Coagulazione del sangue

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Giacinta Riva
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1 Coagulazione del sangue Attivazione sequenziale di proteine (fattori della coagulazione) circolanti in forma inattiva Formazione di un reticolo di fibrina che intrappola gli elementi corpuscolati del sangue Fattori della coagulazione Zimogeni/serin-proteasi: FVII, FIX, FX, FXI, PT Cofattori non enzimatici: FV e FVIII Proteina strutturale: fibrinogeno

2 Cascata coagulativa Danno tissutale TF trombina TF/FVIIa FXIa FXI TF/FVII FVIIa, FIXa, FXa FIX FIXa FIX VIA INTRINSECA (PROPAGAZIONE) TF/FVIIa FVIIIa FXa trombina FVIII FX FXa FX VIA ESTRINSECA (INIZIO) FVa FXa trombina FV PT TROMBINA AMPLIFICAZIONE!!!

3 Fibrin clot

4 General Characteristics of the Coagulation Cascade The predominant mechanism illustrated in the activation pathway is that of an enzyme amplification cascade. One enzyme at the start of the activation pathway can activate many molecules of a given substrate

5 COAGULAZIONE Fattori coagulativi Inibitori fisiologici

6 FATTORI COAGULATIVI fattore PM Gene(Kb) Cromos. funzione XIII 320,000 Stab.fib XII 80, zimogeno XI 160, zimogeno IX 56, X zimogeno VII 50, zimogeno VIII 330, X cofat. V 330,000 7,0 1 cofat. X 56, cofat. II 72, zimogeno I 340,000 4 strut.

7 1- enzimi della coagulazione sono simili alle proteasi digestive tripsina e chimotripsina: proteasi seriniche -dominio catalitico C-terminale: simile tripsina dominio N-terminale: specifico

8 Dominii proteici nei fattori della coagulazione

9 FVII FIX IA IB II II I IV V VI VI I VI II I II II I IV V VI VI I VI II pep tide segnale dom ini o Gla arom atic stack FX PC I I II II II I II I IV IV V V VI VI VI I VI I VI II VI II EGF at tivazion e dom ini o cata litico do minio Krin gle repeat Protrom bina II I II II I II I IV IV V V VI VI VI I VI I VI II IX VI II X IX XI X XI I XI XI II XI I XI V XI II XV XI V regione om ologa alla fibron ectina I regione om ologa alla fibron ectina II FXI I II II I IV V VI VI I VI II IX X XI XI I XI II XI V FXII Struttura genica e pro teica di serina proteasi della coagulazio ne

10 IL FATTORE TISSUTALE Proteina transmembrana che serve come recettore di superficie e cofattore essenziale per il FVIIa Legandosi il TF al FVIIa il complesso TF-FVIIa acquista attività catalica e attiva i fattori X e IX Presente sulle membrane dei fibroblasti, cellule tumorali. In condizioni normali non presente nella membrana di monociti e cellule endoteliali, nelle quali però può essere espresso a seguito diversi stimoli

12 Agenti in grado di indurre l espressione di TF sulle cellule endoteliali Virus, batteri Endotossine Complessi immuni Proteina C reattiva Interleuchine (IL-1, TNF) Trombina

20 Plateletadhesion/activation and coagulation are stronglyinterconnected

Real-time Observation of Thrombus Formation: Cremaster laser injury model Preparation of mouse-isolate cremaster muscle Injection of antibodies (Alexa-555

fibrin deposition (clot formation) is monitored over time Argon-Krypton Laser WIDEFIELD Image Intensifier CCD camera CONFOCAL CCD camera Confocal Scanner Image

21 Real-time Observation of Thrombus Formation: Cremaster laser injury model Preparation of mouse-isolate cremaster muscle Injection of antibodies (Alexa-555 anti-cd41;gbiib/iiia-platelet recognition and Alexa-488 anti-fibrin) Laser injury to cremaster artery heat injury to vessel wall Accumulation of labeled platelets and fibrin deposition (clot formation) is monitored over time Argon-Krypton Laser WIDEFIELD Image Intensifier CCD camera CONFOCAL CCD camera Confocal Scanner Image Intensifier Filterwheel Pulse Nitrogen Dye Laser Epi-illumination Port Excitation Wavelength Changer HD G's Xenon Lamp Transmission Lamp Uniblitz Shutter Piezo- Electric Driver Image Analyser

22 Real-time in vivo imaging of thrombus formation 4x speed Platelets Fibrin 4x speed Vessel Injury WT littermate: 6-8 weeks HB, Balb/C: 6-8 weeks Dose: 90 µg/kg FXa I16L Platelet accumulation Fibrin deposition (at old injury site)

23 Possiamo monitorare l andamento di una reazione a cascata così complessa?? USO DI SUBSTRATI CROMO e FLUOROGENICI

Thrombin Generation Assay TF, phospholipids and Ca 2+ Plasma Coagulation pathway FII FIIa Excitation: 360 nm Emission: 465 nm Thrombin fluorogenic substrate

24 Thrombin Generation Assay TF, phospholipids and Ca 2+ Plasma Coagulation pathway FII FIIa Excitation: 360 nm Emission: 465 nm Thrombin fluorogenic substrate Fluorescence thrombin H-D-CHA-Ala-Arg-AMC.2AcOH H-D-CHA-Ala-Arg-OH + AMC H 2 O H-D-cyclohexylalanyl-alanine-arginine-7-amino-4-methylcoumarin.diacetate salt

25 Thrombin generation 150 Peak Height nm Thrombin Area under Curve (ETP) lag time time to peak Minutes

26 Standard Curve in FVII deficient Plasma (G.K) PNP 1 GK0 GK 0,25% GK 0,5% GK 1% GK 2% GK 4% FVII depl.plasma -100

27 1) Cosa previene l attività incontrollata delle serin proteasi? 2) quali sono i determinanti di specificità di queste interazioni precise e coordinate?

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