cromosomi metafasici

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Floriana Romani
7 anni fa
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1 METODI DI STUDIO DELLA CITOGENETICA L analisi cromosomica viene condotta prevalentemente su cromosomi metafasici nello stadio di massima spiralizzazione

2 Lunghezza del cromosoma :1 5 avvolgimenti della doppia elica sezione della cromatina fibra di 30nm con i nucleosomi strettamente impacchettati 2nm 11nm 30nm parte di una sezione di cromosoma 300nm sezione condensata di un cromosoma metafasico 700nm cromosoma metafasico 1400nm

3 Per poter visualizzare i cromosomi metafasici le cellule devono essere naturalmente in attiva moltiplicazione o indotte a dividersi in coltura in vitro Colture di linfociti T La FITOEMOAGGLUTININA (PHA) induce la blastizzazione dei linfociti T che dallo stato quiescente G 0 iniziano a dividersi L effetto è limitato e la coltura va avanti solo per alcuni giorni

4 Allestimento del preparato da colture di linfociti sangue periferico fitoemoagglutinina (stimola la crescita) colchicina (ultimi 30 ) Ipotonica (20 ) proliferazione centrifugazione centrifugazione 48-96h terreno di coltura pellet risospeso fissativo pellet risospeso fissativo risospensione in poco fissativo allestimento del preparato centrifugazioni (2-3)

5 La COLCHICINA impedisce la formazione del fuso mitotico e causa un arresto della cellula in metafase Lo SHOCK IPOTONICO causa un rigonfiamento della cellula e la dispersione dei cromosomi Il trattamento con fissativo ACIDO ACETICO e METANOLO produce la disidratazione ed il fissaggio del preparato sul vetrino La COLORAZIONE del preparato permette di visualizzare cromosomi ben contratti non sovrapposti e ben identificabili

6 Colture di fibroblasti possono essere ottenute da tutti i tessuti anche embrionali e fetali e vanno avanti più a lungo delle colture di linfociti Colture immortalizzate - linfociti B infettati con il virus Epstein-Barr danno luogo a linee LINFOBLASTOIDI - fibroblasti infettati con il virus SV-40 danno luogo a linee immortalizzate che vanno incontro ad alterazioni del cariotipo Le cellule possono essere conservate in Azoto liquido

7 Sincronizzazione delle colture Il trattamento con Metotrexato o FUdR (inibitori della timidilato sintetasi) oppure con un eccesso di Timidina produce un sbilanciamento del pool di nucleotidi ed un blocco reversibile della fase S Le colture ripartono dopo la rimozione degli inibitori Si ottiene un INDICE MITOTICO molto alto

8 TECNICHE DI COLORAZIONE La colorazione con GIEMSA è uniforme sul cromosoma permette di esaminare la morfologia generale dei cromosomi NON tutte le alterazioni strutturali

9 Metafase Giemsa standard

10 Nomenclatura standard 1966 Conferenza di Denver 1-3 gruppo A 4-5 gruppo B X-6-12 gruppo C gruppo D gruppo E gruppo F Y gruppo G

12 COLORAZIONI DIFFERENZIALI mettono in evidenza l alternanza di bande chiare e scure con un pattern caratteristico per ciascuna coppia di omologhi bande per cariotipo aploide (10Mb) permettono di identificare i riarrangiamenti strutturali e di definire in modo più preciso i punti di rottura

13 Rappresentazione diagrammatica

14 Q-banding con mostarda di quinacrina permette di evidenziare bene alcune delle zone eterocromatiche e dei NOR la colorazione è fluorescente ma è instabile (fading) i vetrini possono essere decolorati e riusati per altre colorazioni

15 Analizzare il cariotipo

16 Cariotipo ordinato con Q banding

17 Due assetti gametici di un portatore di inversione duplicazione delezione

18 G-banding con Giemsa + tripsina o denaturazione al calore la colorazione è permanente ed può avere una maggiore risoluzione del Q-banding con un pattern analogo meno riproducibile può alterare la morfologia dei cromosomi i vetrini non possono essere riusati per altre colorazioni

19 Il cariotipo umano normale con bandeggio G

20 Cariotipo Sindrome di Edwards 18+

21 Cariotipo Sindrome di Down 21+

22 Cariotipo Sindrome di Turner X0

23 R-banding (reverse pattern) con BUdR e fluorocromi evidenzia bene le regioni telomeriche

24 R-banding (reverse pattern) con BUdR e fluorocromi Si ottiene con un breve trattamento con BRdU durante la tardiva fase S La BRdU viene incorporata nelle regioni a replicazione tardiva dopo esposizione agli UV che causa la fotodegradazione della BRdU e colorazione con Arancio di acridina o Giemsa appaiono più pallide In particolare i due X si differenziano pallido - inattivo late-replicating scuro - attivo early-replicating Si ottiene un R-banding anche con pretrattamento al calore e colorazione con Giemsa o Arancio di Acridina

25 Incorporazione di BUdR BUdR BUdR M1 M2

26 M2 BUdR

27 Incorporazione BUdR II BUdR

28 M3 BUdR

29 M4 BUdR

30 ALTRE COLORAZIONI DIFFERENZIALI mettono in evidenza particolari strutture come i centromeri, i satelliti e le NOR, regioni eu- ed eterocromatiche C-bande : tutti i centromeri e le regioni eterocromatiche variabili dei cromosomi 1,9,16,Y

31 Bandeggio ad alta risoluzione con un breve pulse di colchicina i cromosomi sono più allungati (profasici o prometafasici) si possono evidenziare piccoli riarrangiamenti come delezioni interstiziali a livello di sottobande definire la regione critica di un dato quadro clinico bande per cariotipo aploide (1-5 Mb)

32 Ibridazione in situ fluorescente FISH Permette un ulteriore affinamento dell analisi citogenetica il livello di definizione è intorno a Kb riarrangiamenti molto piccoli Combinazione di tecniche citogenetiche e molecolari sonde marcate con 3 H o con biotina+fluorocromi) Insieme al bandeggio ad alta risoluzione la FISH ha contribuito alla costruzione di mappe ad alta risoluzione del GENOMA UMANO

33 FISH cromosoma sul vetrino sintesi di una sonda complementare marcata con un fluorocromo denaturazione A T C G G T A T C C T A T A GG C A T A G G A T doppia elica di DNA A T C G G T A T C C T A T A G G C A T A G G A T A T C G G T A T C C T A T A G G C A T A G G A T denaturazione G TA G A TC T C C T A ibridazione della sonda sui cromosomi denaturati sul vetrino A T C G G T A T C C T A T A G G C A T A G G A T T A G G C A T A G G A T A T C G G T A T C C T A T A GG C A T A G G A T osservazione del vetrino

34 Le sequenze del Genoma umano 3000 Mb Geni a singola copia geni funzionali DNA ripetitivo DNA spaziatore a funzione non nota Sequenze con funzione nota Sequenze con funzione non nota Famiglie di geni codificanti e pseudogeni Sequenze funzionali non codificanti Ripetizioni nell eterocromatina Sequenze trasponibili Variable-number tandem repeats Famiglie di geni dispersi Famiglie di geni in tandem Trasposoni Retrotrasposoni

35 Le sonde possono corrispondere a sequenze singole o ripetute

36 Autoradiografia ISH con marcatura radioattiva sonda centromerica (cariotipo di topo)

37 FISH con sonde telomeriche

38 FISH con una sonda di un gene singolo

39 Chromosome painting FISH con sonda di un intero cromosoma

40 TRASLOCAZIONI RECIPROCHE Chromosome painting con sonde fluorescenti per due cromosomi una marcata in rosa e l altra marcata in azzurro

41 Altre metodologie che hanno contribuito all analisi dei cromosomi umani Ibridi cellulari Citofluorimetria Microdissezione cromosomi

42 Analisi del Cariotipo Per ciascuna coppia vengono considerate Lunghezza del cromosoma Distribuzione dell etero- ed eucromatina Satelliti Costrizioni secondarie Indice centromerico Lp/Lp+Lq (%) Pattern di bande

43 DIAGNOSI PRENATALE Coriocentesi I trimestre di gravidanza - rischio di aborto 2-3% Amniocentesi II trimestre di gravidanza - rischio di aborto 0.5-1% Funicolocentesi II trimestre di gravidanza - rischio di aborto non noto

44 DIAGNOSI PRENATALE Indicazioni per l analisi citogenetica prenatale - età della madre > 35 anni - nascita di un figlio con alterazioni cromosomiche - nascita di un figlio con malformazioni - genitori portatori di riarrangiamenti cromosomici (1:500) - poliabortività e semisterilità - esposizione ad agenti mutageni chimici e fisici - malformazioni del feto rivelate all esame ecografico

45 DIAGNOSI PRENATALE L analisi citogenetica permette di identificare un alta percentuale dei casi di sindrome di DOWN ma il test comporta alcuni rischi In alternativa ai prelievi di cellule embrionali e fetali sono in fase di avanzata sperimentazione metodi basati sulla ricerca di metaboliti di derivazione fetale o placentale nel sangue materno che fungano da marcatori per riconoscere le gravidanze a rischio TRITEST alfa-fetoproteina AFP estriolo non coniugato beta-gonadotropina corionica HT-21 beta-gonadotropina corionica

46 DIAGNOSI POSTNATALE Indicazioni per l esame citogenetico - Dismorfismi o malformazioni congenite - Basso peso alla nascita - Ritardo di accrescimento - Ritardo psico-motorio

47 Per la diagnostica POSTNATALE o nell ADULTO Linfociti Fibroblasti (mosaicismo) Spermatozoi (fecondazione di oociti di hamster) Oociti (superovulazione indotta) Per la diagnostica PRENATALE Linfociti (funicolocentesi) Amniociti (amniocentesi) Villociti o coriociti (villocentesi) Le cellule dei villi coriali (trofoblasti) non richiedono coltivazione perchè sono già in attiva divisione Per l analisi di aborti o morti in utero Fibroblasti Non sempre l analisi può essere eseguita su tessuti morti per degenerazione e inquinamento batterico

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