GENOMICA FUNZIONALE:

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1 GENOMICA STRUTTURALE: GENOMICA FUNZIONALE: 1. Anatomia dei genomi 10. Funzionamento dei genomi Il genoma dei procarioti Modificazioni della cromatina e l espressione del genoma Il genoma degli eucarioti Microarray e RNA-seq 2. La mappatura dei genomi Metil-seq Mappatura genetica Chip-seq Mappatura fisica 3. Il sequenziamento automatico del DNA Il principio del sequenziamento secondo Sanger Il sequenziamento su larga scala La lettura dei tracciati di sequenziamento 4. Il sequenziamento del genoma I nuovi metodi di sequenziamento Il sequenziamento gerarchico Il sequenziamento shogun Piattaforme di sequenziamento di interi genomi (NGS) III Generation Sequencing 5. Assemblaggio e annotazione del genoma Copertura del genoma Phrap/Consed Approccio Overlap-Layout-Consensus La verifica delle sequenze Le caratteristiche funzionali delle sequenze genomiche 6. I Progetti Genoma 7. La metagenomica 8. Nutrigenomica 9. Genotipizzazione Gli SNP e la variazione La genotipizzazione degli SNP

2 Che cosa significare genotipizzare? Analizzare le variazioni nella sequenza di DNA genotipo = la costituzione genetica di un individuo

3 Genotyping Analysis of DNA-sequence variation Human DNA sequence is 99.9% identical between individuals varying nucleo@des Polymorphism: normal variation between individuals (frequency > 1% of population) Genetic variation May cause or predispose to inheritable diseases Determines e.g. individual drug response Used as markers to identify disease genes

4 Allele forma alternativa di un gene o sequenza di DNA, in una determinata posizione cromosomica (locus) in ciascun locusun individuo possiede 2 alleli, uno ereditato dal padre, uno dalla madre genotipo: è la somma dei due alleli in tutte le posizioni

5 POLIMORFISMO GENETICO Un sito viene definito polimorfico se di esso si conoscono almeno due forme alleliche la più rara delle quali ha una frequenza di almeno l 1%

6 SNP markers Single Nucleotide Polymorphism GTGGACGTGCTT[C/T]TCGATTTACG

7 ATAGACG ATAGACG ATACACG ATACACG ATAGACG ATACACG Omozigote Eterozigote

8 ... SNP markers È il polimorfismo più semplice Altamente abbondante; uno SNP ogni 1000 bp nel genoma umano La maggior parte non alterano le funzioni cellulari Largamente usati come marcatori

9 A) Metodiche classiche per l identificazione di Polimorfismi Metodi enzimatici Sequenziamento del DNA(metodo Sanger) Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP) Flap endonucleasi(fen) Primer extension(sbe) Oligonucleotide ligase assay(ola) Metodi basati sulle proprietà fisiche del DNA Denaturing Gradient Gel Electrophoresis(DGGE) Single Stranded Conformation Polymorphism(SSCP) Denaturing high performance liquid chromatography(dhplc) Metodi basati sull ibridazione 5 nuclease assay(taqman assay) Allele-Specific Oligonucleotide Hybridization(ASO) Dynamic Allele-Specific Hybridization(DASH) Molecular beacons

10 B) High-throughput SNP genotyping Metodi enzimatici Sequenziamento del DNA(metodo Sanger) Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP) Flap endonucleasi(fen) Primer extension(sbe) Oligonucleotide ligase assay(ola) Metodi basati sulle proprietà fisiche del DNA Denaturing Gradient Gel Electrophoresis(DGGE) Single Stranded Conformation Polymorphism(SSCP) Denaturing high performance liquid chromatography(dhplc) Metodi basati sull ibridazione 5 nuclease assay(taqman assay) Allele-Specific Oligonucleotide Hybridization(ASO) Dynamic Allele-Specific Hybridization(DASH) Molecular beacons

11 Matched Mis-matched Probe and Target C allele T allele Primer Extension Single Base Extension +ddgtp +ddttp +ddatp +ddctp target dc G C incorporated A C fails to incorporate ASO sonda marcata DASH syber green C target C G hybridize A fails to hybridize Oligonucleotide Ligation C target ligate C G A fails to ligate TaqMan C target degrade C G C A fails to degrade C Molecular Beacons target C hybridize G A fails to hybridize

12 Multiplexing Test multipli che permettono la caratterizzazione simultanea di centinaia / migliaia di SNPs in un unica reazione SBE/ibridazione basata sugli array SNP microarray A A T C G C C T G T A C C G T A G T A A G T A T A C G C A A G A A G T C

13 Illumina Genotyping Infinium(Single Base Extension or Primer Extension) Million SNPs for standard SNP projects association study GoldenGate(Allele Specifc Primer Extension) SNPs for custom and standard SNP projects standard panel: mouse, linkage, MHC panels custom panel: cancer SNP panel

14 Single base extension Single base extension Infinium II Infinium I

15 GoldenGate Allele Specifc Primer Extension

16 Allele-Specific Extension and Ligation Polymerase Ligase Genomic DNA [T/C] [T/A] Allele Specific Extension & Ligation Universal PCR Sequence 1 Universal PCR Sequence 2 A G illumicode Address Universal PCR Sequence 3 PCR with universal labeled primers

17 Hybridization to Universal IllumiCode illumicode #561 illumicode #217 illumicode #1024 /\/\/\/ /\/\/\/ /\/\/\/ T/T C/C T/C

18 Allele-Specific Hybridization Affymetrix C target C G Hybridize A Fails to hybridize Oligonucleotide Ligation GOLDEN GATE Illumina C target Ligate C G A Fails to ligate Single Base Extension INFINIUM +ddgtp +ddttp +ddctp target +ddatp dc G C incorporated A C fails to incorporate

19 Genome-wide association study -GWAS Studio di associazione genome-wide è un'indagine di tutte, o quasi tutte, le variazioni geniche tra gli individui in esame. In seguito, si tenta di associare le differenze geniche osservate con alcuni tratti particolari (fenotipi), ad esempio una malattia, o caratteri quantitativi di importanza economica(produzione latte, tenerezza carne, etc..), risposte a stress ambientali o trattamenti clinici. Studio di associazione tra SNP e caratteri fenotipici

20 Haplotype Multiple loci in the same chromosome that are inherited together Usually a string of SNPs that are linked locus alleles haplotypes

21 Linkage Disequilibrium, LD Alleles are in LD, if they are inherited together more often than could be expected based on allele frequencies Two loci are inherited together, because recombination during meiosis separates them only seldom

22 IHMP from 2003 had identified the majority of common SNPs which are interrogated in a GWAS Genome-wide association study Studio di associazione tra SNP e caratteri fenotipici

23 Studio di associazione tra SNP e caratteri fenotipici Se una variante allelica (SNP) è più frequente negli individui portatori di un fenotipo, lo SNP si dice essere associato con il fenotipo Il primo studio di GWAS è stato pubblicato nel 2005 ed è stato condotto nei pazienti affetti da degenerazione maculare. Sono stati trovati due SNP associati Nel 2007, uno studio trovò un'associazione tra il diabete mellito di tipo 2 e diversi SNP nei geni TCF7L2, SLC30A8 ed altri. Sempre nel 2007, il Wellcome Trust Case Control Consortium ha condotto degli studi di associazione genome-wide per la coronaropatia, il diabete mellito di tipo 1, il diabete mellito di tipo 2, l'artrite reumatoide, il morbo di Crohn, il disturbo bipolare, e l'ipertensione.

24 Studio di associazione tra SNP e caratteri fenotipici Fino al 2011 erano stati condotti circa 1200 studi di GWAS sull uomo e genotipizzati migliaia di individui per studiare più di 200 fenotipi legati a sindromi. Sono stati associati a questi caratteri più di 4000 SNP.

25 Questi studi confrontano le variazioni genomiche di individui che presentano la malattia e individui sani, il più possibile simili, per età, sesso condizioni ambientali, ai malati. Se alcune variazioni genetiche sono significativamente più frequenti negli individui malati, allora le variazioni si dicono"associate" con la malattia. Queste variazioni sono poi considerate come indicative della regione in cui è probabile che si trovi anche la mutazione che causa la malattia.

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27 A key instrument in GENOMICS research: oligo CHIP

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29 The most common approach of GWA studies is the case-control setup which compares two large groups of individuals, one healthy control group and one case group affected by a disease. All individuals in each group are genotyped for the majority of common known SNPs. The exact number of SNPs depends on the study, but typically around a million. For each of these SNPs it is then investigated if the allele frequency is significantly altered between the case and the control group. In such setups, the fundamental unit for reporting effect sizes is theoddsratio

30 l'odds ratio(or) è uno degli indici utilizzati per definire il rapporto di causa-effetto tra due fattori, per esempio tra un fattore di rischio (variazione genica) e una malattia. Il calcolo dell'odds ratio prevede il confronto tra le frequenze di comparsa dell'evento (ad esempio, malattia) rispettivamente nei soggetti esposti e in quelli non esposti al fattore di rischio in studio. Il calcolo dell'odds ratio prevede il confronto tra le frequenze di comparsa della malattia nei soggetti portatori di una variante genica e in quelli portatori dell altra variante genica L'odds ratio è definito come l'odds della malattia tra soggetti esposti, diviso l'odds della malattia tra soggetti non esposti

31 Se il valore dell'or è uguale a 1, significa che l'odds di esposizione nei sani è uguale all'odds di esposizione nei malati, cioè la variante genica è ininfluente sulla comparsa della malattia; se il valore dell'or è maggiore di 1, significa che la frequenza allelicadellavariantegenicaneimalatièpiùaltacheneisani,epuò essere implicata nella comparsa della malattia; se il valore dell'or è minore di 1 significa che la frequenza allelica se il valore dell'or è minore di 1 significa che la frequenza allelica della variante genica nei malati è più bassa che nei sani, e può essere implicata nella malattia;

32 Finding odds ratios that are significantly different from 1 is the objective of the GWA study because this shows that a SNP is associated with disease. A P-value for the significance of the odds ratio is typically calculated using a simple chi-squared test. After odds ratios and P-values have been calculated for all SNPs, a common approach is to create a Manhattan plot. This plot shows the negative logarithm of the P-value as a function of genomic location. Thus the SNPs with the most significant association will stand out ontheplot.

33 association level genomic location

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35 Identification of a short region in chromosome 6 affecting calving traits in Piedmontese cattle by genome-wide association mapping

36 323 bulls Calving in cattle is affected by calf morphology and by dam characteristics. The aim of this study was to identify regions of cattle genome harbouring genes possibly affecting direct calving ease (which is the ability to generate calves that are easily born) in the Piedmontese cattle breed.

37 BovineSNP50 beadchip The Estimated Breeding Values (EBVs) for calving ease used in breeding plans are measured from three sets of records: calving ease score, birth weight and gestation length

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39 The strongest signal was detected on chromosome 6 between 37.8 and 38.7 Mb where 13 SNPs associated to direct calving ease were found LAP3 encoding for a leucine aminopeptidase, which is responsible of the oxytocin hydrolysis NCAPG encoding for a non- SMC condensin I complex, which has been associated, in cattle, with fetal growth and carcass size LCORL which has been associated to height in humans and cattle

40 JOE SUTLIFF A prerequisite to understanding the complete biology of an organism is the determination of its entire genome sequence Fleischmann et al. 1995