QMS TOPIRAMATE. Immunoassay REAGENTI PER IL TOPIRAMATO Legenda dei simboli

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1 C Gennaio, 2010 QMS TOPIRAMATE Immunoassay Prima dell uso, è necessario leggere con attenzione il presente foglio illustrativo relativo al sistema Quantitative Microsphere System (QMS). È necessario attenersi rigorosamente alle istruzioni fornite sul foglio illustrativo del prodotto. L affidabilità dei risultati del dosaggio non può essere garantita in caso di deviazioni dalle istruzioni fornite sul presente foglio illustrativo. Servizio clienti Stati Uniti: Internazionale: Fax: Legenda dei simboli Dispositivo medico diagnostico in vitro Codice/numero di lotto Reagente 1 Reagente 2 Attenzione - Consultare la documentazione allegata Consultare le istruzioni per l uso Limiti di temperatura Numero di catalogo Ingredienti Contenuto del kit Usare entro il/data di scadenza Rappresentante autorizzato per la comunità europea Produttore Microgenics GmbH Spitalhofstrasse 94 D Passau Tel: +49 (0) Fax: +49 (0) REAGENTI PER IL TOPIRAMATO Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved.

2 NOME Dosaggio QMS per il topiramato (TPM) USO PREVISTO Il dosaggio QMS per il topiramato è previsto per la determinazione quantitativa del topiramato in siero o plasma umano mediante analizzatori chimico-clinici automatizzati. I risultati ottenuti vengono usati nella diagnosi e nel trattamento dell overdose da topiramato e nel monitoraggio dei livelli di topiramato per garantire l adeguatezza della terapia. SOMMARIO E SPIEGAZIONE DEL METODO Il topiramato (2,3:4,5-Di-O-isopropilidene-ß-D-fruttopiranosio) è un farmaco anticonvulsivante approvato per il trattamento dell epilessia; viene spesso prescritto in monoterapia o nell ambito di una terapia antiepilettica multifarmaco. 1 PRINCIPI DEL METODO Il dosaggio QMS per il topiramato è un dosaggio immunoturbidimetrico a particelle omogenee. Il dosaggio si basa sulla competizione tra il farmaco presente nel campione e il farmaco presente nel rivestimento di microparticelle per i siti di legame anticorpale offerti dal reagente contenente l anticorpo anti-topiramato. Il reagente contenente le microparticelle rivestite di topiramato viene rapidamente agglutinato in presenza del reagente contenente l anticorpo anti-topiramato e in assenza di farmaci antagonisti nel campione. La velocità della variazione di assorbanza viene misurata in fotometria. Quando viene aggiunto un campione contenente topiramato, la reazione di agglutinazione risulta parzialmente inibita con conseguente riduzione della velocità di variazione dell assorbanza. È possibile ottenere una classica curva di inibizione dell agglutinazione concentrazione-dipendente con tasso

3 massimo di agglutinazione alla concentrazione minima di topiramato e tasso minimo di agglutinazione alla concentrazione massima di topiramato. REAGENTI Kit di reagenti Il dosaggio QMS per il topiramato, , viene fornito come kit composto da due reagenti allo stato liquido pronti per l uso, contenente: Reagente 1 Reagente 2 1 x 22 ml 1 x 16 ml Ingredienti reattivi Ingrediente Anticorpo policlonale anti-topiramato (ovino) <5,0% Sodio azide <0,1% Microparticelle rivestite di topiramato <1,0% Sodio azide <0,1% CONSERVAZIONE E MANIPOLAZIONE DEI REAGENTI I reagenti ed sono pronti per l uso. Prima dell uso, capovolgere delicatamente più volte evitando però la formazione di bollicine. Se presenti all interno della cartuccia reagenti, le bollicine

4 d aria vanno rimosse usando un nuovo bastoncino applicatore. In alternativa, lasciare riposare il reagente alla temperatura di conservazione corretta in modo da consentire la dissipazione delle bollicine. Per ridurre al minimo lo spreco di volume, non usare una pipetta di trasferimento per rimuovere le bollicine. Quando la cartuccia reagente o si esaurisce, sostituire entrambe le cartucce e verificare la calibrazione con almeno due livelli di controlli in base ai requisiti di controllo di qualità stabiliti dal laboratorio di appartenenza. Se i risultati dei controlli non ricadono entro i limiti del range di accettabilità, è possibile che sia necessario eseguire nuovamente la calibrazione. ATTENZIONE - Eventuali bollicine nel reagente possono interferire con il corretto rilevamento del livello di reagente nella cartuccia, provocando l aspirazione di una quantità di reagente insufficiente con un possibile effetto negativo sui risultati. Se conservati a una temperatura compresa tra 2 e 8 C, i reagenti chiusi rimangono stabili fino alla data di scadenza indicata. Non congelare i reagenti o esporli a temperature superiori a 32 C. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Precauzioni per gli operatori Per uso diagnostico in vitro. Non mescolare materiali provenienti da kit con numeri di lotto diversi. ATTENZIONE - Questo prodotto contiene materiale di origine umana e/o componenti potenzialmente infettivi. I componenti derivati dal sangue umano sono stati analizzati e sono risultati

5 non reattivi per l HBsAg e gli anticorpi anti-hiv 1/2 e anti-hcv. Nessun metodo di analisi è in grado di assicurare in modo assoluto che i prodotti ottenuti da materiali di origine umana o da microrganismi inattivati non siano in grado di trasmettere infezioni. Si consiglia quindi di considerare tutti i materiali di origine umana come potenzialmente infettivi e di maneggiarli in base alle corrette procedure di biosicurezza. RACCOLTA E TRATTAMENTO DEI CAMPIONI Per il prelievo dei campioni destinati al dosaggio QMS per il topiramato è possibile usare le seguenti provette. Siero Vetro Plastica Senza additivi Provetta con separatore di siero (gel) Senza additivi Plasma EDTA (K 3) EDTA (K 2) Litio eparina Provetta con separatore di plasma con litio eparina (gel) Sodio eparina Altre provette per il prelievo dei campioni non sono state convalidate per l uso nell ambito del dosaggio QMS per il topiramato. Per l uso delle provette per il prelievo di siero o plasma, attenersi alle istruzioni per il trattamento fornite dai rispettivi produttori. La centrifugazione inadeguata dei campioni può provocare risultati errati.

6 Accertarsi che i campioni siano privi di fibrina, eritrociti e altre sostanze particolate. Separare il plasma o siero dalle cellule, dal coagulo o dal gel quanto prima possibile dopo il prelievo del campione. Alcune provette con separatore di gel possono non essere idonee per l uso con i dosaggi per il monitoraggio dei farmaci terapeutici; consultare le informazioni fornite dai produttori delle provette. 2 I campioni separati dalle cellule, dal coagulo o dal gel possono essere conservati per una settimana al massimo a 2-8 C. Se l analisi non viene effettuata entro una settimana, i campioni devono essere conservati congelati ( -10 C). Non si è riscontrata alcuna differenza (±10% di concentrazione di topiramato al tempo zero) tra le prestazioni fornite dai campioni conservati refrigerati (a 2-8 C) fino a una settimana o congelati fino a quattro settimane e le prestazioni fornite dai campioni freschi. È necessario ridurre al minimo il numero di cicli di congelamento/scongelamento. PROCEDURA Materiali forniti Reagenti QMS per il topiramato, Materiali necessari ma non forniti Calibratori QMS per il topiramato, CAL A-F: 1 1,0 ml cad. Controlli QMS per il topiramato, Livelli 1-3: 1 x 2,0 ml cad. Procedura del dosaggio Per una descrizione particolareggiata delle modalità di esecuzione e di calibrazione del dosaggio, consultare il manuale d uso specifico dello strumento utilizzato.

7 Procedure di diluizione dei campioni Usare il CAL A QMS per il topiramato (0,0 µg/ml) per diluire manualmente i campioni esterni al range refertabile del dosaggio. Protocollo di diluizione manuale I campioni dei pazienti contenenti concentrazioni di topiramato maggiori di 32,0 µg/ml possono essere diluiti manualmente con il CAL A QMS per il topiramato (0,0 µg/ml) prima di pipettarli nelle coppette per campione. La diluizione deve essere eseguita in modo che i risultati del dosaggio del campione diluito siano superiori alla soglia di sensibilità del dosaggio pari a 1,5 µg/ml. Per ottenere la concentrazione finale del campione, la concentrazione refertata deve essere successivamente moltiplicata per il fattore di diluizione manuale. Final Sample Concentration = Reported Concentration Manual Dilution Factor Fattore di (Volume del campione + Volume del CAL A) = diluizione manuale Volume del campione CALIBRAZIONE Il dosaggio QMS per il topiramato deve essere calibrato usando una procedura di calibrazione completa (a 6 punti). Per eseguire una calibrazione completa, analizzare in duplicato i calibratori QMS per il topiramato A, B, C, D, E ed F. È necessario eseguire la calibrazione con ciascun nuovo numero di lotto. Verificare la curva di calibrazione con almeno due livelli di controlli in base ai requisiti relativi al controllo di qualità stabiliti dal laboratorio

8 di appartenenza. Se i risultati dei controlli non ricadono entro i limiti del range di accettabilità, è possibile che sia necessario effettuare nuovamente la calibrazione. Nota - Il CAL A QMS per il topiramato è il calibratore bianco di questo dosaggio. CONTROLLO DI QUALITÀ Per gli ulteriori requisiti di controllo di qualità e le possibili azioni correttive, consultare le procedure operative standard e/o il programma di garanzia di qualità vigenti nel laboratorio di appartenenza. Tutti i requisiti di controllo della qualità vanno soddisfatti in conformità alle normative vigenti o ai requisiti per l accreditamento. Requisiti consigliati per il controllo di qualità del dosaggio QMS per il topiramato Un minimo di due livelli di controlli ai limiti del range decisionale medico devono essere analizzati ogni 24 ore. Se è necessario effettuare un monitoraggio di controllo più frequente, attenersi alle procedure relative al controllo di qualità del laboratorio di appartenenza. Se i risultati del controllo di qualità non ricadono entro i limiti del range di accettabilità definito dal laboratorio, i risultati dei pazienti possono non essere affidabili ed è necessario intraprendere azioni correttive. RISULTATI I risultati ottenuti mediante il dosaggio QMS per il topiramato possono essere refertati in base alle seguenti unità: µg/ml o µmol/l. Per convertire i risultati da µg/ml di topiramato a µmol/l di topiramato, moltiplicare µg/ml per 2,95.

9 Analogamente a tutte le determinazioni di analiti, il valore di topiramato deve essere usato contestualmente alle informazioni disponibili ottenute mediante valutazioni cliniche e altre procedure diagnostiche. Codici di errore dei risultati È possibile che alcuni risultati siano associati a codici di errore. Per una descrizione di tali codici di errore, consultare il manuale d uso specifico dello strumento utilizzato. LIMITI DELLA PROCEDURA Nella popolazione generale, la presenza degli anticorpi eterofili interferenti è scarsamente frequente. Questi anticorpi possono causare autoagglutinazione del reagente con microparticelle, generando risultati erroneamente bassi che passano inosservati. Ai fini diagnostici, i risultati dell analisi devono sempre essere valutati nel contesto dell anamnesi del paziente, degli esiti degli esami e di altri risultati clinici. Consultare le sezioni RACCOLTA E TRATTAMENTO DEI CAMPIONI e CARATTERISTICHE SPECIFICHE DELLE PRESTAZIONI del presente foglio illustrativo. VALORI ATTESI Un range terapeutico per il topiramato non è stato ben definito. Alcuni rapporti nella letteratura pertinente suggeriscono un range target per le concentrazioni in equilibrio dinamico pari a 2-25 µg/ml. 3 Esiste una correlazione non uniforme tra i livelli di topiramato in circolo e la tossicità, gli eventi indesiderati e l efficacia clinica. 3 Il monitoraggio delle concentrazioni di topiramato nei pazienti è quindi giustificato. Il dosaggio delle concentrazioni di topiramato non deve costituire l unico

10 strumento per la gestione terapeutica del farmaco. Il dosaggio deve essere usato unitamente alle informazioni ottenute mediante valutazioni cliniche e altre procedure diagnostiche. Il personale medico deve monitorare attentamente i pazienti durante la fase iniziale della terapia e nel corso delle regolazioni del dosaggio. Per determinare la variazione attesa delle concentrazioni (in equilibrio dinamico) ottimali per i singoli pazienti, è possibile che sia necessario prelevare più campioni. CARATTERISTICHE SPECIFICHE DELLE PRESTAZIONI Sensibilità Limite di quantitazione (LOQ) Il LOQ del dosaggio QMS per il topiramato è definito come la concentrazione più bassa alla quale si osservano una precisione e un recupero inter-analisi accettabili (generalmente, CV 20% con recupero di ±15%). Il LOQ è stato determinato essere pari a 1,5 µg/ml. Range del dosaggio Il range del dosaggio è compreso tra 1,5 e 32,0 µg/ml. Refertare i risultati inferiori a questo range come <1,5 µg/ml. Accuratezza Una valutazione dell accuratezza in base al recupero è stata eseguita aggiungendo topiramato ad elevata purezza a siero umano negativo per topiramato. Inizialmente, è stato preparato un brodo di siero con 32,00 µg/ml circa di topiramato grazie all aggiunta gravimetrica di topiramato a siero umano. Il brodo concentrato è stato quindi gravimetricamente aggiunto a siero umano negativo per topiramato, in modo da riprodurre svariate concentrazioni di farmaco all interno del range del dosaggio. Ciascun campione è stato analizzato in triplicato su un analizzatore chimico-clinico 10

11 automatizzato. La media dei risultati calcolata è stata confrontata con la concentrazione target; è stato inoltre calcolato il recupero percentuale. I risultati sono riportati qui di seguito. Recupero % = media recuperata x100 teorica teorica (µg/ml) recuperata media (µg/ml) Recupero percentuale 32,00 32,48 101,5 24,00 24,50 102,1 16,00 16,74 104,6 8,00 8,35 104,4 6,40 6,61 103,3 3,20 3,47 108,4 2,56 2,67 104,3 1,92 2,11 109,9 1,60 1,65 103,1 1,28 1,33 103,9 Recupero percentuale medio: 104,6 Linearità Gli studi di linearità sono stati condotti diluendo un pool di sieri paziente con elevata concentrazione in modo da ottenere svariate concentrazioni all interno del range del dosaggio. Il pool di sieri paziente è stato regolato in modo da ottenere un valore dal 20 al 30% superiore rispetto al range refertabile desiderato, come consigliato in NCCLS Protocol EP6-A. 4 Le diluizioni sono state eseguite con il calibratore A QMS per il topiramato (calibratore bianco). La linearità a diluizioni specifiche è stata considerata accettabile se la differenza percentuale era di ±10% tra i valori regressi di 1 e di 2 ordine previsti. I risultati sono riportati qui di seguito. 11

12 Valore stimato (µg/ml) Fattore di diluizione Risultati (µg/ml) Risultati previsti di 1 ordine Risultati previsti di 2 ordine Differenza percentuale (criteri di accettabilità: ±10%) 35,0 0, ,57 36,76 36,78 0,04% 30,0 0, ,87 31,52 31,53 0,00% 20,0 0, ,86 21,05 21,04 0,06% 15,0 0, ,89 15,82 15,80 0,09% 10,0 0, ,54 10,58 10,57 0,10% 5,0 0,1250 5,28 5,35 5,34 0,06% 3,0 0,0750 3,11 3,25 3,25 0,02% 2,0 0,0500 2,22 2,20 2,21 0,13% 1,5 0,0375 1,68 1,68 1,68 0,25% 1,2 0,0300 1,43 1,37 1,37 0,36% Confronto tra metodi Gli studi di correlazione sono stati svolti in base a NCCLS Protocol EP9-A2. 5 I risultati del dosaggio QMS per il topiramato sono stati messi a confronto con quelli di un immunodosaggio con polarizzazione della fluorescenza disponibile in commercio. Le concentrazioni di topiramato sono risultate comprese tra 1,56 µg/ml e 30,72 µg/ml. I risultati dell analisi di regressione di Passing e Bablok 6 dello studio sono riportati qui di seguito. Pendenza 0,962 Intercetta y 0,228 Coefficiente di correlazione (R 2 ) 0,986 Numero di campioni 148 Precisione La precisione è stata determinata in base a quanto descritto in NCCLS Protocol EP5-A

13 Nello studio sono stati usati tre livelli di un controllo commerciale a base di siero umano contenente topiramato. Ciascun livello di controllo è stato analizzato in duplicato due volte al giorno per 20 giorni. Almeno due ore sono intercorse tra una sessione di analisi e quella successiva nella stessa giornata. Sono state calcolate le DS e i CV percentuali intra-analisi, tra giorni di analisi e totali. I risultati sono riportati qui di seguito. Campione N Media (µg/ml) Intra-analisi Tra giorni Totali DS CV ( %) DS CV ( %) DS CV ( %) ,94 0,08 2,77 0,06 2,10 0,12 4, ,14 0,18 1,83 0,23 2,34 0,34 3, ,69 0,82 3,23 0,73 2,87 1,14 4,44 Criteri di accettabilità: CV totale <10 % Sostanze interferenti Gli studi di interferenza sono stati svolti in base alle linee guida di NCCLS Protocol EP7-A2. 8 Concentrazioni clinicamente elevate delle seguenti sostanze potenzialmente interferenti sono state aggiunte ad aliquote di siero contenenti livelli noti di topiramato (5 e 20 µg/ml circa). Ciascun campione è stato analizzato mediante il dosaggio QMS per il topiramato, unitamente a un controllo sierico per il topiramato. Tutte le sostanze hanno esibito un errore ±10% nel rilevamento del topiramato. I risultati sono riportati qui di seguito. Sostanza interferente Acido urico Albumina Bilirubina Colesterolo interferente 30 mg/dl 12 g/dl 70 mg/dl 250 mg/ml *HAMA = anticorpi umani antimurini 13

14 Sostanza interferente Emoglobina Eparina Fattore reumatoide Gammaglobulina HAMA Tipo-1* HAMA Tipo-2* Trigliceridi interferente 1000 mg/dl 185,5 USP/mL 500 IU/mL 12 g/dl Livello umano normale Livello umano normale 825 mg/dl *HAMA = anticorpi umani antimurini Specificità La reattività crociata è stata analizzata per i metaboliti noti del topiramato. Altri farmaci regolarmente somministrati con il topiramato sono anch essi stati sottoposti ad analisi per determinare se tali composti influiscono sulla determinazione quantitativa delle concentrazioni di topiramato mediante il dosaggio QMS per il topiramato. Alti livelli di questi composti sono stati addizionati a pool di siero contenenti livelli terapeutici bassi e alti di topiramato. I campioni sono stati analizzati e le concentrazioni di topiramato dei campioni contenenti le sostanze interferenti sono state messe a confronto con quelle Metaboliti I metaboliti del topiramato sono rilevabili principalmente nell urina dei pazienti sottoposti a terapia a base di topiramato. 9,10 I metaboliti non sono tuttavia presenti nel plasma o nel siero a livelli clinicamente significativi. È improbabile che i risultati forniti da siero e plasma con il dosaggio QMS per il topiramato subiscano gli effetti del metabolismo del farmaco a base di topiramato. Il seguente metabolita è stato analizzato per rilevare l eventuale reattività crociata. 14

15 Metabolita 9-idrossitopiramato del metabolita (µg/ml) Bassa concentrazione Alta concentrazione Reattività crociata percentuale Bassa concentrazione Interferenza percentuale Alta concentrazione 4,00 19,75 14,50 18,33 2,55 8,00 22,63 12,50 44,03 4,49 32,00 15,56 18,25 137,19 30,62 Farmaci interferenti Studi del dosaggio QMS per il topiramato sono stati condotti per esaminare l eventuale effetto di composti farmaceutici comunemente somministrati sul recupero della concentrazione di topiramato. Un alta concentrazione di ciascuno dei composti farmaceutici è stata addizionata a siero umano normale contenente livelli noti di topiramato (5 e 20 µg/ml circa); i campioni così ottenuti sono stati analizzati unitamente a un controllo sierico per il topiramato. Tutti i composti hanno introdotto un errore ±10% nel rilevamento del topiramato. I risultati sono riportati qui di seguito. Composto del composto (µg/ml) Composto del composto (µg/ml) Acetozolamide 40 Etosuxamide 252 Acido acetilsalicilico 67 Famotidina 0,97 Acido salicilico 598 Felbamato 243,33 Acido valproico 100,67 Fenelzina 14,38 Alprazolam 2,0 Fenobarbitale 40 Amitriptilina 1,0 Flurazepam 17,5 Atenololo 10,33 Furosemide 3,7 Caffeina 60 Gabapentina 93 15

16 Composto del composto (µg/ml) Composto del composto (µg/ml) Carbamazepina 30 Idroclorotiazide 6,0 Clonazepam 0,18 Lamotrigina 45 Clorazepato 2,0 Levetiracetam 124 Clortalidone 64 Metisergide 5,2 Diazepam 5,1 Metoprololo 5,25 Diclorfenamide 32 Nadololo 121 Naproxen 509 Sulfanilamide 1500 Nimodipina 75 Tolbutamide 642 Nortriptilina 1,0 Verapamil 1,6 Paracetamolo 31 Vigabatrin 112 Primidone 40 Zonisamide 122 Protriptilina 1,03 Reattività crociata dei farmaci La reattività crociata dell anticorpo con ibuprofene, fenitoina e tiagabina è stata analizzata alle seguenti concentrazioni. Un alta concentrazione di ciascuno dei composti farmaceutici è stata addizionata a siero umano normale contenente livelli noti di topiramato (5 e 20 µg/ml circa); i campioni così ottenuti sono stati analizzati unitamente a un controllo sierico per il topiramato. I risultati sono riportati qui di seguito. 16

17 Composto (µg/ml) Bassa concentrazione Alta concentrazione Reattività crociata percentuale Bassa concentrazione Interferenza percentuale Alta concentrazione Fenitoina 20 5,48 2,25 28,14 4,86 Ibuprofene 500 0,09 0,19 11,38 4,39 Tiagabina 250 0,49-0,50 29,60 5,35 Se il paziente è sottoposto a terapia a base di uno qualsiasi dei composti sopra elencati, è necessario interpretare con cautela i risultati del dosaggio QMS per il topiramato. 17

18 BIBLIOGRAFIA OrthoMcNeil Pharmaceutical, Inc. Topamax monograph, Raritan, NJ Revision Date August Dasgupta A, Dean R, Saldana S. et.al. Absorption of therapeutic drugs by barrier gels in serum separator blood collection tubes. Am J Clin Pathol 1994:101(4): Johannessen SI, Battino, D, Berry DJ. et.al. Therapeutic Drug Monitoring of the Newer Antiepileptic Drugs. Ther Drug Monit. 2003;(25): Tholen DW, Kroll M, Astles, JR et.al. Evaluation of the linearity of Quantitative Measurement Procedures: A Statistical Approach; Approved Guideline (EP6-A). Wayne, PA. The National Committee for Clinical Laboratory Standards, Krouwer, JS, Tholen DW, Garber, CC, et.al. Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples; Approved Guideline-Second Edition (EP9-A2). Wayne, PA: The National Committee for Clinical Laboratory Standards, Bablok W, Passing H, Bender R, Schneider B. A general regression procedure for method transformation. Application of linear regression procedures for method comparison studies in clinical chemistry. Part III. J. Clin Chem Clin Biochem 1988;26(11): Tholen DW, Kallner A, Kennedy JW, et.al. Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods; Approved Guideline-Second Edition (EP5-A2). Wayne, PA: The National Committee for Clinical Laboratory Standards, McEnroe RJ, Burritt MF, Powers DM, et.al. Interference Testing in Clinical Chemistry: Approved Guideline-Second Edition (EP7-A2). Wayne, PA: The National Committee for Clinical Laboratory Standards, Britzi M, Sobak S, Isoherranen N. et.al. Analysis of Topiramate and its Metabolites in Plasma and Urine of Healthy Subjects and Patients with Epilepsy by Use of a Novel Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Assay. Ther.Drug. Monit. 2003;(25):

19 10. Britzi M, Perucca E, Soback S. et.al. Pharmacokinetic and Metabolic Investigation of Topiramate Dispostion in Healthy Subjects in the Absence and in the Presence of Enzyme Induction by Carbamazepine. Epilepsis 2005;(46):

20 MARCHI DI FABBRICA Tutti i marchi sono di proprietà di Thermo Fisher Scientific Inc. e delle relative società controllate. Microgenics Corporation Fremont Blvd. Fremont, CA USA 20