Il lisozima è un agente antimicrobico

Transcript

1 ECNICA T ABBATTERE LA MICROFLORA LATTICA SPONTANEA NEL MOSTO E NEL VINO Il lisozima ritarda nei rossi e blocca nei bianchi la malolattica I risultati hanno evidenziato la diversa efficienza del lisozima sulla microflora lattica spontanea durante la vinificazione. Nel vino rosso (Valpolicella) l effetto dell enzima è stato parziale, ritardando solamente la fermentazione malolattica, mentre in quello bianco (Soave) ha inibito completamente lo sviluppo dei batteri indigeni di E. Tosi, M. Azzolini, M. Cristofoletti, G. Zapparoli Il lisozima è un agente antimicrobico che, ormai da oltre un decennio, è utilizzato con sempre più frequenza nelle cantine per il controllo delle popolazioni di batteri lattici (Amati et al., 99; Gao et al., ). La selettività di questo composto, a differenza della SO, è derivata dalla sua azione specifica sulla parete cellulare dei batteri gram-positivi, quali appunto i batteri lattici. Vari studi sono stati svolti per determinarne le condizioni ottimali di somministrazione. Ad esempio è stata valutata l influenza che le varie componenti del mosto e del vino, quali i solidi sospesi, le sostanze colloidali e i polifeno- li, esercitano sulla sua attività (Eggert et al., ). Anche il ph riveste una certa importanza per il lisozima in quanto una bassa acidità ne aumenta l efficacia, pertanto il suo utilizzo permette un significativo controllo di batteri lattici indesiderati che crescono con più facilità a ph alti (Amati et al., 99). La componente polifenolica interferisce, invece, negativamente sull attività del lisozima per cui nei vini rossi la sua azione è meno duratura che non nei vini bianchi in seguito alla nota capacità che le molecole polifenoliche hanno di aggregare le proteine, come il lisozima. Altri studi sono stati effettuati per valutare gli effetti del lisozima sulla composizione chimica e sensoriale dei vini Le dosi impiegate di lisozima sono state di e mg/l aggiunte al mosto e in coda alla fermentazione in vino Valpolicella e Soave (Bartowsky et al., ). Da un punto di vista pratico il lisozima ha trovato applicazione con successo in differenti fasi della vinificazione a partire dall ammostatura, prima o dopo la fermentazione alcolica e dopo la fermentazione malolattica per stabilizzare il prodotto (Gerbaux et al., 99). Tuttavia le attuali conoscenze, relative ai meccanismi di azione e alle modalità di impiego del lisozima, non si possono considerare esaurienti. L efficacia del lisozima è legata alle molteplici variabili che intervengono in un processo di vinificazione e a seconda delle condizioni enologiche il suo effetto può essere differente. Considerando che l uso di un additivo ha un costo, la scelta di impiegare o meno il lisozima è legata al valore economico del vino da produrre, oltre che alla sua effettiva capacità di controllare la crescita dei batteri lattici nella vinificazione. È importante, quindi, continuare la sperimentazione allo scopo di migliorare le conoscenze di questo aspetto applicativo dell enologia. Obiettivo In questo studio è stata valutata l azione del lisozima, utilizzato in due momenti e con due dosaggi diversi, nel mosto e in prossimità della fine della fermentazione alcolica, durante due differenti vinificazioni, una in rosso e l altra in bianco. I dati analitici dei vini sono stati correlati con il monitoraggio della popolazione lattica indigena e dell acido malico da essa consumata. Infine, tesi trattate con il lisozima sono state successivamente inoculate con starter batterici per valutare la possibilità di ottenere fermentazioni malolattiche controllate. Le prove condotte Microvinificazioni. Le vinificazioni in rosso (vino Valpolicella) e in bianco (vino Soave) sono state condotte in cantina secondo i rispettivi disciplinari /8 L Informatore Agrario

2 TABELLA - Composizione dei mosti utilizzati per la produzione di vino Valpolicella e Soave Parametri Valpolicella Soave ph,9, Acidità totale (g/l) (*),98, Zuccheri ferment. ( Brix),,8 Acido malico (g/l),8,9 Acido L-lattico (g/l),, Acido acetico (g/l),9, Batteri lattici (Ufc/mL),, (*) In acido tartarico. TABELLA - Polifenoli, antociani e tannini totali nel mosto e nel vino Valpolicella al momento dell aggiunta di lisozima Parametri Mosto Vino ( ) Polifenoli totali (mg/l) ( ).8. Antociani totali (mg/l) ( ) 8 Tannini totali (g/l),8, ( ) Prima del termine della fermentazione alcolica con residuo zuccherino di circa g/l. ( ) In acido gallico. ( ) Malvina cloroidrato. Popolazione batterica (Log Ufc/mL) di produzione, in volumi di L in tini di acciaio della capacità di L. Per la produzione di vino Valpolicella, all ammostatura dell uva il mosto è stato separato dalle vinacce e, dopo essere state ben mescolate, le due frazioni liquide e solide sono state suddivise in modo omogeneo per la costituzione di singole tesi confrontabili. Prima dell inoculo dei lieviti starter la massa vinaria è stata solfitata alla concentrazione di mg/l di SO per controllare la microflora indigena e consentire un corretto avvio della Il lisozima ha inibito fermentazione alcolica. la fermentazione La fermentazione alcolica è stata seguita monito- nel vino bianco Soave malolattica spontanea rando il consumo di zuccheri fermentescibili e la produzione di etanolo. Al termine di questa si è proceduto alla svinatura e successiva sfecciatura nel caso del Valpolicella e alla sola sfecciatura nel vino Soave. Durante la fermentazione alcolica e quella malolattica (FML) sono stati raccolti i campioni per le analisi chimiche e microbiologiche. Al termine della fermentazione alcolica, dopo la svinatura e sfecciatura, sono stati aggiunti batteri malolattici starter della specie Oenococcus oeni in frazioni di tesi già addizionate di lisozima nel mosto o prima della fine della fermentazione alcolica. 8 A - Lisozima all ammostatura 8 B - Lisozima dopo fermentazione alcolica mg/l mg/l + starter mg/l mg/l + starter (*) Le linee tratteggiate indicano le conte dei batteri nelle tesi inoculate con colture starter dopo la fermentazione alcolica. GRAFICO - Andamento della popolazione batterica indigena nelle tesi di vino Valpolicella addizionate di lisozima all ammostatura (A) e in coda alla fermentazione alcolica (B) e nella tesi di controllo (*) Nel mosto le due concentrazioni di e mg/l di lisozima hanno determinato un momentaneo abbattimento della microflora lattica, che però ha avuto una durata limitata (A). Dopo due giorni si è verificata una rapida ricrescita della popolazione in tutte le tesi trattate con lisozima. Un comportamento analogo si è registrato quando l enzima è stato aggiunto in coda alla fermentazione alcolica (B). Impiego del lisozima. È stato impiegato un preparato commerciale di lisozima con attività dichiarata di. UFC/g sciogliendolo prima in acqua. Poi lo si è addizionato nella massa vinaria che è stata agitata vigorosamente per favorirne una rapida e omogenea distribuzione. Le dosi impiegate sono state di e mg/l aggiunte al mosto o in coda alla fermentazione quando la concentrazione degli zuccheri residui era di circa g/l. Analisi chimiche e microbiologiche. Le analisi chimiche sui mosti e sui vini hanno riguardato: etanolo ed estratto secco determinati mediante spettrofotometro con sistema NIR, acidi organici per via enzimatica, SO, acidità totale e zuccheri per titolazioni seguendo i protocolli standard. Le conte dei batteri sono state effettuate piastrando diluizioni decimali di campioni di mosto-vino in terreno di coltura MRS con il % di succo di pomodoro; le piastre sono state incubate a 8 C per giorni in anaerobiosi. La fermentazione malolattica è stata considerata completata quando il contenuto in acido malico risultava inferiore a, g/l. Mosti. La tabella mostra la composizione dei mosti utilizzati per la sperimentazione all inoculo dei lieviti starter. Al momento dell analisi i mosti erano stati solfitati e la concentrazione di SO era di circa e mg/l come totale e Popolazione batterica (Log Ufc/mL) libera, rispettivamente. Queste concentrazioni non sono limitanti la crescita dei batteri lattici. Vinificazione in rosso Data la possibile interferenza dei polifenoli del vino sull attività del lisozima, è stato determinato il contenuto polifenolico del mosto e del vino al momento dell aggiunta dell enzima (tabella ). Nei vini Soave è stata riscontrata una drastica riduzione della popolazione batterica sia con l aggiunta del lisozima nel mosto sia in coda alla fermentazione L Informatore Agrario /8

3 ECNICA T Degradazione acido malico (g/l),8,,,,,8,,,, mg/l mg/l in coda FA mg/l mg/l in coda FA GRAFICO - Degradazione dell acido malico nelle tesi di vino Valpolicella (*) L addizione di mg/l di lisozima nel mosto non ha sortito praticamente nessun effetto ritardante, mentre in dose doppia si è osservato un posticipo del termine della fermentazione malolattica di circa giorni rispetto alla tesi di controllo. TABELLA - Analisi dei vini Valpolicella dopo la fermentazione malolattica senza o con l impiego di lisozima ( ) Parametri Senza lisozima Con lisozima (mg/l) mosto vino ( ) ph,,,9,, Etanolo (% vol.),9,,88,8,9 Zuccheri residui (g/l),,,8,, Estratto totale (g/l) 8,8 8,9 9, 9, 8,9 Acidità totale (g/l) ( ),,8,,,9 Acido L-lattico (g/l),,9,,8, Acido acetico (g/l),,,,, ( ) Alla concentrazione di e mg/l nel mosto e in coda alla fermentazione alcolica. ( ) Prima del termine della fermentazione alcolica con residuo zuccherino di circa g/l. ( ) In acido tartarico. I vini Valpolicella trattati o meno con lisozima hanno mostrato al termine della fermentazione malolattica composizioni non dissimili. Nel mosto le due concentrazioni di e mg/l di lisozima hanno determinato un momentaneo abbattimento della microflora lattica, che però ha avuto limitata durata (grafico A). Dopo due giorni si è verificata una rapida ricrescita della popolazione in tutte le tesi trattate con il lisozima. Un comportamento analogo si è registrato quando l enzima è stato aggiunto in coda alla fermentazione alcolica (grafico B). L osservazione delle cinetiche di degradazione dell acido malico, misurate nelle tesi, ha permesso di valutare il contributo del lisozima in termini di ritardo della fermentazione malolattica spontanea rispetto alle tesi di vino nelle quali l enzima non è stato aggiunto (tesi di controllo) (grafico ). L addizione di mg/l di lisozima nel mosto non ha sortito praticamente nessun effetto ritardante, mentre in dose doppia si è osservato un posticipo del termine della fermentazione malolattica di circa giorni rispetto alla tesi di controllo. Nelle tesi nelle quali il lisozima è stato aggiunto in coda alla fermentazione alcolica, con mg/l non si è osservata nessuna differenza rispetto al controllo, mentre con dose doppia il ritardo del termine della fermenatazione malolattica è stato modesto (circa giorni) rispetto al controllo. I vini Valpolicella ottenuti dalle tesi trattate e non con il lisozima hanno mostrato al termine della fermentazione malolattica una composizione sostanzialmente non dissimile tra loro (tabella ). Vinificazione in bianco Si è osservata una drastica riduzione della popolazione batterica sia con l aggiunta del lisozima nel mosto sia in coda alla fermentazione alcolica con entrambi i dosaggi (grafico ). La concentrazione dei batteri lattici è rimasta contenuta per tutta la durata della sperimentazione in tutte le tesi. L abbattimento della popolazione indigena è stato di simile entità sia con dosi di sia con mg/l di lisozima. Con questo effetto la malolattica spontanea è stata impedita, mentre nella tesi senza lisozima si è completata dopo giorni dall ammostatura (grafico ). Nella tabella sono riportate le composizioni dei vini al termine della sperimentazione e le differenze tra controllo e tesi trattate con lisozima sono dovute principalmente all effetto della disacidificazione del vino a seguito della malolattica. Uso di starter malolattici In entrambe le vinificazioni si sono destinate delle frazioni delle tesi per l inoculo di starter malolattici. In questo modo si è voluto osservare l eventuale attività residua del lisozima sulla popolazione del ceppo starter inoculato. Popolazione batterica (log UFC/mL) mg/l mg/l in coda FA mg/l mg/l in coda FA GRAFICO - Popolazione batterica indigena nelle tesi di vino Soave (*) Si è osservata una drastica riduzione della popolazione batterica sia con l aggiunta del lisozima nel mosto sia in coda alla fermentazione alcolica con entrambi i dosaggi. Nel grafico sono riportate, con linee tratteggiate, le curve della popolazione dei batteri lattici nelle tesi di Valpolicella inoculate con lo starter dopo la fermentazione alcolica. Al calo di concentrazione dei batteri, osservato nelle tesi inoculate e addizionate di mg/l di lisozima, è seguito però una veloce ripresa della crescita. In termini di cinetica di fermentazione malolattica l inoculo dello starter non ha prodotto effetti significativi, eccetto che nella tesi trattata con mg/l di enzima nel mosto, dove il consumo di acido malico si è completato con circa giorni di anticipo rispetto alla stessa tesi non inoculata con lo starter (dati non mostrati). Analogamente alla precedente prova anche frazioni di vino Soave, trattate con lisozima, sono state inoculate con lo starter dopo la fermentazione alcolica. In tutte queste tesi la popolazione del ceppo selezionato è andata incontro a una repentina e alta mortalità vanificando di conseguenza l effetto dell inoculo stesso. Il contenuto in acido malico, infatti, non è variato rispetto alle stesse tesi non inoculate (dati non mostrati). Effetto nei rossi e nei bianchi Questa sperimentazione ha evidenziato il diverso effetto del lisozima, addizionato al mosto o al vino, sull attività malolattica dei batteri lattici in relazione alla tipologia di vinificazione. I risultati confermano quanto già pre- /8 L Informatore Agrario

4 Degradazione acido malico (g/l),,,,, mg/l mg/l in coda FA mg/l mg/l in coda FA GRAFICO - Cinetica di degradazione dell acido malico nelle tesi di vino Soave (*) L abbattimento della popolazione indigena è stato di simile entità sia con dosi di sia con mg/l di lisozima. cedenti studi hanno evidenziato circa la diversa persistenza dell attività del lisozima nel vino rosso e in quello bianco. In particolare Bartowksy et al. () descrivevano un attività residua del lisozima di circa l 8% in un vino bianco di Riesling dopo mesi dall aggiunta di o mg/l dell enzima; al contrario, in vini rossi quali Cabernet Sauvignon e Shiraz l attività del lisozima era nulla già dopo due giorni dalla sua aggiunta. Più recentemente Tirelli e De Noni () sottolineavano che il lisozima è instabile nei vini rossi giovani nutrendo, di conseguenza, dubbi sulla sua efficacia nel controllare la fermentazione malolattica. In Valpolicella la dose di mg/l aggiunta all ammostatura ha prodotto un ritardo della malolattica spontanea, e questo può essere sufficiente per favorire fermentazioni malolattiche «pulite» guidate da ceppi starter. L inefficacia del lisozima, invece, aggiunto nella stessa dose ma in coda alla fermentazione alcolica, è attribuibile probabilmente all alta frazione di lisozima che si lega, e quindi si inattiva, ai componenti solidi del vino (vinacce e fecce), che con la svinatura vengono allontanati. È stato dimostrato che nel mosto la filtrazione e la centrifugazione causano consistenti riduzioni di attività per la rimozione del lisozima combinato con i solidi sospesi (Delfini et al., ). Nella vinificazione in bianco l alta carica dei batteri malolattici indigeni ha rappresentato una condizione ideale per lo scopo prefissato. In questo caso il lisozima si è dimostrato assai più stabile rispetto a quanto osservato nella vinificazione in rosso anche nella dose più bassa; nelle tesi addizionate di enzima nel mosto, anche la dose di mg/l è risultata nociva per lo starter inoculato. Questo risultato è attribuibile, oltre che all acidità minore del vino Soave rispetto al Valpolicella in questa sperimentazione, anche alla mancanza di interferenze dei polifenoli. Tuttavia con altri parametri enologici l azione del lisozima nei vini bianchi potrebbe essere differente. Precedenti sperimentazioni hanno dimostrato che la dose di lisozima impiegata è risultata determinante nel controllo della carica batterica indigena in vini bianchi caratterizzati da vari ph (Gerbaux et al., 99). Conclusioni Nelle vinificazioni in rosso (vino Valpolicella) il lisozima ha comportato un limitato abbattimento della microflora batterica TABELLA - Analisi dei vini Soave dopo la fermentazione malolattica senza o con l impiego di lisozima ( ) Parametri Senza lisozima Con lisozima (mg/l) mosto vino ( ) ph,,,,, Etanolo (% vol.),,,8,, Zuccheri residui (g/l),8,,,8, Estratto totale (g/l),,,,, Acidità totale (g/l) ( ),99,9,,8,9 Acido L-lattico (g/l),,,,, Acido acetico (g/l),9,,8,, ( ) Alla concentrazione di e mg/l nel mosto e in coda alla fermentazione alcolica. ( ) Prima del termine della fermentazione alcolica con residuo zuccherino di circa g/l. ( ) In acido tartarico. Le differenze tra le tesi trattate e il testimone sono dovute principalmente all effetto della disacidificazione del vino a seguito della fermentazione malolattica. Sulla base delle osservazioni sperimentali, il controllo della microflora lattica attraverso l utilizzo di lisozima sembra essere facilmente realizzabile nelle vinificazioni in bianco; si tratta di individuare la giusta dose da utilizzare in relazione all acidità del vino e allo stato sanitario delle uve al fine di massimizzare il rapporto costi-benefici. Nel caso della vinificazione in rosso il lisozima potrebbe essere utilizzato per rallentare l attività malolattica spontanea, ma non per inibirla qualora le condizioni enologiche siano simili a quelle sopra descritte. Nella produzione di vini rossi che necessitano della completa demalicazione l uso del lisozima potrebbe essere una valida soluzione per ottenere fermentazioni «pulite» guidate da starter, quindi senza interferenze da parte di batteri indigeni. Con ulteriori sperimentazioni si potranno definire protocolli più precisi circa le modalità di impiego del lisozima in relazione alla composizione e tipologia dei vini da trattare. Emanuele Tosi Michela Azzolini Centro per la sperimentazione in vitivinicoltura - Provincia di Verona Servizio agricoltura, Verona Marta Cristofoletti Giacomo Zapparoli Dipartimento scientifico e tecnologico Università di Verona Si ringraziano Valerio Udali e Alberto Zardini (Centro per la sperimentazione in vitivinicoltura, Provincia di Verona, Servizio agricoltura) per il lavoro di cantina e l azienda Lallemand Succursale Italiana per aver gentilmente offerto il materiale necessario per la sperimentazione. Per consultare la bibliografia: it/rdlia/8ia web 8 L Informatore Agrario /8

5 Articolo pubblicato su L Informatore Agrario n. /8 a pag. Il lisozima ritarda nei rossi e blocca nei bianchi la malolattica BIBLIOGRAFIA Amati A., Chinnici F., Piva A. (99) - Il lisozima in enologia per il controllo della fermentazione malolattica. Industrie delle bevande, : -. Bartowsky E.J., Costello P.J., Villa A., Henschke P.A. ()- Chemical and sensorial effects of lysozyme addition to red and white wines over six months cellar storage. Aust. J. Grape Wine Res., : -. Delfini C., Cersosimo M., Del Prete V., Strano M., Gaetano G. Pagliata A., Ambrò S. () - Resistance screening essay of wine lactic acid bacteria on lysozyme: efficacy of lysozyme in unclarified grape musts. J. Agric. Food Chem., : 8-8. Eggert K., Rawel H.W., Nikfardjam M.S.P., Kroll J. () - Interaction between lysozyme and wine components. Deutsche Lebensmittel-Rundschau, : -8. Gerbaux V., Villa A., Monamy C., Bertrand A. (99) - Use of lysozyme to inhibit malolactic fermentation and stabilize wine after malolactic fermentation. Am. J. Enol. Vitic., 8: 9-. Gao Y.C., Zhang G.P., Krentz S., Darius S., Power J., Lagarde G. () - Unhibition of spoilage lactic acid bacteria by lysozyme during wine alcoholic fermentation. Aust. J. Grape Wine Res., 8: -8. Tirelli A., De Noni I. () - Evaluation of lysozyme stability in young red wine and model systems by a validated HPLC methods. Food Chem., : -. RIASSUNTO È stata valutata l azione del lisozima per il controllo dello sviluppo della microflora lattica nella produzione di due tipologie di vino diverse; un vino rosso (Valpolicella) e un vino bianco (Soave). Sono state impiegate dosi di e mg/l all ammostatura o in coda alla fermentazione alcolica. In Valpolicella si è osservato un ritardo di circa giorni del termine della fermentazione malolattica (FML) con dosi di mg/l addizionate al mosto, mentre negli altri casi l azione dell enzima si è dimostrata non significativa. Al contrario nel Soave il lisozima ha inibito la FML spontanea indipendentemente dal dosaggio e dal momento di impiego. La persistenza di attività litica dell enzima in quest ultimo ha condizionato negativamente l esito della FML indotta da starter. Al contrario la relativa labilità del lisozima nel vino rosso sembra offrire opportunità di ottenere FML «pulite».