Dispersione dei raggi X

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1 Dispersione dei raggi X Nello studio delle proprietà strutturali di macromolecole, le tecniche più potenti sono quelle basate sulla dispersione dei raggi X. Attraverso la cristallografia dei raggi X si può determinare la struttura terziaria di proteine o di acidi nucleici con una risoluzione minore di 3 Å. Per sistemi meno ordinati, come fibre o aggregati lipidici, la diffrazione dei raggi X fornisce utili informazioni strutturali. Per macromolecole biologiche in soluzione, la diffusione (scattering) dei raggi X permettere di ottenere informazioni sulla forma e le dimensioni delle particelle.

2 I raggi X Da un punto di vista classico, sono onde elettromagnetiche con lunghezza d onda λ compresa tra 0.1 e 100 Å. Da un punto di vista quantistico, sono fotoni con energia E = hν = hc/λ compresa tra 0.1 e 100 KeV (1 KeV = J). Normalmente vengono generati bombardando una targhetta di metallo (es. Cu o Mo) con elettroni di energia circa 10 KeV. Questi elettroni riescono a strappare gli elettroni degli orbitali più interni (guscio K) degli atomi. La vacanza viene rapidamente riempita attraverso la transizione di un elettrone atomico proveniente dai gusci più esterni (M e L). λ Kα = hc E L E K λ Kβ = hc E M E K

3 Espulsione elettrone espulso M L K elettrone deviato elettrone accelerato

4 Transizione M L hν K

5 Numeri complessi z = a + ib i = 1 a b z = a 2 + b 2 z = a ib z z = z 2 z = z (cos α + i sin α) cos α = a z sin α = b z a e b numeri reali unità immaginaria parte reale parte immaginaria modulo complesso coniugato

6 Relazione di Eulero e iα = cos α + i sin α Relazione di Eulero z = z e iα Notazione esponenziale e iα è nota come fase del numero complesso Pertanto una funzione periodica seno o coseno può essere espressa con un esponenziale complesso. Combinare gli esponenziali è più semplice che combinare le funzioni trigonometriche e i(x+y) = e ix e iy cos(x + y) = cos x cos y sin x sin y

7 Campo elettromagnetico [ ( )] E(r, t) = E 0 cos 2π ˆk r λ νt + δ E(r, t) = E 0 e 2πi(ˆk r/λ νt+δ) Notazione reale Notazione esponenziale t E 0 ˆk λ ν δ tempo ampiezza massima vettore unitario nella direzione di propagazione lunghezza d onda frequenza ˆk fase r origine t = 0 t > 0

8 Differenza di fase Consideriamo due onde che differiscono solo nella fase e che si sommano E 1 (r, t) = E 0 e 2πi(ˆk r/λ νt+δ 1 ) E 2 (r, t) = E 0 e 2πi(ˆk r/λ νt+δ 2 ) = E 1 (r, t)e 2πiδ δ = δ 2 δ 1, spostamento di fase E 1 (r, t) + E 2 (r, t) = E 1 (r, t)(1 + e 2πiδ ) Se δ = 1/2 (mezzo ciclo) 1 + e 2πiδ = 0

9 Esempio E 1 E 2 E 1 (1 + e 2πiδ ), δ = 0 E 1 E 2 E 1 (1 + e 2πiδ ), δ = 1 4 E 1 E 2 E 1 (1 + e 2πiδ ), δ = 1 2

10 Processo elementare di scattering rivelatore sorgente ŝ 0 ŝ 2θ Un elettrone è posto al centro del sistema di riferimento. Un fascio collimato di raggi X lo colpisce. Nel caso di scattering elastico (scattering Thompson), l elettrone è in grado di deviare il fascio in tutte le direzioni. ŝ 0 vettore unitario nella direzione del fascio incidente ŝ vettore unitario nella direzione del fascio deviato 2θ angolo di scattering

11 Scattering da due elettroni ŝ 0 ŝ r ŝ 0 ŝ La distanza r è molto più piccola della distanza tra gli elettroni e la sorgente e della distanza tra il rivelatore e gli elettroni

12 Differenza di fase r ŝ 0 ŝ r ŝ 0 r ŝ differenza di cammino = r ŝ r ŝ 0 Si può calcolare la differenza di fase tra i due fasci deviati δ = 1 λ r (ŝ ŝ 0)

13 Vettore di scattering ŝ Q 2θ ŝ 0 Conviene definire un nuovo vettore Q 2π λ (ŝ ŝ 0) 2πδ = Q r Q = 4π λ sin θ corrisponde alla quantità di moto trasferita modulo di Q

14 Fattore di struttura di un elettrone Ampiezza delle due onde deviate dai due elettroni sin Ψ Elettrone all origine (scattering Thomson) E(Q) r 0 R E 0 Elettrone in r E(Q)e iq r r 0 raggio classico dell elettrone, R distanza tra elettrone e rivelatore, Ψ angolo tra r e la direzione di polarizzazione. Il fattore di struttura di un elettrone in r è definito dal rapporto tra l ampiezza dell onda diffusa dallo stesso elettrone e quella diffusa dall elettrone posto all origine. Si ha pertanto f(q) e iq r

15 Fattore di struttura di un atomo Per un atomo il fattore di struttura sarà dato dal contributo di tutti gli elettroni f(q) = d 3 rρ(r)e iq r ρ(r), densità elettronica Quest ultima equazione è una trasformata di Fourier. Il fattore di struttura di un atomo è quindi la trasformata di Fourier della sua densità elettronica. Trasformata di Fourier inversa ρ(r) = 1 (2π) 3 d 3 Qf(Q)e iq r

16 Proprietà del fattore di struttura f(0) = d 3 rρ(r) Z Numero atomico E un numero complesso, costituito pertanto da una parte reale ed una immaginaria, oppure da un modulo e una fase. Il rilevatore è in grado di misurare non l ampiezza, ma l intensità della radiazione diffusa. Avendo adottato la notazione complessa, l intensità dipende dal quadrato del numero complesso, e quindi soltanto dal modulo di f(q)

17 Sezione d urto differenziale Per un fascio di raggi X non polarizzato si definisce la sezione d urto differenziale dσ dω (Q) come il rapporto tra l energia diffusa per unità di tempo e l energia incidente per unità di tempo e di area, ( dσ 1 + cos 2 ) dω (Q) = (2θ) r2 0 f(q) f (Q) 2 ( 1 + cos = r0 2 2 ) (2θ) f(q) 2 2

18 Rappresentazione di Fourier della δ(q) di Dirac Estensione a tre dimensioni della δ(x) δ(q) = { 0 Q 0 Q = 0 Rappresentazione di Fourier δ(q) = 1 (2π) 3 d 3 r e iq r

19 Fattori di struttura atomici Con buona approssimazione, la densità elettronica di un atomo ha una simmetria sferica, ρ(r) ρ(r), dove r (r, θ, φ) I fattori di struttura diventano funzioni reali che dipendono soltanto dal modulo Q f(q) = 0 = 4π r 2 dr π trasformata di Fourier isotropa 0 0 sin θdθ 2π 0 r 2 drρ(r) sin(qr) Qr dφ ρ(r) e iq r f(q)

20 Esempio H C P S 14 N Cl 12 O K f(q) 10 8 Na Q (Å 1 )

21 Fattore di struttura di una molecola In generale, dovremo prendere in rassegna tutti gli elettroni. ottiene F (Q) = d 3 rρ(r)e iq r Si ρ(r), densità elettronica molecolare D altra parte gli elettroni sono concentrati negli atomi. Sia N il numero totale di atomi. L atomo n-esimo si troverà nella posizione r n. Il suo fattore di struttura dovrà essere moltiplicato per la fase corrispondente e iq r n. Si ha dunque F (Q) = N f n (Q)e iq r n n=1

22 Scattering di due atomi Gli atomi sono identici, il loro fattore di struttura è f(q). Il primo è nell origine, l altro in a F (Q) = f(q) (1 + e iq a ) Calcoliamo la sezione d urto differenziale ( dσ 1 + cos 2 ) dω (Q) = (2θ) r2 0 F (Q) F (Q) 2 ( 1 + cos = r0 2 2 ) (2θ) f 2 (Q)(1 + e iq a )(1 + e iq a ) 2 ( 1 + cos = r0 2 2 ) (2θ) 2f 2 (Q)[1 + cos(q a)] 2 Ci sono due termini, uno deriva dai singoli atomi, l altro tiene conto della loro distanza

23 Scattering di un reticolo monodimensionale di atomi a 0 Sia a il vettore traslazione e sia N il numero totale di atomi, tutti identici. Si ha F (Q) = f(q) N n=1 e i(n 1)Q a sin = e i(n 1)Q a 2 f(q) sin ( N Q a 2 ( Q a 2 ) )

24 Sezione d urto differenziale dσ dω (Q) = r2 0 S(Q) = ( 1 + cos 2 ) (2θ) F (Q) F (Q) 2 ( 1 + cos = r0 2 2 ) (2θ) f 2 (Q)S(Q) 2 ( ) sin N Q a 2 2 ) sin ( Q a 2 funzione d interferenza

25 N = N 2 [f(q)] 2 S(Q) S(Q)[f(Q)] Q a 2π 1 2 3

26 N = 2 45 N 2 [f(q)] 2 40 S(Q) 35 S(Q)[f(Q)] Q a 2π 1 2 3

27 N = N 2 [f(q)] S(Q) 140 S(Q)[f(Q)] Q a 2π 1 2 3

28 N = N 2 [f(q)] 2 S(Q) S(Q)[f(Q)] Q a 2π 1 2 3

29 Condizione di van Laue Si nota che se Q a 2π è un numero intero, S(Q) = N 2. Quando N è molto grande, i picchi diventano molto alti e stretti. In sostanza, solo certe orientazioni tra il cristallo monodimensionale e Q danno luogo a un segnale diverso da zero. Questa condizione è nota come la condizione di van Laue Q a = h h = 0, ±1, ±2,... 2π (ŝ ŝ 0 ) a = h h = 0, ±1, ±2,... λ

30 Piani paralleli 2π a 2π a 2π a 2π a a Q a h = 2 h = 1 h = 1 2π = h h = 0 h = 2

31 Sfera di Ewald 2π λ ŝ ŝ 0 Q

32 Caso a e ŝ 0 paralleli 2π a 2π a 2π a 2π a 2π a ŝ Q 2π λ a ŝ 0 h = 5 h = 4 h = 3 h = 2 h = 1 h = 0

33 Caso a e ŝ 0 perpendicolari a 2π a h = 2 h = 1 h = 0 2π λ ŝ ŝ 0 Q 2π a 2π a 2π a h = 1 2π a h = 2

34 Reticolo bidimensionale R = n a a + n b b n a,b = 0, ±1, ±2,... R b a

35 Reticolo tridimensionale I 14 reticoli di Bravais, R = n a a+n b b+n c c, con n a,b,c = 0, ±1, ±2,...

36 Scattering di un reticolo tridimensionale di atomi E un estensione del caso monodimensionale. Siano a, b e c i tre vettori traslazione del reticolo. Il fattore di struttura risulta F (Q) = f(q) e iq (naa+nbb+ncc) n a n b n c Condizioni di van Laue: F (Q) è diverso da zero solo quando Q a = 2πh h = 0, ±1, ±2,... Q b = 2πk k = 0, ±1, ±2,... eiq R = 1 Q c = 2πl l = 0, ±1, ±2,... h, k, l sono gli indici di Miller

37 Definizione di F h,k,l Quando le tre condizioni sono rispettate, risulta allora F (Q h,k,l ) = f(q h,k,l ) 1 n a n c Si scrive allora F (Q h,k,l ) F h,k,l = Nf(Q h,k,l ) n b dove N è il numero totale di atomi nel reticolo. Il fattore di struttura atomico viene campionato soltanto per determinati valori di Q, quelli che obbediscono alle condizioni di von Laue.

38 Cristallo Un cristallo molecolare è un reticolo di Bravais in cui nelle posizioni reticolari sono presenti una o più molecole Reticolo + Base = Cristallo

39 Esempio 1 R b a + =

40 Esempio 2 R b a + =

41 Scattering da un cristallo molecolare Applicando il teorema della convoluzione, si dimostra che il fattore di struttura risulta F (Q) = F m (Q) e 2πi(nah+nbk+ncl) = F h,k,l = NF m (Q h,k,l ) n a n c n b dove F m (Q) è il fattore di struttura molecolare della cella unitaria F m (Q) = j f j (Q)e iq r j r j vettore del j-esimo atomo nella cella unitaria

42 F h,k,l di un cristallo molecolare Possiamo esprimere il vettore r j in termini dei vettori di cella r j = x j a + y j b + z j c Si ha pertanto F m (Q) = j f j (Q)e iq (x ja+y j b+z j c) Applicando le condizioni di van Laue si ottine infine F h,k,l = j f j (Q)e 2πi(hx j+ky j +lz j ) Rappresenta lo scattering della cella unitaria campionato nei punti reticolari h, k, l.

43 Il reticolo reciproco Nello spazio reale, il reticolo rappresenta l insieme delle posizioni che si ripetono a distanze regolari. Si può dimostrare che nello spazio reciproco, lo spazio del vettore di scattering Q, i punti che rispettano le tre condizioni di von Laue costituiscono, a loro volta, un reticolo, il reticolo reciproco. I tre vettori del reticolo reciproco risultano a = 2π b c V b = 2π c a V c = 2π a b V dove V = a b c è il volume della cella unitaria. Il simbolo rappresenta il prodotto vettoriale e il simbolo il prodotto scalare. I valori di Q che appartegono al reticolo reciproco si calcolano dalla relazione Q h,k,l = ha + kb + lc

44 Esempio

45 Scattering di un reticolo 3D

46 Esempio: Lisozima

47 Densità elettronica La densità elettronica all interno della cella unitaria si calcola attraverso l antitrasformata di Fourier del fattore di struttura. Tenendo conto delle condizioni di van Laue, si ottiene ρ(r) = 1 NV h= k= l= F h,k,l e 2πi(hx+ky+lz) dove r = (x, y, z) è il vettore nello spazio diretto. Tuttavia dagli esperimenti si possono calcolare soltanto i moduli F h,k,l ma non le fasi e iφ. Il problema delle fasi è uno dei più grandi ostacoli della cristallografia.

48 Centro di simmetria Se la densità elettronica possiede un centro di simmetria, ρ(r) = ρ( r) Si dimostra che F h,k,l è un numero reale, per cui e iφ = ±1 ovvero c è solo incertezza sul segno. Per n fattori di struttura, 2 n possibili scelte

49 Metodo delle sostituzioni isomorfe multiple 1. Si preparano differenti cristalli della macromolecola biologica con sostituzioni isomorfe di alcuni atomi con atomi pesanti. 2. Si tenta di trovare la locazione degli atomi pesanti nel cristallo (metodo di Patterson) 3. Si calcola il fattore di struttura degli atomi pesanti F (H) h,k,l = j=atomi pesanti f j (Q)e 2πi(hxj+kyj+lzj) = F (H) h,k,l eiφ h,k,l 4. Si assegnano le fasi degli atomi pesanti φ h,k,l alle fasi dei fattori di struttura totali con gli stessi h, k, l. 5. Si calcola quindi la densità elettronica totale e da questa una nuova posizione degli atomi pesanti. Si torna quindi allo step Dalla struttura ricavata si calcolano gli F h,k,l di tutti cristalli isomorfi e da queste le densità elettroniche. 7. Si torna quindi allo step 2 e si ripete la procedura per tutti i cristalli isomorfi disponibili.

50 Dal cristallo alle polveri 1

51 Dal cristallo alle polveri 2

52 Coni di diffrazione Il campione è costituito da grani policristallini con orientazione casuale I fasci diffratti si dispongono in coni

53 Diffrazione da polveri

54 Confronto intensità diffratte

55 La legge di Bragg E una formulazione equivalente alle condizioni di van Laue. Si può dimostare che ad ogni vettore Q h,k,l del reticolo reciproco corrisponde una famiglia di piani nel reticolo diretto che contengono i punti reticolari e che si trovano a distanza d h,k,l = 2π Q h,k,l La legge di Bragg mette in relazione il valore di d h,k,l con l angolo di scattering 2θ e la lunghezza d onda 2d h,k,l sin θ = nλ n = ±1, ±2,... ordine di diffrazione Questa formulazione è più utile per descrivere la diffrazione.

56 Analisi di un picco di diffrazione

57 Informazioni ottenibili Posizione dei picchi: Analisi strutturale Distanze interplanari Intensità di più fasi Cella cristallografica Analisi quantitativa Determinazione di fase Larghezza dei picchi Analisi qualitativa Intensità dei picchi: Dimensione dei cristalliti Intensità di una fase Deformazione dei cristalliti

58 Diffrazione di sistemi lipidi/acqua I sistemi lipidi/acqua sono in grado di generare numerose fasi, in funzione della concentrazione, della temperatura o della pressione. La caratteristica fondamentale di tali sistemi è la tendenza a segregare la parte polare e quella apolare delle molecole in regioni distinte Come diretta conseguenza, in fase acquosa si formano stutture ordinate a lungo raggio, in una due o tre dimensioni.

59 Fasi lipidiche Lamellari Esagonali Cubiche

60 Diffrazione di fasi lipidiche Le fasi lipidiche sono strutturalmente analoghe a sistemi policristallini di reticoli in una, due o tre dimensioni. Da uno spettro di diffrazione dei raggi X è dunque possibile risalire alla identificazione delle fasi presente e alla determinazione della loro struttura (parametri di cella) La simmetria del reticolo si riflette infatti in una serie di riflessioni di Bragg che nello spazio reciproco hanno un caratteristico rapporto di posizioni.

61 Valori di Q permessi per fasi lipidiche Fase Q Rapporti di spaziatura Lamellare Q h = 2π d h 1 : 2 : 3 : 4... Esagonale Q hk = 4π 3a h 2 + k 2 hk 1 : 3 : 4 : 7 : Cubica Q hkl = 2π a h 2 + k 2 l 2 Ia3d (Q 230 ) 6 : 8 : 14 : 16 : 20 : 22 : Pn3m (Q 224 ) 2 : 3 : 4 : 6 : 8 : 9 : Im3m (Q 229 ) 2 : 4 : 6 : 8 : 10 : 12 : Pm3n (Q 223 ) 2 : 4 : 5 : 6 : 8 : 10 : Fd3m (Q 227 ) 3 : 8 : 11 : 12 : 16 : 19 : P (Q 212 ) 2 : 3 : 5 : 6 : 8 : 9 : 10...

62 Analisi delle intensità Assegnata la fase, ad ogni picco di diffrazione è possibile assegnare gli indici h, k, l (indicizzazione). Per effetto della simmetria, alcune terne h, k, l possono portare allo stesso Q h,k,l, perciò si definisce la molteplicità della riflessione m h,k,l La maggior parte delle fasi lipidice sono centrosimmetriche, ovvero ρ(r) ρ( r). Si ha pertanto Problema delle fasi F h,k,l = ± I h,k,l m h,k,l

63 Soluzione con metodi indiretti 1. Da informazioni sulla molecola di lipide e da considerazioni di simmetria si costruisce un modello di densità elettronica 2. Dalla densità elettronica modello si calcolano i fattori di struttura e quindi le intensità 3. Si confrontano le intensità teoriche con quelle sperimentali 4. Si modifica il modello di densità elettronica e si ritorna allo step numero 1 finché l accordo tra intensità teorica e sperimentale (step 3) è considerato accettabile

64 Esempio fase lamellare ρ(z) d F h F (Q h ) = ρ(z) cos(q h z) dz Q h = 2π h d h = 1, 2, 3, z Metodo dello swelling. Si ipotizza che, diluendo il lipide, ρ(z) non cambi, ma cambi soltanto d: il fattore di struttura viene campionato in diversi valori di Q