Prof. Maria Nicola GADALETA

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1 Prof. Maria Nicola GADALETA Facoltà di Scienze Biotecnologiche Corso di Laurea in Biotecnologie Sanitarie e Farmaceutiche Biochimica e Biotecnologie Biochimiche DISPENSA N. 11 MIOGLOBINA ED EMOGLOBINA : CINETICA DI DISSOCIAZIONE DI O 2 EFFETTORI ALLOSTERICI EFFETTO BOHR

2 INTERAZIONI PROTEINA : LIGANDO Proteine: molecole flessibili: subiscono modificazioni della loro conformazione (NMR) Queste modificazioni sono fisiologicamente importanti: da esse deriva la funzionalità della proteina (es. l emoglobina respira ) Queste modificazioni sono spesso indotte (induced fit o adattamento indotto) dalla loro interazione con altre molecole piccole (es. O 2, S, ATP) o grandi (es. altre proteine) che prendono il nome di LIGANDI Interazioni proteina ligando: reversibili, di natura transitoria, permettono risposte rapide a variazioni ambientali e metaboliche: sono regolate Interazioni proteina-ligando: specifiche, la proteina discrimina tra le migliaia di molecole o viceversa: Siti # per Ligandi # Sito di legame del ligando: regione circoscritta della proteina, complementare al ligando per dimensione, forma, carica, natura idrofilica e/o idofobica Una proteina può avere: più siti per lo stesso ligando o più siti per ligandi diversi

3 Ligando della mioglobina (Mb) è l O 2 : L = O 2 ma O 2 è un gas quindi [L] = po 2 in mmhg (Torr) o kpa (1 mm Hg = 0,13 KPa) Equilibrio di dissociazione: MbO 2 Mb + O 2 [Mb] [O 2 ] K d = [1] [MbO 2 ] [MbO 2 ] siti occupati θ = = [2] (o y) [Mb]+[MbO 2 ] siti totali 0 θ 1 0 Y 1 quando [Mb] = [MbO 2 ] K d = [O 2 ] e θ = 0.5 Combinando [1] e [2] si ottiene: po 2 θ = [3] (y) po 2 + K d θ = funzione iperbolica di po 2 (vedi fig. 7.4b) K d = P 50 esprime la pressione parziale di O 2 quando Mb = MbO 2 e quindi Mb è saturata al 50%

4 da: Nelson & Cox 0,13 kpa* * Per kpa vedi Appendice A di Nelson & Cox

5 y 1.0 CURVE DI DISSOCIAZIONE dell O 2 della mioglobina (iperbolica) e dell emoglobina (sigmoide) Mioglobina Emoglobina po 2 mmhg

6 LA CURVA DI DISSOCIAZIONE DELLA MIOGLOBINA HA FORMA DI IPERBOLE, QUELLA DELLA EMOGLOBINA E SIGMOIDE. QUESTO COMPORTA CHE LA MIOGLOBINA HA UNA MAGGIORE AFFINITA PER O 2 : a valori uguali di po 2 i valori di y sono più alti per la MIOGLOBINA Affinità espressa da P 50 a ph 7.2: MIOGLOBINA P 50 =1 mmhg EMOGLOBINA P 50 = 26 mmhg cinetica sigmoide descritta da Hb particolarmente adatta al ruolo di trasportatore di O 2 nel sangue.

7 CURVA DI DISSOCIAZIONE DELL O 2 DALL EMOGLOBINA = OTTIMIZZAZIONE DELLA FUNZIONE Y (θ) P 50 = po 2 nei capillari dei muscoli in attività po 2 mmhg po 2 negli alveoli polmonari In condizioni fisiologiche la P 50 dell emoglobina è 26, valore compreso tra po 2 in tessuti periferici in attività (20 mm di Hg) e po 2 in alveoli polmonari (100 mm di Hg). Importante la pendenza della curva nel tratto rettilineo: questa pendenza fa si che per piccole variazioni di δx (ossia di po 2 ) si abbiano grandi variazioni di δy (ossia di affinità di Hb per O 2 ). Il tratto rettilineo della curva corrisponde alla variazione di po 2 che si ha a livello dei tessuti periferici dove la maggior parte di O 2 deve essere rilasciato.

8 EQUAZIONE DI HILL po 2 y = (3) po 2 + P 50 grafico IPERBOLE È utile ricavare una relazione che dia come grafico una retta, facendo il reciproco della (3) y po = y P 50 da cui ricavando il log di entrambi i termini y log = log po 2 log P 50 1-y y = mx + q si ha l equazione di una retta con pendenza = 1 La relazione (3) non può descrivere il comportamento dell emoglobina la cui cinetica di legame all O 2 è descritta da una curva sigmoide e non iperbolica.

9 E stato visto che se si considera l equilibrio di dissociazione dell emoglobina in un sistema improbabile in cui le uniche specie presenti siano la deossiemoglobina e l emoglobina con 4 molecole di O 2 l equilibrio è: Hb (O 2 ) 4 Hb + 4O 2 da cui [Hb] [O 2 ] 4 K D = [Hb (O 2 ) 4 ] e (po 2 ) 4 Y = (po 2 ) 4 + (P 50 ) 4 da questa relazione si ottiene una curva sigmoide molto più ripida di quella descritta dall emoglobina.

10 Nel 1913 Hill ha dimostrato che la curva di dissociazione della Hb è in accordo con l equazione che deriva dall equilibrio ipotetico in questo caso che si può scrivere anche come Hb(O 2 ) n Hb + no 2 (po 2 ) n y = (po 2 ) n + (P50) n e ricavando il logaritmo y log = n log po 2 n log P50 1-y ponendo in grafico i valori log po 2 e e ricavare la pendenza della retta = n y po 2 n = y P50 y log y y= mx + q si può disegnare la retta n H coefficiente di Hill = esprime il grado di cooperatività di una molecola

11 da: Voet & Voet

12 Diagarmma di Hill per il legame di O 2 alla mioglobina ed emoglobina Y log Y 0 log po 2 Per la mioglobina n H =1.0 le molecole di O 2 si legano indipendentemente l una dall altra Per la emoglobina n H =2.8 valore intermedio tra 1 e 4 che indica l effetto cooperativo massimo di Hb

13 A differenza della mioglobina: L EMOGLOBINA E UNA PROTEINA ALLOSTERICA: allosterico: da allos = altro è cioè regolata da piccole molecole che si legano a siti diversi dal sito di legame del substrato (O 2 ); effettori omotropi ed eterotropi;effetto cooperativo. ciò è dimostrato da: 1) curva di dissociazione in funzione di po 2 MIOGLOBINA iperbolica; EMOGLOBINA sigmoide Sigmoide legame dell O 2 a Hb è COOPERATIVO O 2 EFFETTORE ALLOSTERICO OMOTROPO POSITIVO di Hb 2)Regolazione da effettori allosterici eterotropi : affinità per O 2 dipende da 2-3 DPG, da ph e [CO2] MIOGLOBINA NO ; EMOGLOBINA SI DPG, H +, CO 2 : EFFETTORI ALLOSTERICI ETEROTROPI NEGATIVI

14 da: Nelson & Cox 13kPa = 100 mm Hg 4 kpa = 31,1 mm Hg = muscolo a riposo 2,6 kpa = 20 mm Hg = muscolo in attività

15 Il legame cooperativo dell emoglobina con l O 2 la rende capace di rilasciare il doppio dell O 2 che rilascerebbe se i suoi siti fossero indipendenti: rende l emoglobina un trasportatore più efficiente. Esempio specifico: 1) po 2 muscolo = 20 mm Hg po 2 alveoli = 100 mm Hg (po 2 ) 2.8 P 50 = 26 mm Hg y = n = 2.8 (po 2 ) (P50) 2.8 y alveoli = 0.98 y muscoli = 0.32 Y = ) po 2 muscolo = 20 mm Hg po 2 alveoli = 100 mm Hg po 2 P 50 = 26 mm Hg y = n = 1 po 2 + P50 y alveoli = 0.79 y muscoli = 0.43 y = 0.36

16 H+ e CO2: effettori eterotropi negativi di Hb Nel muscolo che lavora (tessuto periferico) si producono: per la glicolisi aerobia : CO2 per la glicolisi anaerobia : acido lattico L acido lattico è dissociato: CH 3 CH 2 OHCOO - H + H+ aumenta; il ph ambientale diminuisce: questo fa diminuire l affinità di Hb per O 2 e favorisce la dissociazione di O 2 da Hb O 2. Anche l aumento di CO 2 : diminuisce l affinità di Hb per O 2 e favorisce la dissociazione di O 2 da HbO 2

17 1) L affinità di Hb per O 2 dipende dal ph e da CO 2 Il ph del sangue nei polmoni è 7.6 e nei tessuti scende a 7.2 Le misure sperimentali di legame dell ossigeno all emoglobina sono spesso effettuate a ph 7.4

18 L acidità aumenta il rilascio di O 2 dall emoglobina: la diminuita affinità di Hb per O 2 in seguito all abbassamento di ph si esprime cineticamente con lo spostamento della sigmoide verso destra e con l aumento della pendenza del suo tratto rettilineo. (mm Hg)

19 Alte [CO 2 ] e [H + ] sono caratteristiche dei tessuti ad elevato metabolismo come il muscolo che si contrae Es.Tessuto muscolare a riposo Es.Tessuto muscolare in attività 66 % Quando l emoglobina raggiunge una regione a ph più basso rispetto a quello dei polmoni, la sua tendenza a rilasciare ossigeno, imputabile alla minore po 2 locale, aumenta. A) Nei tessuti periferici una diminuzione del ph da 7,4 (curva rossa) a 7,2 (curva blu) determina il rilascio di O 2 nei capillari. Anche l aumento della pressione parziale di CO 2 da 0 a 40 mmhg (curva viola) favorisce il rilascio di O 2.

20 B) Nei capillari alveolari si ha l effetto opposto: l aumento di [O 2 ] fa staccare H+ e CO 2. L insieme di A) e B) si chiama EFFETTO BOHR

21 da: Stryer

22 Hb TRASPORTA CO 2, COME? RESPIRAZIONE: per ogni O 2 consumata 0.8 CO 2 prodotta Due meccanismi di trasporto: a) la CO 2 è trasportata dalla Hb sotto forma di CARBAMMATO - i gruppi α-aminici privi di carica (25% a ph 7.4) delle catene β sono in grado di reagire reversibilmente con la CO 2 R-NH 2 + CO 2 R-NHCOO - + H + I carbammati formano legami salini che ulteriormente stabilizzano la forma T Il legame con la CO 2 abbassa l affinità di Hb per O 2, viceversa la CO 2 si lega più fortemente alla deossiemoglobina che alla ossiemoglobina

23 b) la maggior parte della CO 2 è trasformata in bicarbonato all interno dei globuli rossi da un enzima: l Anidrasi Carbonica (E) E CO 2 + H 2 O HCO 3- + H + La maggior parte degli H+ che si formano è legato dalla deossiemoglobina. Il pk a di alcuni gruppi deve aumentare (diventano più basici) nel passaggio da ossi a deossi Hb per permettere il legame con H +. Questo legame contribuisce a tamponare il ph dei tessuti metabolicamente attivi.

24 Basi chimiche dell effetto Bohr Nella deossiemoglobina, qui rappresentata, tre residui amminoacidici formano due ponti salini che stabilizzano la struttura quaternaria T. La formazione di uno dei due ponti salini dipende dalla presenza di un protone addizionale sull istidina β 146. La prossimità della carica negativa sull aspartato 94 favorisce la protonazione dell istidina β 146 nella deossiemoglobina.

25 Ricordiamo i legami salini che irrigidiscono e rendono più compatta la forma T : 8 legami di cui - 4 coinvolgono i gruppi COO - terminali: 2 intercatena e 2 intracatena Figura 7.9 (b)

26 2) L affinità di Hb per O 2 dipende da DPG (polifosfato organico) L affinità dell Hb per l O 2 all interno del globulo rosso è molto minore di quella dell Hb in soluzione. Nell uomo e in molte altre specie nei globuli rossi il DPG è presente ad una [ ] molare molto simile alla [Hb]. y DPG DPG - DPG P 50 = 1 mm Hg + DPG P 50 = 26 mm Hg po 2 mmhg

27 Ha una enorme importanza fisiologica: in sua assenza l Hb rilascerebbe pochissimo O 2 ai tessuti dove po 2 = 20 mm Hg 2-3 difosfoglicerato Il DPG si lega alla deossi Hb (cavità centrale della molecola) e non alla ossi Hb (cavità centrale ristretta) Il legame di O 2 e di DPG si escludono a vicenda: Hb DPG + 4O 2 Hb (O 2 ) 4 + DPG La scoperta del ruolo del DPG nel trasporto dell O 2 ha permesso di chiarire molte osservazioni, per es. l adattamento ad alta quota.

28 da: Nelson & Cox Adattamento ad alta quota. 20 mmhg= 2,6 kpa L adattamento consiste nell aumento di DPG con conseguente aumento della sigmoidicità della curva = aumento della ripidità del tratto rettilineo = aumentato rilascio di O 2

29 L emoglobina fetale Hb F (α 2 γ 2 ) L emoglobina fetale ha alta affinità per O 2. In condizioni fisiologiche ha una maggiore affinità per O 2 della Hb A. Ciò rende possibile il passaggio dell O 2 dal sangue materno a quello fetale, a livello della circolazione placentare. Spiegazione: l Hb F lega il DPG più debolmente della Hb A per cui ha una affinità per O 2 più alta: infatti in assenza di DPG le curve delle due Hb si invertono. Perché?

30 perché nella Hb F (γ) His 143 Ser: il legame col DPG è più debole per 2 cariche positive in meno Subunità β Subunità β da: Styer L.

31 MODELLI PER SPIEGARE L EFFETTO COOPERATIVO MODELLO CONCERTATO O SIMMETRICO O DI MONOD, In assenza di O 2 esistono le forme T ed R in equilibrio: 2. L equilibrio è spostato verso la forma T che è la meno affine a O 2 3. Il legame di una molecola di O 2 a una subunità di T trasforma tutto il tetramero in R: questo significa che è possibile solo un effetto cooperativo positivo Da: Strayer L.

32 MODELLO SEQUENZIALE O DI KOSHLAND 1. In assenza di O 2 esiste solo la forma T 2. Il legame di una molecola di O 2 a una subunità di T altera la conformazione solo di quella subunità 3. La subunità che ha subito un cambio conformazionale stabilisce nuovi contatti con le altre subunità che possono favorire o sfavorire il legame del ligando (sono possibili effetti cooperativi positivi e negativi) può far Da: Strayer L.

33 Nelson & Cox: Appendica A pag Atm = 758 torr = 758 mm Hg = 1,01 x 10 5 Pascal = 1,01 x 10 2 kpa 1,01 x 102 kpa = 0,1333 kpa 758 torr quindi: 1 mm Hg = 0,13 kpa

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35 da: Voet & Voet 2007

36 Descrizione in termini quantitativi della interazione: (P) PROTEINA LIGANDO (L) All equilibrio P + L PL la cui K a è [ PL ] [1] K a = K a = costante di associazione [P] [L] K a misura l affinità del L per la P; K a si esprime in M -1 K a elevato = grande affinità di L per P; [PL] K a [L] = [P] Quando [L] è >> [P] [L] si può assumere resti costante; ciò avviene quasi sempre nella cellula. Equilibrio di legame: definiamo siti di legame occupati [PL] [2] θ = = siti di legame totali [PL] + [P]

37 Sostituendo K a [P] [L] a [PL] e dividendo per [P] e K a avremo: K a [L] [P] K a [L] [L] [3] θ = = = K a [L] [P] + [P] K a [L]+1 [L] + 1 K a [L] Il grafico di θ = [L] descrive un iperbole rettangolare (vedi fig. 7.4) K a θ è una funzione iperbolica di [L]

38 Molto spesso in biochimica è più utile considerare la dissociazione di un ligando: [PL] [P] [L] e di conseguenza, K d ossia la K di dissociazione [P] [L] 1 [4] K d = cioè K d = ---- si esprime in M [PL] K a Quando [PL] = [P] da [2] da [4] [PL] [P] θ = = = 0.5 K d = [L] [PL] + [P] [2P] K d è il valore di [L] quando θ = 0.5 [5] (vedi fig. 7.4a)