Analisi su campioni clinici

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1 Analisi su campioni clinici

2 DIAGNOSI DIRETTA per stabilire la presenza dell agente patogeno mediante: Esame caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione) a fresco (Spirochete: Treponema, Borrelia, Leptospire in campo oscuro) dopo colorazione (semplice, differenziale) Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen Esame caratteristiche macroscopiche (colturali) aspetto colonie emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc. crescita su terreni selettivi Caratteristiche biochimiche Caratteristiche antigeniche (ID sierologica) Identificazione molecolare

3 SANGUE Plasma Frazione liquida del sangue non coagulato. importante l anticoagulante Siero Frazione liquida del sangue coagulato LIQUOR CEFALORACHIDIANO Usare tale e quale

4 TAMPONI immersi in liquido di trasporto URINA diluita 1:2 Filtrata, centrifugata a Semina del pellet FECI Diluite 1:5 o 1:10 Centrifuga a bassa velocità Supernatante centrifugato a alta velocità Semina del pellet BRONCOLAVAGGI GARGARIZZATI BIOPSIE diluiti, rimosso muco omogenate e centrifugate

5 Tamponi bocca: ± terreno di trasporto Trasporto a temperatura ambiente con consegna al laboratorio entro ore dal prelievo Strisci su terreni selettivi e differenziali (Columbia CNA agar) Incubazione a 37 C per 24-48h Streptococcus pyogenes Haemophilus influenzae Bordetella pertussis Alternative non colturali: Ricerca Streptococcus pyogenes (gruppo A) con lateral flow Ricerca Bordetella pertussis con immunofluorescenza

6 Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica R. Cevenini, V.Sambri Piccin

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8 Identificazione presuntiva: emolisi + test biochimico

9 Tamponi orecchio: ± terreno di trasporto Trasporto a temperatura ambiente con consegna al laboratorio entro ore dal prelievo Microrganismi aerobi TSA ± sangue 37 C per 24-48h Microrganismi anaerobi Brodo tioglicollato (arricchimento) 37 C per 24-48h Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Proteus Pseudomonas aeruginosa Haemophilus influenzae Branhamella catarrhalis Agar sangue 37 C per 24-48h McConkey agar 37 C per 24-48h Agar sangue (Chocolate agar) 37 C per 24-48h Anaerobi (Bacteroides, Fusobacterium) Agar sangue (anaerobiosi) 37 C per >48h Lieviti e funghi Agar micologico 25 C per >72h

10 Proteus Bacilli Gram-, molto mobili, flagellati, polimorfi ( x m). Proteus mirabilis e vulgaris più frequentemente isolati da prelievi clinici e da materiali di origine animale causano infezioni urinarie con colonizzazione di uretra, vescica, uretere e reni o infezioni cutanee, otiti, oculari e del tratto respiratorio fimbrie (adesione), flagelli (mobilità), LPS (funzona da endotossina), ureasi In terreni liquidi cellule bacillari ( m) con 6-10 flagelli peritrichi In terreni solidi/semisolidi cellule sciamanti Swimming Swarming

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12 MR + ferm latt - ferm glu acidi no gas ureasi + TSI: A. Proteus mirabilis B. Salmonella sp. C. Escherichia coli

13 C. albicans e C. parapsilosis infezioni sistemiche in neonati e bambini C. glabrata infezioni sistemiche in adulti C.parapsilosis causa di micosi correlate con uso di cateteri Neutropenici Leucemici Sottoposti a trattamenti chirurgici del tratto gastro-intestinale Nati prematuri Anziani

14 Tamponi occhio: ± terreno di trasporto Trasporto a temperatura ambiente con consegna al laboratorio entro ore dal prelievo Microrganismi aerobi TSA ± sangue 37 C per 24-48h Microrganismi aerobi/facoltativi Brodo tioglicollato (arricchimento) 37 C per 24-48h +CO 2 Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Proteus Pseudomonas aeruginosa Haemophilus influenzae Neisseria spp. Agar sangue 37 C per 24-48h +CO 2 McConkey agar 37 C per 24-48h Agar sangue (Chocolate agar) Thayer-Martin agar 37 C per 24-48h +CO 2 Anaerobi (Bacteroides, Fusobacterium) Agar sangue (anaerobiosi) 37 C per >48h Mycobacterium Nocardia Agar selettivi 37 C per >72h Lieviti e funghi Agar micologico 25 C per >72h

15 Tamponi rettali: trasporto a temperatura ambiente con consegna al laboratorio entro 18-24h dal prelievo feci: conservazione a 4 C fino a 18-24h biopsie: consegna immediata Enterobacteriaceae (per Salmonella, Shigella, E. coli, Klebsiella) Enterobacteriaceae arricchimento (per Salmonella, Shigella) MacConkey o Hektoen enteric agar Brodo peptone+brodo Rappaport Vassiladis o brodo selenite cisteina 37 C per 18-24h 37 C per o 48h poi striscio in piastra E. Coli O157:H7 MacConkey con sorbitolo 37 C per 18-24h Staphylococcus aureus Baird Parker agar 37 C per 24-48h Clostridium perfringens Bacillus cereus Agar solfito-ferro-citratocicloserina o solfito-kanamicina Agar mannitolo polimixina rosso d uovo 37 C per 24-48h anaerobiosi 37 C per 24h Vibrio cholerae e altri vibrioni Agar selettivo citrato-tiosolfato 37 C per 24h Listeria monocytogenes Campylobacter spp. Brodo di arricchimento o semina diretta in Oxford agar/mezzo cromogenico Brodo di arricchimento o agar sangue con antibiotici 30 C per 24h 42 C per 24-72h +CO 2 Helicobacter pylori Agar sangue (Chocolate agar) 37 C per 72-96h +CO 2

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18 Ceppi patogeni di Escherichia coli enterotossigene (ETEC), enteroinvasive (EIEC), enteroemorragiche (EHEC), enteropatogene (EPEC), enteroaggregative (EAggEC). ETEC importanti per diarrea in neonati e turisti. Trasmissione per ingestione di acque o cibi contaminati. Gravità variabile. Mediata da sintesi di fimbrie (adesione), enterotossine (LT, labile al calore, simile alla tossina colerica, e ST stabile al calore). EIEC penetrano e si moltiplicano nelle cellule epiteliali del colon causando distruzione delle cellule. Sintomi: diarrea e febbre. Non hanno fimbrie ma specifiche adesine. EHEC causata solo dal ceppo O157:H7. Sindrome diarroica con emissione di sangue, assenza di febbre. Spesso associata a cottura non adeguata di hamburger. Produce una tossina simile alla tossina shiga, codificata da un batteriofago. EPEC causa diarree simili a ETEC ma con colonizzazione differente (adesine, intimina proteina di membrana esterna non fimbrie) e priva di tossine LT/ST ma con enterotossine. I sintomi sono causati più dall invasione batterica che dalla produzione di tossine. EAggEC si attaccano al tessuto in modo aggregativo: associati a diarrea persistente in bambini. Adesione mediata da fimbrie. Producono una tossina labile al calore detta EAST (EnteroAggregative ST), codificata da un plasmide, e emolisine.

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20 . Escherichia coli Bacilli Gram- (1-2 x 3-30 µm), anaerobi facoltativi, lattosio fermentanti. Commensali del tratto intestinale degli animali omeotermi. La sua presenza nelle acque indica contaminazione fecale. Ceppi non patogeni di E. coli possono comunque sviluppare malattia: se infettano le vie urinarie. Infezioni alle vie urinarie (UTI) se dall intestino arrivano nell addome o al sistema nervoso. Meningite neonatale se producono tossine (stabili e labili al calore) --> tossinfezioni alimentari. Gastroenteriti

21 Ricerca Escherichia coli patogeno Preparazione dei campioni Inoculo in mezzo di arricchimento selettivo (modified Tryptone Soya Broth + novobiocina o acriflavina per O157:H7, BPW + ceftazidime per O104:H4) ore a 37 C Inoculo in mezzo selettivo: McConkey s agar contenente sorbitolo 0.1% invece di lattosio o terreno cromogenico per O157:H7, TBX per O104:H4 Test di conferma su colonie sorbitolo (sospette O157:H7 ) e colonie di coli in TBX (sospette O104:H4)

22 colonie sorbitolo -: sospette O157:H7 falsi positivi: ceppi di E. coli e altri generi non fermentanti colonie sorbitolo + (colorazione rosso porpora) falsi negativi: eventuali ceppi di O157:H7 sorbitolo fermentanti

23 Klebsiella coccobacillo Gram- ( μm), non motile, aerobio, capsulato. nell uomo può colonizzare la pelle, la faringe, il tratto gastrointestinale Klebsiella pneumoniae agente eziologico della polmonite lobare con mortalità fino al 50% enterotossina termostabile plasmidi R Lattosio fermentante ma non produce acidi da glucosio

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26 Vibrio bacilli ricurvi Gram -, anaerobi facoltativi asporigeni, mobili per mezzo di un flagello polare. Sono ossidasi +, hanno metabolismo respiratorio e fermentativo. La crescita della maggior parte dei vibrioni è stimolata dalla presenza di NaCl e alcuni di essi sono alofili. I vibrioni sono batteri acquatici autoctoni: vivono sia in acque dolci che marine. Alcune specie vivono in associazione con animali marini e causano bioluminescenza (V. fisheri, V. harveyi) Circa metà delle 55 specie identificate possono causare patologie varie nell uomo o negli animali acquatici. Le infezioni (o tossinfezioni) umane possono avvenire per contatto diretto con l ambiente acquatico o indirettamente tramite l ingestione di alimenti contaminati e dell acqua. Patogeni per l uomo: V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus

27 Vibrio cholerae sierotipi O1 ed O139 sono responsabili di epidemie.

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29 V. parahaemolyticus gastroenterite V. vulnificus contaminazione di acque o alimenti e di ferite aperte. Alcuni ceppi hanno capacità invasive e distruttive dei tessuti molli. Produce molti enzimi: citolisine, proteinasi specifiche e collagenasi. V. fischeri forma simbiosi mutualistiche con alcune specie di pesci e calamari. In simbiosi, V. fischeri raggiunge densità cellulari sufficientemente elevate e diventa luminescente. La simbiosi più studiata è quella tra V. fischeri e Euprimna scolopes. riconoscimento: favorisce raggruppamento e accoppiamento predazione: attira la preda difesa: l emissione di luce disorienta il predatore mimetismo: l'animale emerge dalla sabbia di notte e va in cerca di prede, simula il chiarore lunare e confonde il predatore con la luce che proviene dall'alto

30 Vibrio isolati su agar sangue OX + tolleranti NaCl 6% beta-glucosidasi + beta-glucuronidasi - ferm gluc acidi senza gas E su agar selettivo (citrato e tiosolfato)

31 Clostridium perfringens Clostridium tetani Clostridium botulinum Clostridium difficile Gram+ ubiquitari anaerobi stretti sporigeni presenti nel suolo, nell acqua, nel tratto GI dell uomo e degli animali

32 Clostridium perfringens Tipo A infezioni umane Produce 4 tossine letali Alfa: fosfolipasi C ( lecitinasi) che lisa eritrociti, leucociti, endoteliali Beta: lesioni necrotiche Epsilon: aumento della permeabilità vascolare della parete gastroenterica Iota: aumenta la permeabilità vascolare 6 tossine minori una enterotossina (citotossica ed enterotossica) una neuraminidasi cellule gangrena gassosa malattie necrotizzanti Intossicazioni alimentari

33 Clostridium perfringens Preparazione dei campioni Se carica particolarmente bassa fare conta in tubi MPN Inoculo su mezzo selettivo (solfito-ferro-citratocicloserina o solfito-kanamicina) 24 ore a 37 C Colonie sospette (nere) strisciate su agar nitrato e agar sangue 24 ore a 37 C nitrato in anaerobiosi, sangue in aerobiosi Conferma se riducono e sono mobili in nitrato e non crescono su sangue in aerobiosi. Colorazione di Gram per conferma bastoncelli G+

34 Clostridi solfito riduttori

35 Clostridium tetani Ubiquitario: terreno, tratto gastroenterico di animali erbivori e dell uomo TETANOLISINA: emolisina ossigeno-labile TETANOSPASMINA: neurotossina responsabile delle manifestazioni cliniche del tetano 150 Kda scissa da proteasi in due subunità peptidiche B si lega con l estremità -COOH terminale ad un recettore sulla superficie dei neuroni A internalizzata, passa dalle terminazioni nervose al SNC

36 tetanospasmina rilasciata dai dendriti postsinaptici si localizza a livello delle vescicole delle terminazioni nervose presinaptiche blocca il rilascio dei neurotrasmettitori delle sinapsi inibitorie (GABA, acido gamma-aminobutirrico e glicina) determinando PARALISI SPASTICA

37 Clostridium botulinum 4 gruppi (I e IV) sulla base del tipo di tossina prodotta e della sua attività proteolitica. I e II repsonsabili della maggior parte delle patologie nell uomo 7 tossine antigenicamente distinte (A, B, C, alfa, D, E, F, G) A, B, E, F associati alla patologia nell uomo. Dose letale per via orale: 70 µg Botulismo alimentare (forma classica) Botulismo infantile associato al consumo di miele contaminato da spore botuliniche Botulismo da ferita contaminate per presenza di spore nel suolo, acqua, alimenti conservati in casa

38 peso molecolare di 150 KDa formata da 2 o più subunità (A-B) A: neurotossica B: protegge la neurotossina dall inattivazione da parte degli acidi gastrici blocca la neurotrasmissione a livello delle sinapsi colinergiche, prevenendo il rilascio del neurotrasmettitore acetilcolina (paralisi flaccida)

39 Clostridium difficile somministrazione indiscriminata di antibiotici nosocomiali e non Colonizzazione asintomatica Sindromi diarroiche Colite pseudomembranosa Fattori di virulenza: Enterotossina (tossina A): rilascio di citochine, ipersecrezione di fluidi e necrosi emorragica Citotossina (tossina B): depolimerizzazione dell actina Fattori d adesione (adesine) Ialuronidasi: attività citolitica Formazione di spore Rilevazione tossine

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41 Campylobacter e Helicobacter

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43 Campylobacter Spirillo Gram-, diffuso a livello intestinale in molte specie animali C.jejuni isolato frequentemente dall intestino dei suini (60%) e da pollame. Microaerofilo, sensibile al congelamento ma le cellule che sopravvivono rimangono vitali per alcuni mesi. viene inattivato dalla cottura. Tossigeno, può causare gastroenterite acuta Arcobacter Spirillo Gram-, associato a diverse specie animali A. butzleri A. cryaerophilus A. skirrowii Gastroenteriti Presente in acque, molluschi, prodotti della pesca, pollame, suini, latte crudo

44 Agar sangue antibiotato per 48 ore a 37 C con 5% di CO 2 Colonie non emolitiche, 1 mm di diametro, incolori identificate biochimicamente C. jejuni e coli negli alimenti con arricchimento selettivo a 43 C per 24 ore prima del mezzo selettivo agarizzato

45 Yersinia Bacillo Gram-, anaerobio facoltativo. Y. pestis (serbatoio roditori, vettori insetti) Y. pseudotubercolosis Y. enterocolitica Y. enterocolitica diarrea. Trasmissione: attraverso l ingestione di acqua o cibo contaminato. serbatoio dell infezione: roditori, conigli, maiali, pecore, bovini, cavalli, cani e gatti. infezioni contratte da animali per contatto diretto o consumo di carne poco cotta, specie di maiale.

46 Yersinia: cresce su Agar sangue o su MacConkey agar in 24 ore a 37 C Test differenziali

47 Tamponi o secrezioni del tratto genitale, trasporto a temperatura ambiente entro 2 ore, a 4 C fino a 18-24h dal prelievo Neisseria spp. Agar sangue (Chocolate agar) 37 C per 24-48h+CO 2 Haemophilus ducreyi Agar sangue (Chocolate agar) 30 C per 7d+CO 2 Gardnerella vaginalis Agar sangue (V agar) 37 C per 48h+CO 2 Trichomonas vaginalis Brodo con cisteina, cloramfenicolo, sieri equino 37 C per 48h Lieviti e funghi Agar micologico 25 C per >72h

48 Neisseria Neisseria diplococchi Gram-, aerobi, ossidasi positivi metabolismo ossidativo, con crescita difficile.

49 Cute e mucose superficiali raschiature, conservazione a 4 C tamponi, conservazione a temperatura ambiente fino a 18-24h Microrganismi aerobi TSA ± sangue 37 C per 24-48h+CO 2 Microrganismi anaerobi/facoltativi Brodo tioglicollato (arricchimento) Agar sangue (semina diretta) 37 C per 24-48h Staphylococcus spp. Agar mannitolo salino 37 C per 24-48h Pseudomonas aeruginosa Agar cetrimide 37 C per 24-48h Enterobacteriaceae MacConkey agar 37 C per 24h Lieviti e funghi Brodo triptone (arricchimento) Agar micologico (semina diretta) 25 C per >72h

50 Feature B. cereus B. thuringiensis B. cereus var. mycoides B. anthracis B. megaterium Gram reaction + a Catalase Motility +/- b +/- - c - +/- Reduction of nitrate + +/ d Tyrosine decomposed + + +/- - d +/- Lysozyme-resistant Egg yolk reduction Anaerobic utilization of glucose VP reaction Acid produced from mannitol Hemolysis (sheep RBC) Known pathogenicity c Produces enterotoxins a +, % of strains are positive b +/-, 50-50% of strains are positive c -, % of strains are negative d -, most strains are negative d - Endotoxin crystals pathogenic to insects Rhizoidal growth Pathogenic to animals and humans

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52 Fluido cerebrospinale Conservazione a temperatura ambiente fino a 18-24h per ricerche virus e antigeni congelamento immediato Microrganismi aerobi/facoltativi Brodo tioglicollato (arricchimento) 37 C per 24-48h Streptococcus agalactiae Streptococcus pneumoniae Staphylococcus spp. Brucella Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis Agar sangue 37 C per 24-72h+CO 2 Agar sangue (Chocolate agar) 37 C per 24-48h+CO 2 Enterobatteri MacConkey agar 37 C per 24-72h Mycobacterium Agar selettivi 37 C per >72h Candida e funghi Agar micologico 25 C per >72h

53 Urine conservazione a temperatura ambiente entro 2h, refrigerate fino a 24h Microrganismi Gram positivi Agar sangue (Columbia) 37 C per 18-24h Microrganismi Gram negativi MacConkey agar 37 C per 18-24h Pseudomonas aeruginosa Proteus Agar selettivo con cistina (CLED) 37 C per 18-24h

54 Sangue trasporto rapido a temperatura ambiente Microrganismi aerobi Microrganismi anaerobi Terreni per microrganismi esigenti (BHI, SPS ecc.) Subcoltura su agar sangue (Columbia) Terreno al tioglicollato Subcoltura su agar sangue (Columbia) 37 C fino a 14d+CO 2 37 C fino a 14d Brucella Agar sangue+sodio polianetolsulfonato 37 C per 24-72h+CO 2 Candida e funghi Agar micologico 25 C per >72h

55 Brucella gram-, aerobio, coccobacillare ( x μm), crescita lenta. Patogeni animali e umani, parassiti intracellulari facoltativi. Privi di flagelli e di capsule, non producono fattori di virulenza. animali infetti - prodotti alimentari - escreti Brucellosi B. melitensis (patogenicità massima), B. suis e B. abortus

56 ID microscopica o colturale di Brucella

57 Espettorato, broncoaspirato conservazione a temperatura ambiente, per Legionella possibile refrigerazione Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Haemophilus influenzae Gram negativi Anaerobi Terreni specifici Mycobacterium Agar selettivi 37 C per >72h Legionella Agar carbone attivo, cisteina, alfachetoglutarato e antibiotici 37 C lettura ogni 48h fino a 2 mesi Funghi (Aspergillus) Agar micologico 25 C per >72h

58 Legionella pneumophila Famiglia Legionellaceae 48 specie e oltre 60 sierogruppi 20 specie sono state documentate come patogene per l'uomo febbre di Pontiac: incubazione 1-2 giorni; forte febbre, dolori muscolari, mal di testa e disturbi intestinali malattia del Legionario incubazione 2-10 giorni (in media 5 6) febbre elevata, dolori muscolari, diarrea mal di testa, dolori al torace, tosse insufficienza renale disorientamento e letargia T ottimale 37 C (25 42 C) Aerobio Biofilm e sostanza organica Nebulizzazione/aerosol

59 impianti più esposti a rischio: ospedali, cliniche, case di cura apparecchi di erogazione ossigeno alberghi, caserme, campeggi e strutture ricettive impianti per attività sportive e scolastiche edifici con torri di raffreddamento Piscine (cloro attivo libero 1 mg/l (0,7-1,2 mg/l) stabilimenti termali in grado di superare i normali trattamenti di potabilizzazione (0,2 ppm cloro) effetti significativi a 1 ppm contenitori d acqua e tubi con superfici a bassa aderenza velocità elevate/ evitare ristagno

60 Isolamento da acque, tessuto polmonare, biopsia polmonare, secrezioni respiratorie, sangue, midollo osseo e valvole cardiache trattamento a caldo a 50 C per 30 minuti e diluizioni dei campioni respiratori BCYE (Buffered Charcoal Yeast Extract) CYE agar base + ferro, cisteina e α-chetoglutarato aggiunto di glicina, polimixina B e vancomicina Incubazione a 35±1 C per 14 giorni in atmosfera umida esaminati ogni 2-3 giorni

61 National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) nel 1996 regolamenta test rapidi da impiegare nei laboratori clinici: ammessi solo metodi molto accurati che offrono affidabilità pari a quello dei sistemi di identificazione tradizionali o automatizzati isolamenti da emocolture e altri tessuti normalmente sterili (fluido cerebro-spinale, aspirato oculare, liquido sinoviale, ecc.) o da casi epidemici o da prelievi legali vanno esaminati con i metodi standard escluse dai metodi rapidi le neisserie, a causa di possibili mancati riconoscimenti di Neisseria gonhorroeae.