Parametri NMR Accoppiamento Scalare

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1 Parametri NMR Accoppiamento Scalare Mario Piccioli Magnetic Resonance Center CERM Department of Chemistry University of Florence, Italy Ringraziamenti Stefano Mammi Stefano Chimichi Alessandro Bagno Daniel Cicero Paola Turano M.Levitt Spin Dynamics J. Keeler Understanding NMR Spectroscopy H.Gunther NMR Spectroscopy

2 Termini dell Hamiltoniano di spin Meccanismi di accoppiamento La partecipazione degli elettroni cambia il modo in cui l interazione tra spin é dipendente dalla loro riorientazione Pertanto, quando in un liquido isotropico le interazioni sono mediate per effetto del moto, rimane un termine isotropico. Esso fornisce una diretta evidenza spettrale dei legami chimici e pertanto é un prezioso strumento per la determinazione strutturale Gli effetti di accoppiameno dipolare indiretto sono SOLO INTRAMOLECOLARI L effetto é misurabile sono per un limitato numero di legami chimici

3 Significato fisico della J Significato fisico della J

4 Accoppiamento scalare 13 C 1 H 13 C 1 H Accoppiamento scalare 13 C 1 H 13 C 1 H

5 Accoppiamento scalare β β α α 1 H S 13 C I Accoppiamento scalare

6 Accoppiamento scalare Due spin isolati E= -1/2 γħb 0 = - m i ν i m i = - ½, ½ +1/2 ν A +1/2 ν X E ν A ν X +1/2 ν A -1/2 ν X ν A -1/2 ν A +1/2 ν X ν X -1/2 ν A -1/2 ν X E= - i m i ν i

7 Due spin accoppiati E= -1/2 γħb 0 = - m i ν i Accoppiamento debole J<< ν m i = - ½, ½ +1/2 ν A +1/2 ν X +1/4 J AX +1/2 ν A +1/2 ν X E ν A ν A ν X +1/2 ν A -1/2 ν X ν A - ½ J AX ν X + ½ J AX ν A + ½ J AX +1/2 ν A -1/2 ν X -1/4 J AX -1/2 ν A +1/2 ν X ν X -1/2 ν A -1/2 ν X ν X - ½ J AX -1/2 ν A +1/2 ν X -1/4 J AX -1/2 ν A -1/2 ν X +1/4 J AX E= - i m i ν i + ij J ij m i m j Accoppiamento scalare CH 3 -CH 2 -OH

8 Accoppiamento scalare 2 J 3 J 2 JH β H β 3 JH α H β 3 J 3 JH Ν H α Accoppiamento scalare 1 J HC 1 J CC 1 J HN

9 Molteplicità dell accoppiamento n.spin X Spin A osservato Freq. A osservate 0 ν A 1 ν A ± ½ J AX 2 ν A ± ½ J AX ± ½ J AX 3 ν A± ½ J AX ± ½ J AX ± ½ J AX Molteplicità dell accoppiamento

10 Accoppiamento scalare Accoppiamento scalare

11 Il segno della costante α β α β β α β α A X A X A X L effetto del campo magnetico

12 Sistemi del 1 ordine Accoppiamento debole J<< ν Separazione in frequenza almeno pari a 10*J Se aumento il campo magnetico, ν aumenta e J rimane costante Aumentare il campo magnetico semplifica l analisi dei sistemi di spin Torneremo dopo sul concetto di accoppiamento forte e accoppiamento debole Ma intanto ricorda che Esperimenti in rotating frame (TOCSY, ROESY, DIPSI, sono sempre in accoppiamento forte) Gli esperimenti heteronucleari HSQC, HMQC, INEPT di ogni tipo ) sono sempre in accoppiamento debole Sistema AX

13 Sistemi di spin A2X3 Combinando insieme accoppiamenti diversi

14 Sistema AMX Sistema AMX

15 Spettri del 2 ordine Accoppiamento forte significa che l accoppiamento è forte rispetto alla differenze di energia dei livelli energetici del sistema, che determinano poi le frequenze di transizione In effetti un accoppiamento tra due spin non cambia di valore, è il resto del sistema che cambia nel passaggio da accoppiamento forte ad accoppiamento debole Spettri del 2 ordine ν 1,2 ν 3,4 1,2 =ν A ±J/2 3,4 =ν B ±J/2 ν 1,2,3,4 1,2,3,4 =(ν A +ν B )/2 ±D/2 ±J/2

16 Sistema AB J=5Hz Sistema AB Misure dirette JAB 2C (2C) 2 = (ν Α ν Β ) 2 +J 2 I 2 /I 1 = ν 1,4 / ν 2,3

17 Sistema AB Sistema AB

18 From AX2 to AB2 500 MHz From AX2 to AB2 200 MHz

19 From AX2 to AB2 Sistema AB2

20 Sistema AB2 Sistema AB2

21 Sistema ABX Sistema ABX

22 Accoppiamento forte e accoppiamento debole 2 spin Accoppiamento forte e accoppiamento debole

23 Accoppiamento debole Accoppiamento debole

24 Accoppiamento forte Accoppiamento forte

25 Spin Magneticamente Equivalenti Singlet-triplet basis Multipletti e larghezza di riga La larghezza di riga di un segnale NMR dipende dalle proprietà di rilassamento T 2. In prima approssimazione, il T 2 dipende a sua volta dalle dimensione della molecola studiata. Piu la molecola è grande, piu il T 2 è corto e piu i segnali sono larghi 3-10 Hz 15 Hz MW ca In una proteina, la larghezza di riga di un Hn o di un Ha è tipicamente maggiore di 10 Hz, ovvero della separazione del doppietto. In queste condizioni, l accoppiamento scalare non da luogo a doppietti osservabili Hz MW

26 Importante N 3 J dipendono dall angolo diedro INFORMAZIONE STRUTTURALE IMPORTANTE 3 J HNHα = Acos 2 φ + B cosφ +C

27 Ogni costante di accoppiamento 3 J sottende un angolo diedro 3 J 1 Hb- 15 N DeMarco, Llinas, Wutrich, Biopolymers, J 1 Ha- 1 Hb Angolo diedro χ 1 Karimi Nejad, Schmidt, Ruterjans, Schwalbe, Grieseinger, Biochemistry, 1994 Per ogni curva di Karplus i coefficenti sono calcolati in base al confronto tra valori sperimentali e parametri strutturali e validati con vari strumenti Schmidt, Blumel, Lohr, Ruterjans, J. Biomol. NMR 1999

28 13 C Direct Detected COCO-TOCSY N 3 J C C a. diedro φ Accoppiamento e Magnetizzazione Accoppiamento scalare rende possibile un trasferimento di magnetizzazione tra i spin accoppiati Questa proprietà é del tutto indipendente dal fatto che un accoppiamento sia visibile o invisibile in un esperimento NMR come Nella maggior parte dei casi gli accoppiamenti scalari sono invisibili, ma misurabili anche in modo quantitativo attraverso NMR multidimensionale

29 Heteronuclear cases The scheme of 1J scalar couplings The 2D Hetcor experiment Two dimensional Heteronuclear correlation Experiment

30 2D HETCOR Expriment 2D HETCOR Expriment Prima dimensione

31 2D HETCOR Expriment Prima dimensione 2D HETCOR Expriment Prima dimensione Seconda dimensione

32 2D HETCOR Expriment Prima dimensione Seconda dimensione Esempio HETCOR

33 1 J couplings for backbone resonances The role of metal cofactor in protein unfolding Metal triggered protein folding Apo 3.3 M GdmCl Ca M GdmCl Ca 2+ Loss of secondary structure elements: unfolded protein Refolding

34 Apo vs holo protein, mapping the environment of the metal ion 15 N HNδ HNε HNε H Ma il legame a idrogeno é una interazione elettrostatica? 3 J N i C j O N C 3 J!

35 Eteronuclei Hz o 205 Tl in Transferrina o C o 2 J 205 Tl- 13 C Fe3+ Aramini et al. Biochemistry 1994 Eteronuclei 199 Hg Utschig, Bryson, O Halloran, Science 1995