Piero Cappelletti Rita De Rosa Donatella Poz Margherita Morandini

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1 Riv Ital Med Lab (2013) 9:61 78 DOI /s ARTICOLO ORIGINALE La Microscopia Intelligente Automatizzata (MIA) è una risposta agli obiettivi clinici dell esame urine? Una valutazione analitica, diagnostica e organizzativa di iq200 Iris Is Automated Intelligent Microscopy (AIM) an answer to the medical needs of the urinalysis? iq200 Iris in urine sediment testing: diagnostic and workflow improvements Piero Cappelletti Rita De Rosa Donatella Poz Margherita Morandini Ricevuto: 4 settembre 2012 / Accettato: 12 novembre 2012 / Pubblicato online: 21 giugno 2013 Springer-Verlag Italia 2013 Riassunto Premesse. L esame del sedimento urinario è ancora oggi essenziale per la diagnosi, prognosi e monitoraggio delle malattie renali e delle vie urinarie. Negli ultimi due decenni sono stati proposti strumenti per la lettura automatizzata del sedimento: la citofluorimetria dedicata (UFC) e la microscopia automatizzata (MIA). Abbiamo valutato prima dell introduzione in routine (valutazione di base) e dopo cinque anni di attività (valutazione di routine) lo strumento MIA iq200 Iris. Lo scopo del presente lavoro è illustrare la performance analitica e l accuratezza diagnostica dell analizzatore di sedimenti urinari Iris iq200 e il suo ruolo nell organizzazione del Laboratorio per favorire una strategia diagnostica efficace ed efficiente. Metodi. Nella valutazione di base, abbiamo esaminato precisione inter- e intra-serie, linearità, carryover, accuratezza per confronto con metodo di riferimento ISLH e urocoltura su 153 campioni selezionati. Nella valutazione di routine abbiamo esaminato la sensibilità clinica come numero di referti positivi, numero di eritrociturie e numero di cilindrurie P. Cappelletti (B) IRCCS CRO Aviano, Via Franco Gallini 2, Aviano, PN, Italy piero.cappelletti@cro.it R. De Rosa Microbiologia e Virologia, AOSMA, Pordenone, Italy D. Poz Laboratorio Analisi Cliniche e Microbiologia, ASS4-Medio Friuli, S. Daniele del Friuli, UD, Italy M. Morandini Patologia Clinica, AOSMA, Pordenone, Italy segnalate prima e dopo l introduzione di iq200 e il potere come screening di infezioni urinarie (UTI) contro urocoltura su un campione di 253 pazienti con formula comprendente i risultati iq200 batteri e piccole particelle (ASP) e quindi su un campione di 7615 con formula (AND/OR) comprendente ASP e leucociti (WBC) e con il risultato della revisione umana su iq200. In entrambe le valutazioni abbiamo misurato i flussi operativi in una settimana (285 campioni/die) e in un mese (350 campioni/die), rispettivamente. Risultati. Nella valutazione di base, iq200 ha mostrato precisione leggermente inferiore a UFC, ma migliore o decisamente migliore verso microscopia ISLH e tradizionale (<15% ai limiti decisionali), linearità fin oltre le 2000 cellule/µl, carryover insignificante, accuratezza per confronto molto buona per RBC (r 0,9335), WBC (r 0,9987), cellule epiteliali squamose (r 0,9544), buona per cellule epiteliali non squamose (r 0,7642) e cilindri ialini (r 0,7210), meno buona per cilindri patologici (r 0,3365). Il valore predittivo negativo (NPV) della formula batteri + ASP /µL verso urocoltura (CFU /mL) è stato 96,4%. Nella valutazione in routine, si è evidenziato un aumento del 18% di segnalazioni patologiche sui referti urinari, prevalentemente a carico di RBC (per la metà al di sopra della soglia di patologia) e in parte a carico dei cilindri, la cui segnalazione è triplicata (da 1,5% a 4,5%) in netta prevalenza per cilindri ialini, anche se i cilindri patologici aumentano del 7%. La valutazione come screening di UTI ha mostrato per la formula ASP 8000/µL o WBC 20/µL un NPV del 98,5% e per i batteri rivisti da operatore umano un NPV del 99,7% verso urocoltura (CFU /mL). La valutazione dei flussi operativi ha mostrato la necessità di diluizione di meno del 2% dei campioni e di controllo mi-

2 62 Riv Ital Med Lab (2013) 9:61 78 croscopico di meno dell 1%. La necessità di validazione a video è stata del 33%, con i criteri di revisione patologici + anomali (27% dopo ottimizzazione degli stessi). Il risparmio di tempo è stato di 60 minuti (14%) con 1 iq200 e di 160 minuti (37,5%) con 2 iq200 su una routine di 350 campioni/die. Conclusioni. iq200 è uno strumento che si inserisce in strategie diagnostiche combinate o selettive con buone performance analitiche e ottima sensibilità clinica per malattie renali e UTI, in particolare dopo revisione umana, migliorando l efficacia clinica (segnalazione di patologia, accurato monitoraggio) e l efficienza dei flussi di lavoro. La possibilità della revisione a video delle microfotografie, quando è più conveniente ai flussi operativi, e la sua facilità, oltre agli effetti positivi su accuratezza ed efficienza, sono condizioni per approfondimenti, confronto tra operatori e insegnamento della morfologia urinaria. Parole chiave Esame delle urine Sedimento urinario Automazione Microscopia Summary Background. Urine sediment analysis remains essential for diagnosis, prognosis, and follow-up of patients with renal and urinary tract diseases. Given the large volume of requests in daily routine of most laboratories, automated systems for sediment analysis were designed and commercialized. The systems currently available are based on two different technologies: urinary flow cytometry (UFC) and automated intelligent microscopy (AIM). We evaluated Iris iq200 (AIM) before (basic evaluation) and after (routine evaluation) its introduction in the laboratory. The aim was to show the analytical performances and the diagnostic accuracy of Iris iq200 and its role for optimizing diagnostic strategy in urinary sediment analysis. Methods. The basic evaluation measured between- and within-run imprecision, linearity, carryover, and accuracy as comparison versus reference methods (ISLH and microbiologic culture) in 153 selected samples. The routine evaluation determined clinical sensitivity for renal diseases and urinary infections (UTIs) as number of pathological results, number of RBCs, number of casts before and after introduction of iq200 and as NPV (negative predictive value) of some formulas ( bacteria + all small particles [ASP] 12,000 µl on 253 samples; ASP AND/OR WBC and bacteria after human validation on 7615 samples) versus microbiologic culture. In both evaluations, we analyzed workflow and TATs. Results. In basic evaluation, iq200 showed precision less good than UFC but much better than microscopy (<15% at diagnostic limits), linearity up to 2000 particles/µl, negligible carryover, and good comparison for RBCs (r ), WBC (r ), squamous epithelial cells (0.9544), less good for non squamous epithelial cells (r ) and hyaline casts (0.7210) and for non hyaline casts (0.3365). NPV for formula bacteria + ASP 12,000/µL versus culture (CFU 100,000/mL) was 96.4%. In routine evaluation, we noted an increase of pathological results (+18%) afterintroduction of iq200, mainly for RBCs (half over the diagnostic limit) and hyaline casts (from 1.5% to 4.5%). The pathologic casts showed an increase of 7%. Versus microbiologic culture (CFU 100,000/mL), ASP AND/OR WBC showed NPV 98.5%, and bacteria after human validation NPV 99.7%. The analysis of workflow demonstrated less than 2% of dilutions and less than 1% of microscopic controls. 33% (27% after optimization) of samples needed verification, by revision criteria pathologic and anomalous results. In a routine of 350 samples per day, the saved time was 60 min and 160 min with 1 or 2 iq200, respectively. Conclusions. iq200 can used in combined or selective diagnostic strategy for urinary sediment with improvements in diagnostic efficacy (more pathologic results; precise and accurate follow-up; good UTIs screening) and in efficiency (reduced workload and TATs). Moreover, iq200 allows studying, teaching, and inter-observers consultation about urinary morphology. Keywords Urinalysis Urine particles Automation Microscopy Introduzione L esame delle urine è stato il primo nella storia della medicina e ancora oggi, nella strutturazione assunta circa due secoli fa (parte chimico-fisica e microscopia del sedimento), continua a essere un importante strumento per informazioni diagnostiche [1]. L esame delle urine è uno dei più richiesti in tutto il mondo, rappresentando tra un terzo e un quarto di tutti i campioni che arrivano giornalmente nei maggiori laboratori [2]. In Italia rappresenta il decimo esame singolo ( 3% di tutti i test richiesti), con un numero stimato di test/anno di circa 40 milioni [3]. L analisi del sedimento urinario rimane essenziale per la diagnosi, prognosi e monitoraggio dei pazienti con malattie renali e della vie urinarie [4 8]. Sfortunatamente la microscopia tradizionale del sedimento urinario è faticosa, richiede tempo ed esperienza, è imprecisa e dipende dalla variabilità degli osservatori [7, 9]. Per migliorarne la standardizzazione, autori [10] e Associazioni internazionali [7, 11] hanno suggerito linee guida. In ogni caso, dato l alto numero di richieste giornaliere, specialmente in quelle realtà come l Italia che prevedono l esame del sedimento per tutti gli esami delle urine completi richiesti, da qualche decennio si è intrapresa la via dell automazione del sedimento urinario. Oggi in Italia si può stimare che circa il 50% dei sedimenti urinari (pari a più di 20 milioni di esami/anno) venga eseguito in automazione [3].

3 Riv Ital Med Lab (2013) 9: Gli strumenti per l analisi automatizzata del sedimento urinario oggi disponibili sul mercato sono basati su due differenti tecnologie: la citofluorimetria urinaria (urinary flow cytometry, UFC) e l analisi d immagine (automated intelligent microscopy, AIM). La prima classifica i sedimenti organizzati sulla base dell intensità di fluorescenza dopo colorazione con fluorofori, dell impedenza elettrica e della diffusione della luce (forward angle light scatter) ed è stata inventata alla metà degli anni 90 del secolo scorso. Una vasta letteratura ha valutato gli strumenti più conosciuti FC della TOA Medical Electronics, Kobe, Giappone: UF 100 [12 14] e la nuova versione UF 1000i [15 17]. Il primo strumento per l analisi automatizzata del sedimento urinario basato sul riconoscimento d immagine è stato prodotto alla metà degli anni 80 del secolo scorso (Iris Diagnostics Inc., Chatsworth, CA, USA) [18] e utilizza una videocamera e una luce stroboscopica per individuare e selezionare le particelle sulla base di criteri stabiliti all interno di un flusso planare di urina non centrifugata. Nei primi anni 2000 è stata introdotta una nuova generazione di strumenti (iq200 ) adeguati alle necessità dei laboratori a grande routine [19]. Oltre a innovazioni fluidiche, esso è dotato di un software neurale Auto-Particle Recognition (APR) che classifica le particelle sulla base di parametri multipli come dimensioni, forma, contrasto e contenuto interno. Più recentemente è stato proposto un altro sistema di analisi d immagine (SediMAX, 77Elektronika, Budapest, Ungheria), che utilizza urine centrifugate e l analisi di campi microscopici (15 immagini fotografiche), piuttosto che di cellule singole, per classificare i sedimenti urinari [20, 21]. Lo scopo del presente lavoro è illustrare la performance analitica e l accuratezza diagnostica dell analizzatore di sedimenti urinari Iris iq200 e il suo ruolo nell organizzazione del Laboratorio per favorire una strategia diagnostica efficace ed efficiente. In primo luogo abbiamo valutato iq200 prima della sua eventuale introduzione nel Laboratorio sotto il profilo analitico, diagnostico e organizzativo (valutazione di base); quindi, dopo 5 anni di impiego, abbiamo valutato il suo impatto diagnostico e organizzativo sulla routine dell esame delle urine del Laboratorio (valutazione in routine). Materiali e metodi Iris iq200 Un millilitro di urina nativa non centrifugata e ben mescolata viene avviato a un flusso planare che orienta e allinea idrodinamicamente le cellule e i sedimenti organizzati sul piano focale di un microscopio automatizzato. Una videocamera CCD (charged coupling device) cattura 500 immagini di ciascun campione, durante i colpi di flash di una lampada stroboscopica. Ciascuna immagine è letta da APR, che classifica i sedimenti sulla base di dimensioni, forma, contrasto e contenuto in 12 categorie (RBC, WBC, WBC clumps, hyaline casts, unclassified casts, squamous epithelial cells, non-squamous epithelial cells, bacteria, yeasts, crystals, mucus e sperm). La concentrazionedeglielementiè calcolata utilizzando il numero di immagini e il volume esaminato. Le soglie predeterminate dall utilizzatore consentono il rilascio automatico dei risultati oppure il loro blocco per una revisione che avviene direttamente a video sulle immagini immagazzinate e che consente riclassificazioni e sub-classificazioni fino a 26 sub-categorie per le categorie unclassified casts, crystals, non-squamous cells, yeasts e other [19]. iq200 valutato in letteratura è solitamente il modello a cadenza analitica 60 campioni per ora e con la versione software 1.0 o 1.1 [2, 19, 22 26], talora in confronto con altri analizzatori, strisce reattive e microscopia tradizionale [21, 27 30]. Ora Iris Diagnostics produce iq200 SPRINT (101 campioni/h), iq200 SELECT (40 campioni/h) e iq200 ELITE (70 campioni/h) [31]. Esame chimico-fisico L esame chimico-fisico è stato eseguito con l analizzatore per strisce reattive Aution MAX AX4280 (Menarini Diagnostics, Firenze, Italia), valutato precedentemente [32], che processa 226 campioni/h. Microscopia ottica Nella nostra routine un campione di 10 ml di urina è centrifugato per 5 minuti a 1500 rpm; il sopranatante è risospeso in un volume di 0,5 ml; una goccia è posta in una camera di conta di plastica a volume totale predeterminato (37 µl) ed esaminata a piccolo ingrandimento (100, low power field, lpf) e a ingrandimento maggiore (400, high power field, hpf). I sedimenti sono riportati semi-quantitativamente per hpf. Il tempo intercorrente dalla minzione alla lettura microscopica di solito non supera 4 5 ore. I campioni non contengono additivi o conservanti. Alcune osservazioni morfologiche considerate dalle European Urinalysis Guidelines di livello avanzato [7], come il dimorfismo eritrocitario, la cristalluria o l eosinofiluria, sono eseguite solo su diretta e specifica richiesta del clinico. Per la valutazione base di iq200, prima della sua introduzione in Laboratorio, abbiamo utilizzato il metodo di riferimento ISLH Recommended Reference Procedure [33], che impone l uso di campioni freschi (entro 2 ore dall emissione), un apparato standardizzato con una camera Fuchs- Rosenthal e lettura in contrasto di fase, una conta adeguata (50 eventi per le particelle rare, 200 eventi per quelle non rare) in più camere se necessario, almeno 3 osservatori indipendenti.

4 64 Riv Ital Med Lab (2013) 9:61 78 Metodi statistici Tenuto conto dell oggetto morfologico dell analisi (cellule e sedimenti organizzati), sono stati applicati metodi statistici suggeriti per la valutazione delle categorie morfologiche del sangue circolante dal NCCLS H20-A [34] per la determinazione dell imprecisione e della sensibilità diagnostica. Per l inaccuratezza della conta è stato utilizzato il metodo di Pearson e quello della regressione lineare (software Analyse-it). Per la valutazione della linearità e del carryover sono stati utilizzati i metodi statistici proposti, rispettivamente, dal NCCLS EP6-A [35] e da Broughton et al [36]. Per la definizione dei limiti decisionali dei risultati utilizzati per l accuratezza diagnostica per il referto batteri come screening di infezione urinaria (urinary tract infection, UTI) è stata utilizzata l analisi delle curve ROC (receiver operating characteristics)[37]. Studio I (valutazione base di iq200) Performance analitica L imprecisione a breve termine (within-run, WR)ealungo termine (between-run, BR) di iq200 sono state misurate secondo le raccomandazioni del NCCLS H20-A [34], utilizzando campioni freschi contenenti concentrazioni diagnostiche di RBC e WBC ripetuti 20 volte nella giornata (WR) e iq Control High analizzati 2 volte al giorno per 20 giorni (BR). Inoltre, è stata valutata l imprecisione totale nei 153 campioni selezionati per la valutazione di accuratezza (vedi oltre), misurandoli 10 volte nella giornata. La linearità è stata misurata con diluizioni scalari di campioni ad alta concentrazione di RBC ( µl) e WBC ( µl) in triplicato [36]. La linearità di altre particelle [per esempio cellule epiteliali squamose (squamous epithelial cells, SqEpCs)] non è stata eseguita per carenza di campioni con adeguate concentrazioni. Il carryover è stato determinato contando una tripletta di un pool negativo subito dopo una tripletta di un campione contenente 6132/µL RBC per 5 volte nella giornata [35]. Accuratezza diagnostica Un primo set di 102 campioni urinari di pazienti interni ed esterni, scelti per rappresentatività di patologia tra 494 pazienti con prima o seconda urina della mattina eliminando urine diluite (PS < 1,010) e alcaline (ph > 7,5) per la possibile lisi di eritrociti e leucociti, è stato analizzato con iq200 e con il metodo di riferimento ISLH [32]. L inaccuratezza per confronto è stata valutata mediante l analisi di regressione lineare (r 2, intercetta, pendenza e p)[38]. Successivamente, un secondo set di 153 campioni urinari selezionati è stato esaminato con iq200 e con il metodo di riferimento ISLH [33], utilizzando 2 osservatori indipendenti in 2 laboratori indipendenti [39]. L accuratezza come confronto con ISLH è stata determinata con statistica di Pearson. L accuratezza diagnostica (sensibilità clinica) come sensibilità, specificità, concordanza, ratio dei falsi positivi (FP), ratio dei falsi negativi (FN), valore predittivo positivo (PPV), valore predittivo negativo (NPV) secondo il protocollo H20-A [34]. Questi campioni sono stati utilizzati anche per determinare l imprecisione totale dei diversi sedimenti patologici (vedi sopra). Per valutare la performance di iq200 come screening di infezione urinaria (urinary tract infections, UTI), sono stati esaminati 103 campioni provenienti dal Laboratorio di Microbiologia e Virologia e confrontati con i risultati delle uroculture. Le culture sono state ottenute inoculando 1 µl di urine in una piastra di agar-cled (Cystine-Lactose Electrolyte Deficient) e agar-cna (Colistin-Nalidixic Acid + 5% sheep blood) e incubate a 37 C per una notte. La quantificazione delle colonie in CFU/mL è stata fatta contando visivamente il numero delle colonie e moltiplicandolo per il fattore di diluizione. Il livello decisionale per la positività è stato posto a >10 5 CFU/mL. iq200 è stato considerato positivo per batteri sulla base della positività dei risultati strumentali bacteria e all small particles (ASP) > /µL. Praticabilità Per testare la praticabilità è stata analizzata una settimana di routine (media giornaliera di campioni n. 285), misurando la cadenza oraria effettiva (campioni/h) e il numero di campioni richiedenti diluizione. Sono stati altresì determinati il numero e le caratteristiche dei campioni da rivedere e il numero dei controlli microscopici. Studio II (valutazione in routine del sistema iq ) Nel nostro Laboratorio, l introduzione di iq200 SPRINT si è accompagnata con quella del sistema gestionale Uromante (oggi iware della Instrumentation Laboratory, Milano, Italia) che, tramite il collegamento bidirezionale tra gli strumenti Aution Max e iq200 e il LIS, permette la completa gestione dell esame delle urine ( sistema iq ). I flussi operativi prevedono: caricamento dei rack campioni e processazione su Aution Max; Uromante riceve informazioni sul campione; trasferimento dei rack su iq200 che richiede al gestionale informazioni anche sui risultati dell esame chimico; una prima revisione video avviene su iq200 per i campioni bloccati prima del passaggio a Uromante in base a soglie discriminanti scelte dall operatore; i risultati vengono poi inviati alla refertazione, a meno che non soddisfino le regole di validazione impostate su Uromante. I campioni bloccati possono essere rivisti a video o al microscopio. Le soglie di revisione su iq200 SPRINT sono RBC > 18/µL, WBC > 20/µL, SqEpCs > 28/µL, BACT > 40/µL;

5 Riv Ital Med Lab (2013) 9: i campioni con presenza di cellule epiteliali non squamose (nsqepc), miceti, cilindri, spermatozoi, cristalli e altri allarmi (compresi artefatti e ASP > 8000/µL) sono sempre sottoposti a revisione. Le regole di validazione su Uromante riguardano principalmente le discrepanze tra esame chimico e microscopico. Cinque anni dopo l introduzione nel Laboratorio abbiamo valutato il sistema iq per la sua sensibilità diagnostica nelle malattie renali, come screening nelle UTI e per l impatto sui flussi di lavoro. Sensibilità diagnostica nelle malattie renali e delle vie urinarie Per valutare la performance diagnostica del sistema iq nelle malattie del rene e delle vie urinarie abbiamo comparato i risultati dell esame del sedimento urinario di 6 mesi (da gennaio a giugno) prima e dopo l introduzione del sistema, scegliendo come indicatori il numero totale di commenti e le due anomalie urinarie più significative nelle malattie renali (cilindri e RBC). Il mix di popolazione considerato, stabile sia per provenienza (interni/esterni) sia per prevalenza di patologia, e la numerosità del campione esaminato (circa urine per semestre) consentono il confronto tra i due gruppi. Screening di UTI Per valutare iq200 come screening di UTI, in un primo studio 235 campioni di urine di pazienti ambulatoriali e ospedalizzati con sospetta UTI, pervenuti al Laboratorio con richiesta di esame colturale, sono stati esaminati con i sistemi iq200 e UF 100. Per ciascun campione è stato valutato per UF 100 il numero di batteri e di WBC/µL e per iq200 il numero di elementi di piccole dimensioni (ASP) e l allarme semiquantitativo batteri. Su ogni campione è stata eseguita la semina con ansa calibrata su agar-cna e agar-cled ed eventuale identificazione del germe isolato con il sistema Vitek della biomérieux, Firenze, Italia. In un secondo studio abbiamo esaminato 7615 campioni consecutivi di urine di interni ed esterni, con richiesta di esame delle urine completo e di urocultura, all iq200 e con semina in piastra per cultura batterica (vedi sopra). Le correlazioni tra le urocolture positive 10 5 CFU/mL come metodo di riferimento e i risultati di iq200 WBC e ASP a 3 cut-off derivanti dalle ROC Analysis (ottimale e di massima sensibilità) [37] e dalla nostra esperienza e il risultato batteri ottenuto dalla revisione umana dei dati forniti da iq200 sono stati valutati con il software statistico Analyseit. WBC e ASP sono stati testati separatamente (ai cut-off 15, 20, 40 per µl e 5269, 8000, per µl, rispettivamente) e dopo combinazione (AND/OR) per stimare il possibile incremento in efficienza. Flussi organizzativi Per valutare l impatto organizzativo dell introduzione di sistema iq è stata analizzata la routine di un mese (media giornaliera n. 350 campioni per 6 giorni). È stato determinato il numero dei campioni da diluire, quello dei campioni da rivedere e il numero dei controlli microscopici. Sono stati misurati il tempo totale di esecuzione della routine e quello dei singoli passaggi. Dell organizzazione precedente si è tenuto conto del tempo per l analisi chimica (cadenza oraria di Aution Max n. 226), del tempo di preparazione (inteso come tempo di centrifugazione con 2 centrifughe da 60 posti ciascuna per 5 minuti a 300 g + tempo di decantazione e risospensione del sedimento + la preparazione dei vetrini di lettura), del tempo della microscopia e del tempo di introduzione manuale dei risultati della stessa sulla risposta in LIS. Nella nuova organizzazione con sistema iq si è tenuto conto del tempo per l analisi chimica (sempre con Aution Max), del tempo di analisi di iq200 (100 campioni/h), del tempo di revisione (30 secondi per campione secondo Wah et al [19] elinkoetal[23] moltiplicato la percentuale di revisioni pari al 33% nella nostra esperienza) e il tempo delle eventuali diluizioni (<2%) e degli eventuali controlli microscopici ( 2%). Risultati Studio I Imprecisione L imprecisione WR è stata misurata come CV% ai valori critici di RBC e WBC secondo le European Urinalysis Guidelines [7] con iq200, comparata con quella ottenuta dal metodo di riferimento (ISLH): per RBC < 10 µl iq200 23,6% (media 8,7 µl) e ISLH 33,9% (media 8,0 µl), per RBC > 10 < 100 µl iq200 14,2% (media 31,8 µl) e ISLH 17,4% (media 30,7 µl), per RBC > 100 µl iq200 5,4% (media 1013 µl) e ISLH 16,0% (media 842 µl); per WBC < 10/µL iq200 36,7% (media 4,5 µl) e ISLH 40,8% (media 4,3 µl), per WBC > 10 < 100 µl iq200 12,4% (media 32,9 µl) e ISLH 16,5% (media 32,3 µl), per WBC > 100 µl iq200 2,6% (media 1784 µl) e ISLH 10,9% (media 1754 µl). L imprecisione WR di SqEpCs è stata 31,6%, alla concentrazione di /µl, e di nsqepcs 32,1%, alla concentrazione di 2, /µl. L imprecisione BR per valori elevati di RBC ( /µl) è stata 5,7% e per valori molto bassi di WBC (4, /µl) 27,7%. L imprecisione totale nei 153 campioni selezionati per lo studio dell accuratezza diagnostica e valutati H20-A per RBC, WBC, SqEpC, nsqepc, Hy-casts e cilindri non classificati (nhy-casts) è mostrata nella Tabella 1, comparata con il metodo di riferimento ISLH.

6 66 Riv Ital Med Lab (2013) 9:61 78 Tabella 1 Imprecisione totale di iq200 per i sedimenti di importanza diagnostica, comparata con il metodo microscopico di riferimento ISLH (camera di conta di Fuchs-Rosenthal e lettura in contrasto di fase) su 153 campioni selezionati iq200 ISLH Tipo di sedimento Media (n/µl) DS CV% Media (n/µl) DS CV% RBC ,2 24,0 147,9 57,8 39,0 WBC , ,9 23,8 SqEp 8,7 3,8 43,5 10,3 2,9 28,2 nsqep 1,2 0,98 81,7 4 2,1 53,2 Cilindri ialini 1,5 1,5 130,8 3,1 1,7 57,0 Cilindri patologici 0,46 0,9 206,0 0,8 1,5 188,0 Tabella 2 Accuratezza diagnostica di iq200 per i sedimenti diagnostici alle concentrazioni critiche contro il metodo di riferimento ISLH. Batteri è il risultato della combinazione bacteria and all small particles >12.000/µL ; il metodo di riferimento è la coltura microbiologica (positiva 10 5 CFU/mL) Sensibilità % Specificità % Concordanza % FP ratio % FN ratio % PPV % NPV % Prevalenza % RBC >10 89,7 91,5 91,5 6,6 10,2 92,1 89,7 45,7 WBC >10 91,6 88,0 90,2 12,0 8,5 92,5 86,5 57,0 SqEp >22 86, ,0 2,2 19,0 97,7 12,4 nsqep >1 70,0 88,8 84,3 11,2 45,8 66,6 90,3 24,2 Cilindri ialini > 1 36,5 98,2 81,7 1, , ,1 Cilindri patologici > 0,5 23,5 97,0 88,8 2,9 76,4 50,0 91,0 11,0 Batteri 94,4 88,5 92,6 11,5 5,1 84,0 96,4 36,0 Linearità e carryover La linearità è stata per WBC y = 2,01 + 0,7961 ; r 2 = 0,9966 e per RBC y = 56, ,8562 ; r 2 = 0,9801. Il carryover è stato 0,04%. Accuratezza L analisi della regressione lineare nel primo set di campioni (n. 102) ha fornito i seguenti risultati: RBC (n. 100) y = 31,7429+0,6436, r 2 (coefficiente di determinazione) 0,8668, p<0,001; WBC (n. 100) y = 41, ,9903, r 2 = 0,9932, p<0,001; SqEpCs (n. 53) y = 0, ,3455, r 2 = 0,9110, p<0,001; nsqepcs (n. 24) y = 10, ,2112, r 2 = 0,5840, p<0,001; Hy-casts (n. 15) y = 1, ,5664, r 2 = 0,5199, p<0,001; nhy-casts (n. 4) y = 0, ,6142, r 2 = 0,1136, p = 0,001. Con il metodo statistico di Pearson, il confronto nel secondo set di campioni (n. 153) selezionati per l accuratezza diagnostica verso il metodo di riferimento ISLH ha fornito i seguenti risultati: RBC r (grado di correlazione lineare) 0,9335 (IC95% 0,9096 0,9513), p>0,0001; WBC r 0,9987 (IC95% 0,9981 0,9990), p>0,0001; SqEpCs r 0,9544 (IC95% 0,9333 0,9690), p>0,0001; nsqepcs r 0,7642 (IC95% 0,6697 0,8343), p>0,0001; Hy-casts r 0,7210 (IC95% 0,6130 0,8026), p>0,0001; n-hy-casts r 0,3365 (IC95% 0,1529 0,4976), p = 0,0005. Sensibilità clinica Sensibilità, specificità, concordanza, FP ratio, FN ratio, PPV e NPV nei 153 pazienti selezionati in confronto con il metodo di riferimento ISLH per i sedimenti organizzati di rilevanza diagnostica sono presentati nella Tabella 2. In quei campioni vi sono stati il 7% circa di FN (4% batteri, 2,5% WBC, 1% cilindri ialini e 1% RBC; alcuni FN erano presenti nello stesso campione per sedimenti diversi) e il 25% circa di FP (20% miceti, 2,5% cilindri, 1,5% RBC, 1% sperma). Per quanto riguarda la batteriuria, sensibilità, specificità, concordanza, FP ratio, FN ratio, PPV e NPV della combinazione dei risultati di iq200 batteri e ASP > /µL verso il metodo di riferimento urocoltura nei 103 campioni selezionati sono anch essi presentati nella Tabella 2. Imicrorganismi isolati sono stati: 22 E. coli, 2Klebsiella pneumoniae,1providencia stuartii,1serratia rubidea,1acinetobacter calcoaceticus var. lwoffii,1staphylococcus epidermidis, 1 Staphylococcus saprophiticus (a bassa carica CFU = µl), 1 Streptococcus gruppo B, 2 Enterococcus spp., 1 Streptococcus bovis e 8 flora mista (FM). I falsi negativi di iq200 sono stati 6: 3 FM, 1 Streptococcus bovis, 1 Acinetobacter calcoaceticus var. lwoffii,1e. coli. Praticabilità In una routine settimanale di 285 campioni giornalieri, la cadenza analitica di iq200 misurata (59 campioni/h) è sta-

7 Riv Ital Med Lab (2013) 9: Tabella 3 Sensibilità, specificità, valore predittivo positivo (PPV), valore predittivo negativo (NPV) e efficienza dei risultati iq200 ( all small particles = ASP e leucocytes = WBC da soli o in combinazione AND/OR) e batteri dopo validazione umana come screening di UTI in confronto con urinocoltura (positiva 10 5 CFU/mL) Metodo di riferimento urinocoltura ASP 8000/µL) WBC 20/µL) ASP AND WBC ASP OR WBC Batteri (dopo revisione umana) Sensibilità 83, ,4 94,3 98,4 Specificità 93,7 84,9 96,7 82,2 98,0 PPV 74,1 52,5 81,5 53,4 91,5 NPV 96,4 94,5 93,0 98,5 99,7 Efficienza 91,9 83,5 91,3 84,3 98,1 ta pressoché quella dichiarata dal produttore (60 campioni/h). I campioni richiedenti diluizione sono stati meno del 3%. Una revisione a video delle immagini archiviate è stata necessaria per il 33% dei campioni (criteri di revisione: risultati patologici e allarmi strumentali). L incrocio dei dati tra batteri e ASP ha consentito di ovviare almeno in parte alla bassa sensibilità del risultato iq200 batteri. Meno dell 1% dei campioni ha avuto la necessità di un controllo con microscopia ottica. Studio II Dopo 5 anni di impiego nella routine, la rivalutazione del sistema iq ha fornito i seguenti risultati sotto il profilo diagnostico (diagnosi e monitoraggio di malattie renali; screening di UTI) e dell impatto sui flussi organizzativi. Malattie renali Da un punto di vista diagnostico, l indice cumulativo scelto è stato il numero di referti indicanti nulla da segnalare, reciproco del numero di referti positivi. Prima dell introduzione del sistema iq il numero dei referti negativi era pari al 57% e dopo la sua introduzione al 39%, con un incremento di segnalazioni patologiche del 18% principalmente costituito da RBC. Inoltre, se prima del sistema iq il 41,3% delle segnalazioni di RBC superava il limite decisionale (10/µL) suggerito dalle European Urinalysis Guidelines [7], dopo la sua introduzione la percentuale è stata del 43,8%. Per quanto riguarda i cilindri, prima dell introduzione di sistema iq essi erano stati segnalati nell 1,5% dei casi (47% granulosi o ialino-granulosi); dopo l introduzione sono stati individuati nel 4,5% dei casi (71% ialini). La percentuale dei granulosi e ialino-granulosi è stata del 16,7%, ma il numero assoluto delle segnalazioni è leggermente aumentato (331 prima, 353 dopo). L introduzione di sistema iq ha triplicato la segnalazione di cilindri, in grande prevalenza di quelli ialini. Screening di UTI Nel primo studio, su 235 campioni sono risultati positivi all urocoltura 74 campioni (31,5%), mentre 162 non presentavano crescita batterica. Considerando positivi all UF 100 i campioni con conte batteriche > /µL e/o WBC > 50/µL, sono risultati concordanti 188 risultati su 235 (80%); all iq200, considerando positivi i campioni che presentavano un numero di ASP > /µL e/o la presenza dell allarme batteri, i risultati concordanti sono stati 177 (75,3%). iq200 ha evidenziato una sensibilità dell 83,7%, una specificità del 71,7%, un VPP del 48,8% e un VPN del 90,6%. I microrganismi isolati sono stati: 38 E. coli, 8 altri Gramnegativi, 3 Enterococcus spp., 6 con 2 ceppi, 2 Candida, 1 Streptococcus gruppo B, 1 Staphylococcus aureus, 1Staphylococcus epidermidis e 14 FM. I falsi negativi per iq200 sono stati 6 FM, 1 Streptococcus gruppo B, 3 E. coli a bassa carica e 2 enterococchi; per UF 100 sono stati 5 FM, 1 Streptococcus gruppo B, 3 E. coli a bassa carica, 1 Enterococcus spp. e 1 Candida. Poiché la capacità di riconoscimento di iq200 è apparsa non adeguata all impiego di screening di UTI, anche abbinando bacteria e ASP, in un secondo studio abbiamo tentato altre formule, individuando in ASP e WBC le misure con i migliori risultati e li abbiamo valutati in un ampio periodo di tempo e su un numero assai consistente di campioni verso l urinocultura come metodo di riferimento. I dati di 7615 campioni consecutivi esaminati con urocultura e iq200 sono mostrati nella Tabella 3. Le curve ROC per ASP e WBC sono mostrate nelle Figure 1 e 2. Verso il metodo di riferimento, il parametro ASP (cut-off 5269/µL da curva ROC) ha dimostrato una sensibilità dell 88,2%, una specificità dell 88,0%, un PPV del 61,5%, un NPV del 97,2% e un efficienza dell 88,1%; al cut-off 8000/µL (dalla nostra esperienza) una sensibilità dell 83,8%, una specificità del 93,7%, un PPV del 74,1%, un NPV del 96,4% e un efficienza del 91,9%; al cut-off /µL (massima efficienza da curva ROC) una sensibilità dell 81,4%, una specificità dell 81,7%, un PPV del 49,1%, un NPV del 95,3% e un efficienza dell 81,6%. Il parametro WBC (cut-off 15/µL

8 68 Riv Ital Med Lab (2013) 9:61 78 da curva ROC) ha dimostrato una sensibilità dell 81,4%, una specificità dell 81,7%, un PPV del 49,1%, un NPV del 95,3% e un efficienza dell 81,6%; al cut-off 20/µL (dalla nostra esperienza) una sensibilità del 77,0%, una specificità dell 84,9%, un PPV del 52,5%, un NPV del 94,5% e un efficienza dell 83,5%; al cut-off 40/µL (massima efficienza da curva ROC) una sensibilità del 67,6%, una specificità del 90,5%, un PPV del 60,7%, un NPV del 92,8% e un efficienza dell 86,5%. Inoltre, ASP e WBC, ai cutoff derivati dalla nostra esperienza, hanno dimostrato una sensibilità del 66,4%, una specificità del 96,7%, un PPV dell 81,5%, un NPV del 93,0% e un efficienza del 91,3%; ASP o WBC, ai cut-off derivati dalla nostra esperienza, hanno dimostrato una sensibilità del 94,3%, una specificità dell 82,2%, un PPV del 53,4%, un NPV del 98,5% e un efficienza dell 84,3%. Il risultato batteri (dopo revisione umana dei dati iq200) ha dimostrato una sensibilità del 98,4%, una specificità del 98,0%, un PPV del 91,5%, un NPV del 99,7% e un efficienza del 98,1%. Flussi organizzativi Fig. 1 Curva ROC di small particles verso urinocoltura (CFU 100,000/mL). AUC (95% CI of AUC 0,938 to 0,957), SE 0,0049, p<0,0001 In un mese di routine, meno del 2% dei campioni ha avuto necessità di diluizione. Il tasso delle revisioni a video con sistema iq è stato del 27%. Circa l 1% dei campioni ha avuto necessità di controllo microscopico tradizionale. Il tempo totale per completare la routine (n. 350 campioni/die) è stato di 370 minuti contro i 430 richiesti dall organizzazione precedente (Fig. 3). L impiego di un secondo iq200 abbatte i tempi di oltre 100 minuti (tempo totale 260 min). Discussione Fig. 2 Curva ROC di leukocytes verso urinocoltura (CFU 100,000/mL). AUC 0,880 (95% CI 0,864 0,895), SE 0,0077, p<0,0001 Nella valutazione di uno strumento per l analisi automatizzata del sedimento urinario si devono tenere a mente alcune considerazioni fondamentali riguardanti la natura del liquido biologico esaminato, le caratteristiche dei metodi di valutazione, con particolare attenzione ai metodi di riferimento e agli obiettivi clinici dell esame del sedimento urinario. L automazione dei riconoscimenti morfologici è sempre stata più complessa dell automazione delle determinazioni biochimiche e la storia dell automazione in ematologia lo dimostra. Molto opportunamente, Linko et al [23] sottolineano che l automazione della morfologia urinaria è ancora più complicata di quella sanguigna, perché la matrice urinaria è difficile a causa della presenza di variabili concentrazioni elettrolitiche, proteiche e di noise quali il muco, perché i sedimenti da riconoscere sono molto differenti in dimensioni (da 1 a 100 µm di diametro) e perché la loro concentrazione nell urina nativa è di solito molto bassa. Queste peculiarità hanno reso complicate anche le valutazioni analitiche e cliniche degli strumenti proposti, che si sono affidate ai metodi suggeriti per la valutazione degli strumenti ematologici o a quelli suggeriti per le valutazioni semiquantitative. In particolare, per la valutazione dell accuratezza per confronto e per quella della sensibilità clinica vi è il problema del metodo di riferimento. Nella definizione della gerarchia dei metodi per la microscopia ottica nell esame del sedimento urinario, le European Urinalysis Guidelines [7]

9 Riv Ital Med Lab (2013) 9: Fig. 3 Ottimizzazione dei flussi conseguente all introduzione di iq200 IRIS, calcolata su 350 campioni/die. Stato precedente (sp) 430 min: analisi chimico-fisica automatizzata (dipstick) 100 min + preparazione 90 min (30 centrifugazione + 30 preparazione sedimento + 30 preparazione vetrino) + esame microscopico del sedimento (m.o.) 175 min + inserimento manuale in LIS dei risultati di m.o. 60 min. Stato successivo (ss) 370 min: analisi chimico-fisica automatizzata (dipstick) 100 min + esame su iq200 (IRIS) 210 min + validazione umana dei risultati iq200 (33% dei campioni) 55 min + preparazione 5 min (1% dei campioni) + controllo microscopico 10 min (1% dei campioni). L inserimento di un secondo iq200 abbatte i tempi di 105 min (totale 260 min) hanno stabilito che al Livello 4 si trovi il metodo di riferimento in grado di identificare e quantificare accuratamente i sedimenti organizzati, al Livello 3 i metodi di confronto (colorazioni sopravitali e/o lettura a contrasto di fase; colorazione di Gram post-centrifugazione per i batteri), al Livello 2 i metodi di routine (sedimento standardizzato su vetrino o in camera di conta in campo chiaro; Gram o conta in camera su urine native per i batteri) e al Livello 1 i metodi rapidi (sedimento non standardizzato; strisce reattive). Dalla descrizione, qui succintamente riassunta, è chiaro che i metodi microscopici normalmente utilizzati nei laboratori sono di Livello 1, al massimo di Livello 2. D altra parte, gli strumenti per la lettura automatizzata del sedimento sono classificabili al Livello 3. Nel sistema iq200, infatti, la tecnologia di microscopia di immagine automatizzata si compone di 3 elementi portanti: la presentazione in sospensione laminare del campione; la rilevazione dei sedimenti tramite una videocamera CDD, che cattura più di 500 immagini per campione; il riconoscimento delle particelle isolate mediante rete neurale (APR ) che integra i dati ottenuti principalmente per le dimensioni, la forma, il contrasto e il contenuto interno. Giustamente, van den Broek et al [24] sottolineano che, quindi, la valutazione degli strumenti che automatizzano il sedimento dovrebbe essere fatta contro un metodo di Livello 4(o al massimo di Livello 3 NdA) e non certo contro metodi di più basso rango come il sedimento standardizzato (Livello 2) o il sedimento non standardizzato o/o striscia reattiva (Livello 1). Nel 2000 gli estensori del documento European Urinalysis Guidelines [7] sostenevano che currently, no such [Reference] method exists e raccomandavano come temporanei rimedi la standardizzazione delle procedure e l attenzione alle fonti di errore, in particolare alla centrifugazione, che Hannemann-Pohl e Kampf [40] avevano dimostrato indurre perdite di cellule imprevedibili e in grado di superare il 30%. Tuttavia, nel 2003, alcuni autori (comprendenti il principale estensore delle European Urinalysis Guidelines) hanno suggerito un metodo di riferimento specifico per i sedimenti urinari [33]. La ISLH Recommended Reference Procedure for the enumeration of particles in urine impone l uso di campioni freschi (entro 2 ore dall emissione), un apparato standardizzato con una camera Fuchs- Rosenthal e lettura in contrasto di fase, una conta adeguata (50 eventi per le particelle rare, 200 eventi per quelle non rare) in più camere se necessario, almeno 3 osservatori indipendenti. Una valutazione corretta dell accuratezza degli analizzatori per la lettura del sedimento automatizzata dovrebbe, quindi, essere condotta con il metodo ISLH. Inoltre, il confronto con la microscopia ottica può essere fatto con metodi statistici che non predeterminano un riferimento, come per esempio il Bland-Altmann [27], ma per marcare le differenze e debolezze del metodo di rango inferiore. D altra parte, un confronto che metta tutti i metodi (microscopia ottica tradizionale, strisce reattive, strumenti UFC o MIA) sullo stesso piano [28], contenendo una maggioranza di metodi a bassa performance secondo le European Urinalysis Guidelines, trascina all ingiù la media di consenso danneggiando i metodi più innovativi. Per quanto attiene la valutazione del riconoscimento dei batteri, ciò che conta non è tanto l accuratezza per confronto nell identificazione dei cocchi e bacilli, peraltro segnalata come insufficiente per iq200 [2, 22, 29] che riconosce come batteri solo le particelle con adeguata morfologia >3 µm, ponendo quelle inferiori nel novero delle ASP, ma la capacità dello strumento di identificare i campioni dei pazienti con infezioni del rene e delle vie urinarie (screening di UTI). Ne consegue che il metodo di riferimento sia la coltura microbiologica, anche se essa non è

10 70 Riv Ital Med Lab (2013) 9:61 78 priva di problematicità. Innanzitutto va ricordato che esistono i falsi negativi dell urocoltura, realisticamente valutabili in circa il 10%, che dipendono da errori nell iter di preparazione della stessa e fanno sì che nel confronto tra colture e altri metodi 90% di specificità sia una stima migliore di 100% [41]. In secondo luogo vi è il problema del livello decisionale a cui definire positiva un urocoltura e delle flore miste, presumibilmente da contaminazione. La scelta dei criteri e dei livelli decisionali utilizzati nel metodo di riferimento e nel metodo in esame è assolutamente discriminante. Kouri et al [14], valutando UF 100, sottolineano, per esempio, che the % error is function of number of colonies e che the relationship between automated bacterial count and bacterial culture largely depends on the selected UF 100 cut-off values. Oggi si può considerare in modo critico il criterio di valutazione quantitativa di Kass e l importanza di un valore soglia o cut-off come unico elemento per considerare un campione clinicamente significativo, tanto più quanto più ci si affida a una più corretta correlazione tra uropatogenicità del microrganismo isolato e carica rilevata, ma soprattutto quando si dia più spazio alla valutazione clinica del paziente, unitamente alla valutazione di altri parametri urinari, quali per esempio la presenza di leucociti. Piuttosto si suggerisce di articolare i limiti decisionali sulla base della popolazione testata (popolazione generale, bambini, donne in gravidanza, ospiti di comunità). Secondo le European Urinalysis Guidelines [7], riscontrare in pazienti sintomatici un patogeno primario con carica di 10 3 CFU/mL può già considerarsi clinicamente significativo; per un patogeno secondario il limite può essere invece individuato in un valore di 10 4 per le donne e 10 3 CFU/mL per l uomo, mentre per i patogeni condizionali viene riferita una soglia intorno a 10 5 CFU/mL, quando essi siano presenti in coltura pura. Anche dalle definizioni delle European Urinalysis Guidelines appare evidente, dunque, che l importanza della carica batterica come parametro discriminante può oggi apparire davvero superata dalla più razionale correlazione tra notizie anamnestiche e presenza di un determinato microrganismo nell urina a una determinata concentrazione. Solo nei pazienti asintomatici, nei quali si sia proceduto comunque all esame colturale, può ritenersi giustificato riferirsi a un livello soglia di 10 5 CFU/mL, anche in considerazione della scarsa qualità generale del campionamento con mitto intermedio. Tutte le urine che presentano cariche miste con oltre due ceppi, indipendentemente dalla carica rilevata, devono essere eventualmente ripetute per individuare l eventuale agente eziologico sotteso e comunque vanno refertate con la definizione di presenza di flora batterica da probabile contaminazione, così come non vanno clinicamente considerati tutti i microrganismi appartenenti al gruppo dei contaminanti propriamente detti [7]. Performance analitiche Nelle nostre mani, la linearità di iq200 è apparsa oltrepassare quanto dichiarato dal produttore ( cellule 10 3 µl) per RBC e WBC, così come dimostrato da altri [2, 19, 23, 24]. Sfortunatamente, durante il primo studio non ci sono stati campioni contenenti un numero elevato di SqEpCs. Il carryover è stato insignificante (0,04%), inferiore a quanto segnalato da altri [19, 23, 25]. Il confronto tra l imprecisione di iq200 ottenuta dal presente lavoro per i RBC (Tab. 4) eiwbc(tab.5) e quella ottenuta da altri autori su iq200 [18, 19, 24], con conte manuali [18, 39], con SediMax [20, 21] e con strumenti UFC [14 16, 40, 42]mostra che la precisione del metodo iq200 è leggermente meno buona (23,6 CV% vs 17,7 CV% a conte inferiori a 10/µL) di quella degli strumenti di citofluorimetria urinaria (UFC), come prevedibile secondo la teoria di Poisson basata sul numero di eventi contati, ma è decisamente migliore di quella del metodo microscopico tradizionale, sia intra-osservatore che inter-osservatori. La precisione è adeguata alle necessità cliniche dell esame delle urine, come dimostrato anche da altri autori [18, 19, 22 30], nonostante la segnalazione di Linko et al [23] sulla distanza tra i valori ottenuti e quelli teorici sulla base della distribuzione di Poisson (1,18 3,08 volte). In ogni caso, in rapporto agli intervalli di riferimento, abbiamo dimostrato che i limiti di confidenza strumentali per le conte microscopiche delle cellule urinarie più numerose (leucociti, eritrociti, cellule squamose) sono sovrapponibili a quelli ottenuti con camera di conta di riferimento, come comprovato da Lamchiagdhase et al [22]. Peraltro, van den Broek et al [24] hanno notato che valori di CV% < 15% ai livelli decisionali diagnostici hanno effetti clinici drammatici, consentendo di stabilire più stringenti intervalli di riferimento e limiti decisionali, risultati quantitativi e monitoraggi efficaci (diremo una nuova conta di Addis), come già sottolineato da Hannemann-Pohl e Kampf a proposito degli strumenti UFC [40]. Noi non abbiamo valutato la minima concentrazione rilevabile di particelle urinarie (detection limit, DL) contando iq Negative Control 10 volte e calcolandone la media ± 2 DS (deviazione standard). Con questo metodo Alves et al [2] e van den Broek et al [21] hanno determinato il DL a 6 particelle/µl, simile al DL determinato per UF 100 [2, 21, 37].Linkoetal[23] hanno evidenziato che il livello minimo di quantificazione di iq200 è intorno a particelle/µ, se si utilizza il criterio di un imprecisione BR del 30%, come da loro definito. Con lo stesso metodo Wahetal[19] hanno determinato un imprecisione BR di 19,2% a 28 cellule 10 3 µl e noi abbiamo misurato un imprecisione BR di 27,7% a 4,5 cellule 10 3 µl. Tuttavia, nelle nostre mani la misurazione di concentrazioni diagnostiche di sedimenti secondo EUGL (10/µL) è possibile con CV < 20% e alle concentrazioni corrispondenti ai valori superiori degli intervalli di riferimento (RBC 17/µL; WBC 28/µL)

11 Riv Ital Med Lab (2013) 9: Tabella 4 Confronto dell imprecisione WR a diverse concentrazioni di RBC tra microscopia in camera di conta e contrasto di fase (ISLH o similari), iq200, SediMax, UF 100 e UF 1000i. In neretto nostre valutazioni; Deindorfer et al [18]; Wah et al [19]; vandenbroeketal[24]; n Zaman et al [20]; Kourietal[14]; Yashui et al [12]; Fenili et al [42]; ç Hannemann-Pohl et al [40]; # Manoni et al [44] Microscopia iq200/ IRIS SediMax UF 100 UF 1000i Media (n/µl) CV% Media (n/µl) CV% Media (n/µl) CV% Media (n/µl) CV% Media (n/µl) CV% 6,7 52,7 8,7 23,6 7 n 17,8 n 5,9 17,7 6,3 # 18,0 # 10,1 19, ,6 20 n 11,0 n 14,6 # 13,5 # 33,8 42,6 26,8 14,2 24 ç 8,5 ç 80,4 27,6 82,7 9,5 97,7 6,7 70,7 # 4,8 # 188,7 32,7 161,2 9,0 210 n 8,5 n , ,5 447 n 6,7 n 278 2,4 303,0 # 3,2 # 50 1, ,9 779,4 # 1,6 # Tabella 5 Confronto dell imprecisione WR a diverse concentrazioni di WBC tra microscopia in camera di conta e contrasto di fase (ISLH o similari), iq200, SediMax, UF 100 e UF 1000i. In neretto nostre valutazioni; Deindorfer et al [18]; Wah et al [19]; vandenbroeketal[24]; n Zaman et al [20]; Kourietal[14]; Yashui et al [12]; Fenili et al [42]; ç Hannemann-Pohl et al [40]; # Manoni et al [44] Microscopia iq200/iris SediMax UF 100 UF 1000i Media (n/µl) CV% Media (n/µl) CV% Media (n/µl) CV% Media (n/µl) CV% Media (n/µl) CV% 3,5 52,7 3,9 25,1 4 n 16,6 n 4,9 13,4 5,2 # 6,2 # 8,4 47, ,8 18,9 16,6 17,2 # 5,0 # 28,8 28,0 30,9 18,2 45 n 11,2 n 34,9 12,6 38,7 # 4,6 # 94,9 23, ,7 87,5 5,4 95,4 # 2,8 # 217,5 38, ,1 258 n 4,4 n 218 ç 2,4 ç 219,9 # 4,8 # 826,8 18, ,0 5,6 920,3 # 1,7 # con CV < 15%. Pertanto, dai nostri dati è desumibile un DL di 10 particelle/µl. Anche Lamchiagdhase et al [22] hanno potuto individuare, in questo modo, intervalli di riferimento sovrapponibili ai limiti posti dalle European Urinalysis Guidelines. La valutazione dell accuratezza come confronto e dell accuratezza diagnostica degli strumenti per l analisi automatizzata del sedimento urinario è stata effettuata in letteratura sostanzialmente in due modi: (a) utilizzando come confronto la microscopia ottica tradizionale con sedimento non standardizzato in campo chiaro (Livello 1 European Urinalysis Guidelines) o in camere plastiche a volume predeterminato in campo chiaro (Livello 2 European Urinalysis Guidelines), oppure (b) scegliendo il metodo di riferimento suggerito da ISLH e che prevede espressamente l impiego di camere di conta Fuchs-Rosenthal (o Bürker [14])elalettura in contrasto di fase (Livello 4 European Urinalysis Guidelines). Noi abbiamo scelto quest ultimo metodo per due ragioni: innanzitutto per la necessità di confrontarsi con un metodo di rango superiore. In secondo luogo, il confronto con il metodo di riferimento deve consentire di valutare i miglioramenti diagnostici offerti dai nuovi apparati. L innovazione tecnologica e l automazione, a nostro avviso, devono servire a una maggiore accuratezza diagnostica e non semplicemente a velocizzare l esistente. Pertanto, nell analisi critica della letteratura abbiamo privilegiato il confronto con coloro che hanno utilizzato il metodo di riferimento suggerito da ISLH. Il confronto dell accuratezza di iq200 (come r con il metodo statistico di Pearson) e quella degli strumenti UFC (UF 100 [43] e UF 1000i [44]) contro il metodo di riferimento microscopico ISLH (Tab. 6) mostra eccellenti correlazioni per WBC, RBC e cellule squamose. La correlazione per RBC potrebbe suggerire una sovrastima della conta delle emazie con iq200; ricerche nostre e di altri [24] hanno dimostrato che sono i metodi tradizionali a sottostimare. Le correlazioni delle nsqepc e dei Hy-casts sono limitate dal loro numero nel singolo campione e dalla prevalenza di campioni contenenti queste categorie di sedimenti. Ciò è vero per tutti i sistemi di riconoscimento, compresa la microscopia [27, 28, 40]. D altra parte, le strisce reattive non sono in grado di fornire alcuna indicazione rispetto a questi sedimenti diagnostici. Esistono, nella nostra casistica, alcuni outlier da misclassificazione sia FP (21%) sia FN (7%), comprendenti RBC falsi positivi per ossalati o miceti, RBC dismorfici classificati come miceti, falsi negativi per batteri e cilindri, come peraltro conosciuto da altri sistemi di ricono-

12 72 Riv Ital Med Lab (2013) 9:61 78 Tabella 6 Accuratezza (r) di iq200, UF100 e UF 1000i per RBC, WBC, Cellule Epiteliali e Cilindri. Confronto con camera di Fuchs-Rosenthal (ISLH); Confronto con camera di Bürker; risultati iq200 rivisti. Sq = Cellule Epiteliali Squamose; nsq = Cellule Epiteliali non Squamose; (?) = comprendenti anche SRC (small round cells); y = tutti i tipi di cilindri Presente lavoro iq 200 n. RBC WBC Cellule Epiteliali Cilindri 153 0,9335 0,9987 Sq 0,954, nsq 0,764 Ialini 0,721, patologici 0,336 Wah et al [17] ,959 0,940 Sq 0,951 Linko et al [21] 167 0,894 0,885 Sq 0,904 0,856 Kouri et al [14] UF ,880 0,982 0,722(?) 0,517 y Regeniter et al [43] 160 0,890 0,940 0,740 0,329 y Manoni et al [44] UF 1000i 214 0,98 1,00 Sq 0,96 0,69 y Tabella 7 Confronto di accuratezza diagnostica per i sedimenti diagnostici di malattia renale e delle vie urinarie della striscia reattiva, degli strumenti citofluorimetrici e a riconoscimento d immagine verso il metodo di riferimento ISLH. iq200 presente lavoro; striscia reattiva Gambke et al [42]; UF 100 Kouri et al [14]; UF 1000i Manoni et al [16]; SediMax Zaman et al [20]. Cellule Squamose 7/µL; ç cut-off 3/µL Particelle/µL iq 200 Striscia reattiva UF-100 UF 1000i SediMax SE SP SE SP SE SP SE SP SE SP RBC > 8 94,6 84,7 74,3 77, WBC > ,6 86, SqEp , nsqep > 1 82,7 79,4 62 ç 73 ç nd nd Cilindri ialini > 1 43, ç 73 ç Cilindri patologici > 0,5 33, ç 94 ç nd nd scimento dei sedimenti urinari [14]. Le nostre segnalazioni di FP e FN sono, di massima, in linea con la letteratura. La gran parte dei FP è relativa a miceti, come rimarcato in particolare da Lamchiagdhase et al [22] edachienetal[27], che talora producono FP per RBC. Il 2,5% di FP sono cilindri ialini: una sovrastima è stata segnalata già da Wah et al [19] ed è legata in parte a interferenze da muco, ma in parte alla maggiore sensibilità di iq200 rispetto alla microscopia, anche in camera di conta e a contrasto di fase [24, 29]. I FN sono prevalentemente a carico dei batteri, che sono in effetti la categoria cellulare di più complicato riconoscimento [2, 22, 23, 27, 29], come si dirà oltre. Anche la difficoltà in un ottimale riconoscimento dei cilindri patologici è stata già segnalata [22, 23]. In ogni caso, se le regole di revisione contemplano il controllo dei campioni patologici, la subclassificazione è facilmente attuabile. Nelle nostre mani non si sono evidenziati particolari problemi al riconoscimento di WBC e clumps, come viceversa segnalato da Wah et al [19]. Non si è tenuto conto delle caratteristiche della cristalluria, perché eseguita solo su specifica richiesta e segnata in routine solo quando in grado di inficiare le conte e i riconoscimenti cellulari, oppure se significative di patologia (cistina, colesterolo, ossalato monoidrato). La revisione delle immagini immagazzinate migliora l accuratezza del riconoscimento dei sedimenti organizzati. Se per Lamchiagdhase et al [22] la correlazione pre/postrevisione è 0,914 per WBC, 0,962 per RBC e 0,812 per SqEpEc, per Linko et al [23] il miglioramento è molto evidente, passando le correlazioni con il metodo di riferimento da 0,494 a 0,948 per RBC, da 0,885 a 0,948 per WBC, da 0,904 a 0,927 per SqEpEc, da 0,585 a 0,706 per nsqepec e da 0,000 a 0,856 per i cilindri. Le nostre correlazioni sono, viceversa, precedenti le revisioni umane, che pure consentono nelle nostre mani la corretta riclassificazione o subclassificazione del 33% dei campioni. La revisione delle immagini migliora anche le prestazioni di SediMax, calcolate con la correlazione di Spearman, da 0,41 a 0,95 per i miceti, da 0,23 a 0,58 per i cilindri ialini e da 0,30 a 0,46 per i cilindri patologici, mentre le correlazioni per RBC sono 0,77, per WBC 0,86, per SqEpEc 0,41 e per nsqepec 0,35 [20]. Sensibilità clinica L accuratezza diagnostica, quando comparata con il metodo di riferimento ISLH, è per iq200 molto migliore della striscia reattiva [45] valutata solo per RBC e WBC, migliore di altri strumenti a riconoscimento d immagine e di citofluorimetria dedicata, eccetto che per l ultimo prodotto della serie UF 1000i (Tab. 7). Nella Tabella 7, per una corretta interpretazione, sono indicati i diversi cut-off utilizzati da noi, Kouri et al [14] e Manoni et al [16]. Zaman et al [20], nel loro Study I, non indicano i cut-off dei sedimenti esaminati. Dal punto di vista diagnostico, è estremamente interessan-

13 Riv Ital Med Lab (2013) 9: te la segnalata possibilità dei benefici di MIA. Il riconoscimento dei sedimenti di numerosità bassa appare migliorare: le cellule non squamose sono meglio riconosciute [27]; vi è un maggiore riconoscimento di eritrociti e cilindri [18, 19]. Secondo Wah et al [19], APR sovrastima i cilindri contati nel sedimento routinario, ma vi è un buon accordo con la revisione delle immagini archiviate. Secondo van der Broek et al [24], su 193 campioni con cilindri solo 87 erano positivi alla microscopia, mentre 155 con iq200. Nelle nostre ricerche, sono stati paragonati due semestri con circa sedimenti ciascuno, il primo con utilizzo della microscopia tradizionale e il secondo con utilizzo di MIA. L utilizzo di iq200 Iris ha triplicato il riscontro di cilindri urinari (4,5% vs 1,5%), con incremento a carico prevalentemente della categoria ialini. Il numero assoluto di segnalazioni di cilindri patologici, peraltro, è aumentato, seppure con minore evidenza (+7%). Questo dato conferma quanto da noi già riscontrato in una valutazione dell impatto di iq200 sulla nostra efficienza diagnostica [46]. In quell occasione abbiamo valutato anche l utilità della proteinuria (albuminuria) da striscia reattiva nell indicare, da sola o in associazione, l opportunità del controllo microscopico per cilindruria, come indicato da Fenili e Pirovano [42] o, più articolatamente, da Penders et al [47]. È ben noto che la proteina di Tamm- Horsfall, costituente dei cilindri ialini e matrice dei cilindri patologici, eccetto quelli cerei, è una globulina e come tale non è evidenziata dalle strisce reattive. Tuttavia, l uso delle strisce per segnalare la possibile presenza di cilindri è ancora ampiamente suggerito [48], probabilmente sulla base della concorrente escrezione di albumina nelle proteinurie miste. Cilindri nel sedimento furono rinvenuti nel 3,8% dei pazienti con albuminuria <20 mg/l (90% ialini e 10% non-ialini), nel 25% dei pazienti con albuminuria tra 30 e 150 mg/l (71% ialini e 29% non-ialini) e nel 37% di quelli con albuminuria >150 mg/l (59% ialini e 41% non-ialini). Pur essendoci un incremento progressivo nella numerosità e gravità della cilindruria in corrispondenza all incremento dell albuminuria, esso non è tale da poter essere utilizzato come indicatore o allarme per il controllo microscopico dei sedimenti finalizzato alla rilevazione di questa anomalia urinaria diagnostica, così come evidenziato ancora nel 1995 da Kawamura et al [48]. Già le valutazioni degli anni 80 del secolo scorso avevano mostrato una capacità del sistema MIA di rilevare il 20% in più di anomalie urinarie rispetto alla microscopia convenzionale [18]. Secondo i dati di van der Broek et al [24], la quantificazione più precisa e l utilizzo di livelli decisionali quantitativi (da 1 5 RBC/hpf a 17 RBC/µpari a 3 RBC/hpf) hanno determinato un 20% in più di pazienti con necessità di approfondimento per ematuria, e nel 53% (34 in numero assoluto) di essi è stata posta diagnosi di importante patologia del tratto urinario (compresi 4 carcinomi della vescica). Nelle nostre ricerche, su 5148 campioni eseguiti in routine con iq200 e il sistema esperto Uromante, confrontati con 5768 campioni dello stesso periodo dell anno (gennaio-giugno) con il sistema di microscopia tradizionale, abbiamo rilevato ematuria nel 18% in più di pazienti, in cui il 43,8% si pone sopra il livello decisionale suggerito dalle European Urinalysis Guidelines (10 RBC/µL), nonostante la diminuzione dei campioni positivi alla ricerca dell emoglobina con striscia reattiva (13,8% positivi vs 18,4%). È inoltre interessante notare che le percentuali dei positivi alla striscia reattiva (18,4%) e in microscopia manuale (18,4%) si sovrappongono, segnalando il ben noto bias dell osservatore informato. Nelle nostre mani, inoltre, il riconoscimento degli eritrociti dismorfici è stato facile, contrariamente a quanto sostenuto dabovenetal[49] e in accordo con van den Broek et al [24] (Fig. 4). Il riconoscimento dei batteri da parte di iq200 presenta alcune criticità [2, 22, 27, 29]. Linko et al [23] hanno riportato per il risultato batteri di iq200, contro la microscopia a contrasto di fase in camera di conta Bürker in 135 campioni, una sensibilità del 42,9% e una specificità del 96,5% con APR da solo, che migliora a una sensibilità del 64,3% con una specificità del 97,0% dopo riclassificazione umana. Tuttavia, nella stessa valutazione la microscopia routinaria in campo chiaro ha mostrato una sensibilità, ben inferiore, del 71,4%. Anche Lamchiagdhase et al [22], in un campione più numeroso (n. 280) ma contro la microscopia tradizionale, hanno notato una bassa sensibilità dei batteri iq200, specialmente quando il numero dei batteri alla microscopia ottica era basso o molto basso ( rari o pochi ). La riclassificazione umana, anche qui, migliorava la sensibilità dal 20,0% al 46,0% prima e dopo la verifica a video. False positività per batteri erano riportate nel 5% dei casi, prevalentemente a causa dell interferenza di grandi quantità di cristalli amorfi. D altra parte è ben conosciuta la limitata specificità del riconoscimento dei batteri in UF 100 (55,6% secondo Regeniter et al [43]), attribuita al riconoscimento anche dei batteri non più vitali. Comunque gli autori sottolineano che il valore clinico di qualunque conta microscopica di batteri è criticabile, dal momento che la microscopia ottica è una tecnica rudimentale e imprecisa e non va certo utilizzata come metodo di riferimento. Inoltre, la microscopia tradizionale non riesce a distinguere i batteri vivi da quelli morti e di qui possibili discrepanze tra dati microscopici e colturali. Da tempo nel nostro Laboratorio si riportano solo i batteri da numerosi in su, considerando l effetto sulla crescita batterica nelle urine legato alle raccolte non corrette o contaminate, alla conservazione non sempre adeguata e al tempo intercorrente tra la minzione e l esame, non sempre rispettoso delle 2 4 ore suggerite dalle linee guida. La sottostima della batteriuria dipende principalmente dal fatto che il sistema riconosce particelle con morfologia suggestiva solo quando superiori a 3 µm. Quelli di dimensioni inferiori, e quindi tutti i cocchi, li classifica nelle ASP.

14 74 Riv Ital Med Lab (2013) 9:61 78 Fig. 4 Identificazione degli eritrociti dismorfici su iq200 Secondo Shayanfar et al [29] la rotazione delle strutture tridimensionali e l applicazione di una logica fuzzy potrebbero aiutare a discriminare meglio le particelle sferiche (cellule e miceti) da quelle allungate (batteri e cilindri). I cocchi e talora altri batteri sono comunque rilevati da iq200 come ASP. Di conseguenza, sia il risultato batteri sia ASP forniscono una quantificazione indicativa del numero di batteri per una revisione visiva, a volte difficile per i batteri non bastoncellari. Tuttavia, secondo Shayanfar et al [29], iq200 potrebbe avere una maggiore applicabilità nel riconoscimento dei batteri rispetto a UF 100, proprio per la possibilità di riclassificazione umana. Inoltre, contro il microscopio a contrasto di fase e camera di conta le performance di UF 100 per batteri non sono apparse molto buone (sensibilità 51%, specificità 97%) [22], benché siano colorati con 2 colori fluorescenti. Molto migliori le performance di UF 1000i per le novità tecniche ivi apportate [15]. Nell utilizzo della citofluorimetria dedicata come screening di UTI sono state utilizzate diverse formule combinando i risultati batteri, WBC e, nella prima versione di UF 100, altre particelle (HiBact). Così anche per la valutazione di iq200 come screening di UTI sono state utilizzate combinazioni diverse dei parametri batteri, WBC e ASP [38, 39, 50]. D altra parte, anche per altri sistemi di screening di volta in volta proposti come la striscia reattiva e la microscopia ottica sono state suggerite combinazioni di risultati all interno dello stesso metodo (esterasi leucocitaria e nitriti; batteri e leucociti, rispettivamente) o tra metodi (esterasi leucocitaria e batteri alcuni nel modello di van Nostrand et al [51]). In ogni caso, la valutazione deve essere fatta contro la coltura microbiologica, nonostante le sue limitazioni. Nella nostra prova del primo studio (Tab. 2), la capacità di riconoscimento dei batteri da parte di iq200 combinando bacteria e ASP (nel tentativo di tenere conto di bacilli e cocchi, rispettivamente) verso urocolture positive CFU 10 5 /ml, pur superando la soglia proposta dalle European Urinalysis Guidelines per screening di UTI (NPV 95%), è apparsa limitata rispetto alla citofluorimetria urinaria [15]. I risultati ottenuti non sono stati confermati in una seconda valutazione su un numero più ampio di campioni testati (235 vs 103). Pertanto, nella seconda prova del secondo studio abbiamo valutato un altra formula utile a tale scopo, che combinasse risultati di iq200 similmente a quanto già suggerito per la microscopia ottica, le strisce reattive e la citofluorimetria urinaria e che tenesse conto della nostra esperienza e della letteratura sull importanza delle ASP [28, 39]. Abbiamo individuato nei risultati iq200 WBC e ASP i parametri più performanti come screening di UTI. In circa 8000 campioni consecutivi con richiesta di esame delle urine e urocoltura, testati in doppio cieco, la combinazione OR dei due parametri ai livelli decisionali scelti in base all esperienza (ASP 5000/µL e WBC 20/µL) ha mostrato un NPV del 98,5%, adeguato all uso di screening, migliore dei metodi tradizionali e sovrapponibile alla performance di altri sistemi automatizzati, mentre la combinazione AND ha mostrato un NPV pari solo al 93%. Le soglie sono molto prudenti, ma consentono di minimizzare i FN, con un risparmio di urinocolture pari, comunque, al 60%. Tuttavia, il risultato batteri dopo revisione umana indotta dall allarme batteri, da ASP 5000/µL e WBC 20/µL ha dimostrato un NPV del 99,7%, paragonabile al NPV migliore ottenuto dalla citofluorimetria urinaria con canale dedicato al riconoscimento dei batteri (UF 1000i) [16]. L interpretazione umana, peraltro, richiede tempo (20 30 secondi per campione)