LA SPETTROSCOPIA UV-VIS

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1 LA SPETTROSCOPIA UV-VIS Per spettroscopia si intende in generale la misura e lo studio di uno spettro elettromagnetico. Le tecniche spettroscopiche sono basate sullo scambio di energia che si verifica fra l energia radiante e la materia. La spettroscopia di assorbimento è interessata ai fenomeni di assorbimento delle radiazioni luminose della regione dello spettro elettromagnetico appartenenti al campo del visibile e del vicino ultravioletto. L assorbimento di questi tipi di radiazioni da parte delle molecole è in grado di produrre delle transizioni energetiche degli elettroni esterni della molecole, sia impegnati che non impegnati in un legame. Gli elettroni π sono 'meno legati' e risultano perciò più facilmente eccitabili rispetto ai σ; Gli spettri nel visibile sono quindi dovuti agli elettroni di legame π più o meno ampiamente delocalizzati Per cromoforo un raggruppamento chimico insaturo responsabile di un assorbimento situato nella regione delle lunghezze d'onda comprese tra 180 e 1000 nm

2 LA SPETTROSCOPIA UV-VIS Lo strumento che permette di misurare le proprietà della luce in funzione della sua lunghezza d'onda prende il nome di SPETTROMETRO. La maggioranza degli spettrometri sfrutta il principio della rifrazione per decomporre la radiazione luminosa nelle sue lunghezze d'onda e misurarne l'intensità con un detector. Uno spettrometro è composto da: Uno specchio ottico Un elemento disperdente (prisma o reticolo di diffrazione) Un detector

3 LA SPETTROSCOPIA UV-VIS Per effettuare analisi qualitative si fa uso di raggi policromatici a spettro continuo Le singole radiazioni monocromatiche di tale raggio passano attraverso la sostanza in esame, la quale assorbirà in modo diverso, cioè con diversa intensità, le diverse radiazioni. Riportando i valori registrati in un grafico lunghezza d'onda-assorbimento, si ottiene lo spettro di assorbimento della sostanza esaminata. Per il fatto che ogni sostanza ha il suo spettro di assorbimento, l'esame di tali spettri ne permette l'identificazione.

4 SPETTROFOTOMETRIA Per effettuare analisi quantitative si fa uso di particolari spettrometri detti SPETTROFOTOMETRI Cosa si misura con uno spettrofotometro? Uno spettrofotometro è una macchina ottica che misura la quantità di energia luminosa che viene trasmessa da una sostanza colpita da radiazioni luminose di diversa lunghezza d onda. L energia luminosa trasmessa si può misurare come Trasmittanza: il rapporto tra l energia della luce trasmessa (I) e della luce incidente (Io). La percentuale di trasmittanza si ottiene moltiplicando per 100 questo rapporto:

5 Strumentazione STRUTTURA GENERALE DI UNO SPETTROFOTOMETRO (UV-VISIBILE O IR) 1) SORGENTE DI RADIAZIONE 2) SELEZIONATORE DI LUNGHEZZE D ONDA O MONOCROMATORE 3) CELLA 4) RIVELATORE

6 Sorgenti Le lampade usate possono emettere nel campo del: Visibile: si usano lampade a filamento di tungsteno, coprono l intervallo da 330 nm a 930 nm; altrimenti si usano lampade al quarzo-iodio o lampade tungsteno-alogeno che forniscono energie più elevate nell intervallo nm, hanno anche maggior durata. UV: si usano lampade al deuterio, costituite da una lampada ad arco, in cui il bulbo di quarzo è riempito di deuterio che, eccitato dalle scariche elettriche, emette uno spettro continuo al di sotto dei 400 nm.

7 MONOCROMATORI (o selettori di lunghezza d onda) Tutti i monocromatori contengono: Una fenditura d entrata Una lente di collimazione Un dispositivo di dispersione (un prisma o un reticolo) Una lente di focalizzazione Una fenditura d uscita Radiazioni policromatiche entrano nel monocromatore attraverso la fenditura d'entrata. Il raggio viene allineato e colpisce il reticolo di diffrazione (reflecting grating) con un determinato angolo. Il raggio viene quindi scomposto nelle lunghezze d onda componenti. Muovendo l elemento di dispersione (un reticolo o un prisma) o la fenditura di uscita, si seleziona in uscita una particolare lunghezza d onda.

8 MONOCROMATORI Esistono 2 tipologie di monocromatori FILTRI: assorbono una parte delle componenti spettrali della radiazione incidente e ne trasmettono una gamma più o meno ampia. Ne esistono di più tipi - F. ad assorbimento: hanno una banda spettrale di circa 250 nm e una trasmittanza di circa il 35%. Combinando insieme più filtri, si può restringere la banda passante fino a nm. Questi filtri non sono usati nell UV perché sono di vetro. - F. a interferenza e di scattering: forniscono migliori prestazioni: bande passanti di nm e trasmissione di circa il 50% dell energia. Hanno il difetto di costare molto. ELEMENTI DISPERDENTI prismi: Il prisma è in grado di disperdere le radiazioni con diversa λ grazie al fenomeno della rifrazione: quando un raggio di luce passa da un mezzo ad un altro subisce una deviazione di un angolo inversamente proporzionale alla λ della radiazione (cioè, radiazioni con diversa λ subiscono diversa deviazione). Reticoli: svolgono la stessa funzione del prisma, ma il loro funzionamento è basato sulla riflessione. Sono costituiti da serie di solchi o fenditure parallele tracciati su una superficie lucida a distanza ravvicinata: il fenomeno è quello che si osserva guardando obliquamente la superficie di un CD.

9 RIVELATORE Il tubo fotomoltiplicatore è un rivelatore comunemente usato nella spettroscopia UV- Vis. È costituito da un catodo fotoemissivo (che emette elettroni quando colpiti dai fotoni di una radiazione), vari dinodi (che emettono una moltitudine di elettroni per ogni elettrone che li colpisce) ed un anodo. Un fotone che penetra all'interno del tubo colpisce il catodo provocando l'emissione di diversi elettroni. Questi elettroni vengono accelerati verso il secondo dinodo, per produrre più elettroni che vengono accelerati verso il terzo dinodo e così via. Alla fine, gli elettroni vengono convogliati verso l'anodo. Sezione di un tubo fotomoltiplicatore

10 Tipi di spettrofotometro S. monoraggio S. a doppio raggio

11 LA SPETTROSCOPIA UV-VIS La legge di Lambert Bouguer- Beer: chi sono costoro? - Lambert, Johann Heinrich ( ), matematico, fisico e astronomo alsaziano. Scopritore della relazione tra trasmittanza e cammino ottico, ma più famoso per aver dimostrato che è irrazionale. Condivide la scoperta sul cammino ottico con - Bouguer, Pierre ( ), matematico e astronomo francese. Ha dimostrato la legge della riduzione dell intensità della radiazione con l inverso del quadrato della distanza nel vuoto e la legge di decadimento esponenziale con la distanza entro un mezzo assorbente (1729), per le quali può essere considerato il padre della fotometria. - Beer, Wilhelm ( ), banchiere tedesco con l hobby dell astronomia. Ha dimostrato la relazione di proporzionalità tra assorbanza e concentrazione. Celebre per aver disegnato la prima mappa dettagliata dei crateri della Luna (1836) e anche di Marte.

12 LA SPETTROSCOPIA UV-VIS La legge di Lambert Bouguer- Beer: I = Io* e -kλd 1) I/Io = Trasmittanza 2) Per le soluzioni k λ = a*c da cui ln I/Io = - a*c*d 3) 2.303*log T = - a*c*d o meglio log T = -ε*c*d 4) Assorbanza o Densità Ottica = log 1/T oppure -log T Quindi A = ε*c*d

13 A = ε*c*d dove: A = assorbanza del campione ε = coefficiente di estinzione molare, specifico per ogni sostanza (l*mol -1 *cm -1 ) d = cammino ottico (cm) c = concentrazioni (mol / l) Da notare che: - L'Assorbanza è adimensionale!!! (si misura in U.A) - Il coefficiente di estinzione molare ε indica il valore di assorbanza del composto in esame quando [d = 1] cm e [ c = 1 ], e il suo valore dipende: dalla lunghezza d onda della radiazione assorbita dalla natura del solvente dal ph dalla specie chimica che assorbe

14 A = ε c d è l equazione che descrive una retta passante per l origine dove per d=1cm il coefficiente angolare corrisponde proprio a ε: A basse concentrazioni Ad alte concentrazioni Circa le cause che provocano queste deviazioni, l'ipotesi più corretta è quella che all'aumentare della concentrazione aumenta il numero di particelle in soluzione ed aumenta anche il numero di urti fra queste; le forze interioniche e/o intermolecolari aumentano e possono formarsi molecole o aggregati di particelle più complesse, diverse per struttura da quelle in esame, per cui si potrà avere uno spostamento del massimo di assorbimento. Per questo motivo, le condizioni di lavoro usuali prevedono che le soluzioni siano sempre diluite

15 ESTRAZIONE E DOSAGGIO DEI PIGMENTI CLOROFILLIANI Principio del metodo (da Metodologie di studio del Plancton marino, ISPRA 56/2010) Il metodo per la stima quantitativa dei pigmenti clorofilliani consiste nel concentrare il particellato sospeso contenente pigmenti liposolubili su di un filtro in fibra di vetro eseguita in presenza di una leggera depressione. I pigmenti vengono estratti a freddo dalle cellule triturando ed omogeneizzando i filtri immersi in un solvente acetonico. La concentrazione dei pigmenti nell'estratto viene stimata per via spettrofotometrica.

16 PROCEDURA Filtrazione di un volume noto (0.5-7L) d'acqua su filtri di fibra di vetro Whatman GF/F (25 o 47 mm di diametro) utilizzando una pompa da vuoto, assicurandosi che la pressione sia di circa 150 mmhg, per evitare la rottura delle cellule vegetali ed il conseguente passaggio dei pigmenti attraverso il filtro. Conservazione dei filtri in provette da 10 ml in 5mL di Acetone disidratato 100% (inibisce le clorofillasi) al buio ad una temperatura compresa tra -20 e +4 C (i pigmenti sono fotolabili e termolabili) Estrazione dei pigmenti : triturare i filtri con un pestello ed aggiungere un volume di Acetone 80% pari al volume di Acetone 100% con lo scopo di ottenere un estratto al 90%. Riporre i campioni ad una temperatura di circa 4 C per 24h per completare l'estrazione. Centrifugare le provette chiuse per 15 minuti a 4000 giri/min in modo da separare il filtro dalla soluzione. Prelevare il sopranatante mediante pipetta e riempire la cuvette per la lettura allo spettrofotometro. Lettura dell'estratto allo spettrofotometro.

17 LETTURA ALLO SPETTROFOTOMETRO E CALCOLI 3 metodi per la stima dei pigmenti fotosintetici: - metodo della stima della clorofilla a con feopigmenti (Jeffrey & Humphrey, 1975) - metodo per la stima delle clorofille a,b e c ( Lorenzen & Jeffrey, 1980) - metodo per la stima separata della clorofilla a e dei feopigmenti (Lorenzen, 1967)

18 STIMA DELLA CONCENTRAZIONE DELLA CHL A (Jeffrey & Humphrey, 1975) Assunti - λmax di assorbimento nel rosso = 664nm - ε = cm -1 g -1 dm 3 Formula Chl a (μg/dm 3 ) = {[A (664s)-A(664b)]-[A(750s)-A(750b)]}*v*10 6 /( ε*d*v) -volumi espressi in cm 3 (v = dell'estratto, V= del filtrato) -d= cammino ottico in cm -ε = coeff di estinzione molare (cm -1 *g -1 *dm 3 )

19 STIMA DELLA CONCENTRAZIONE DELLE CHL a, b, c (Lorenzen & Jeffrey, 1980) Assunti - deteminare l'assorbanza netta dell'estratto alle λλ di 630, 647, 664 e 750 nm [A (λs)-a(λb)]-[a(750s)-a(750b)] Formule Chl a (μg/dm 3 ) = [11.85*A(664)-1.54*A(647)-0.08*(630)]*v*10 3 /(d*v) Chl b (μg/dm 3 ) = [-5.43*A(664)+21.03*A(647)-2.66*(630)]*v*10 3 /(d*v) Chl c1+c2 (μg/dm 3 ) = [-1.67*A(664)-7.6*A(647)+24.52*(630)]*v*10 3 /(d*v) -se chl b e c sono presenti a basse concentrazioni i valori vengono negativi

20 STIMA DELLA CONCENTRAZIONE DELLA CHL A E DEI FEO (Lorenzen, 1967) Assunti - si considera il rapporto tra ε chl a e feofitina a - bisogna acidificare il campione con mm 3 di HCl (0.66 mol/dm 3 ) ogni 5cm 3 di estratto dopo aver letto a 665 e 750 nm, per il calcolo dell'assorbanza netta a 665 nm prima e dopo l'acidificazione: Formula [A (665s)-A(665b)]-[A(750s)-A(750b)] Chl a (μg/dm 3 ) =26.7*[A(665o)-A(665a)]*v*10 3 /(d*v) feopigm. (μg/dm 3 ) =26.7[1.7*A(665a)-A(665o)]*v*10 3 /(d*v)