR t 1 /2 180 y t 1 /2 BB L evoluzione del Chemical shift (e le inomogeneità di campo) sono rifocalizzate dal 180 y

87 Evoluzione della magnetizzazione CH Facciamo n esperimenti a diversi valori di t1 e trasformiamo (t2) tutti gli n esperimenti Otteniamo n singoletti (perché c è BB) di diverse intensità: modulazione in t1

88 Evoluzione della magnetizzazione CH Modulazione dell ampiezza in t1 da una frequenza JCH

89 J RESOLVED NMR 2D Seconda trasformata di Fourier in t1 dà due segnali separati da J/2

90 RIASSUMENDO: La dimensione n2 contiene il 13C chemical shift La dimensione n1 contiene le costanti di accoppiamento Per sistemi AX (CH): Il segnale indotto nel receiver dipende dalla somma dei due vettori, che a sua volta dipende da JCH). Dopo FT(t2) si ottiene un singoletto sull asse orizzantale (n2) Il segnale è modulato dal valore di JCH in t1. Dopo FT(t1) otteniamo un doppietto sull asse verticale (n1) con una separazione di J/2

91 EVOLUZIONE DEI MULTIPLETTI CH x SOTTO L INFLUENZA DELLA J

92 J RESOLVED NMR 2D

93 J RESOLVED NMR 2D

94 2. HOMONUCLEAR (HH) J-RESOLVED 2D J RESOLVED NMR 2D Esperimento simile a J-MOD spin echo con t1 variabile Ovviamente non si può usare il BB Gli Impulsi sono applicati su entrambi gli spin A e X J coupling evolvono durante entrambi i t1/2 Evoluzoine del chemical shift e le inomogeneità sono rifocalizzate con 180 x SISTEMA AX

95 2. HOMONUCLEAR (HH) J-RESOLVED 2D J RESOLVED NMR 2D Per un sistema 1H AX: Il segnale nel receiver dipende dalla somma dei due vettori, che dipende da JAX. Dopo FT(t2) otteniamo 1 picco in n2 I segnali 1H NMR sono modulati da JAX in t1. La FT(t1) si osserva un doppietto in t1 con separazione JAZ

96 J RESOLVED HH-2D