ATTI DEL II CONGRESSO NAZIONALE. A.I.P.Vet. LODI MAGGIO 2005

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1 ATTI DEL II CONGRESSO NAZIONALE A.I.P.Vet. LODI MAGGIO 2005 con la partecipazione di:ogi ca e Sperimentale Gruppo di Patologia Clinica Veterinaria Gruppo Veterinario di Analisi di Immagine Società Italiana di Patologia Tossicologica e Sperimentale e con IL PATROCINIO DELLA FACOLTÀ DI MEDICINA VETERINARIA DI MILANO ISSN

2 TUMORI EMATOPOIETICI NEL TOPO. APPLICAZIONE DEGLI SCHEMI CLASSIFICATIVI DEL MOUSE Marchesi Francesco, Scanziani Eugenio MODELS OF HUMAN CANCERS CONSORTIUM Dipartimento di Patologia Animale, Igiene e Sanità Pubblica Veterinaria - Sezione di Anatomia Patologica Veterinaria e Patologia Aviare - Università degli Studi, Milano Negli ultimi cinquant anni la classificazione dei tumori ematopoietici murini ha conosciuto un evoluzione concettuale e metodologica culminata nelle proposte del Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) volte a fornire basi scientifiche per il confronto tra i tumori ematopoietici del topo e i corrispondenti linfomi e leucemie umane. Scopo del presente studio è quello di verificare l applicabilità delle direttive del MMHCC alla classificazione di tumori ematopoietici di topo sperimentalmente indotti e spontanei. Sono stati valutati 20 topi con tumori ematopoietici indotti mediante 2 differenti strategie sperimentali e 2 topi con linfoma spontaneo. I tessuti sono stati esaminati istologicamente e con immunoistochimica per CD3 e mieloperossidasi. Per 10 casi di tumori sperimentalmente indotti è stata eseguita una valutazione citologica di strisci di sangue periferico. Nei gruppi di tumori sperimentalmente indotti sono stati identificati 3 linfomi T-linfoblastici, 7 leucemie mieloidi senza maturazione e 10 leucemie mieloidi con maturazione. I linfomi dimostravano espressione di CD3. L espressione di mieloperossidasi appariva moderata nelle leucemie mieloidi senza maturazione e più consistente nelle leucemie mieloidi con maturazione. In dieci casi di leucemia mieloide la valutazione citologica del sangue periferico ha identificato forme mieloidi immature circolanti. I due tumori spontanei sono stati classificati come linfomi diffusi a larghe cellule di tipo centroblastico e istiocito-associato. L applicazione degli schemi classificativi del MMHCC necessita di un consistente supporto tecnico ed esperienza interpretativa, purtuttavia costituisce un valido contributo scientifico per la caratterizzazione di modelli murini di linfoma e leucemia. Parole chiave: Topo, tumori ematopoietici, istopatologia, immunoistochimica. HEMATOPOIETIC TUMORS IN THE MOUSE. APPLICATION OF THE MOUSE MODELS OF HUMAN CANCERS CONSORTIUM CLASSIFICATION SCHEMES. In the last fifty years the classification of murine hematopoietic tumors underwent a conceptual and methodological evolution resulting in the proposals from the Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) designed to provide scientific basis for the comparison between murine hematopoietic tumors and the corresponding human lymphomas and leukemias. The aim of this study is to evaluate the feasibility of the MMHCC proposals to classify both experimentally induced and spontaneous murine hematopoietic tumors. Twenty mice bearing experimentally induced hematopoietic tumors and 2 mice bearing spontaneous lymphomas were evaluated by histopathology and immunohistochemistry for CD3 and myeloperoxidase. For 10 cases of experimentally induced tumors a cytologic evaluation of peripheral blood smears was performed. In the groups of experimentally induced tumors we identified 3 T-cell lymphoblastic lymphomas, 7 myeloid leukemias without maturation and 10 myeloid leukemias with maturation. The lymphomas expressed CD3. The expression of myeloperoxidase was mild in myeloid leukemias without maturation and more prominent in myeloid leukemias with maturation. In the cases of myeloid leukemia immature myeloid forms were detected in the peripheral blood. The spontaneous cases were classified as diffuse large cell lymphomas of centroblastic and histiocyte-associated types. The application of the MMHCC proposals need a relevant technical support and a specific pathology expertise, but is a scientifically valuable tool for the characterization of mouse models of lymphoma and leukemia. Key words: Mouse, hematopoietic tumors, histopathology, immunohistochemistry. INTRODUZIONE I progressi tecnologici nelle applicazioni della biologia e della genetica molecolari hanno consistentemente contribuito ad un importante evoluzione delle strategie volte alla creazione e caratterizzazione di modelli murini di linfomi e leucemie umane. Il patologo veterinario fornisce un contributo determinante alla creazione e caratterizzazione di modelli murini di linfoma e leucemia mediante l applicazione di schemi classificativi consistenti e riproducibili che 85

3 forniscano basi scientifiche per il confronto tra i tumori ematopoietici murini e le corrispondenti neoplasie umane. Negli ultimi cinquant anni la classificazione dei tumori ematopoietici del topo ha conosciuto una consistente evoluzione concettuale e metodologica (1-5), culminata nelle recenti proposte classificative sviluppate dal Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) (6-7). Lo scopo del presente studio è quello di valutare l applicabilità degli schemi classificativi del MMHCC per la caratterizzazione di tumori ematopoietici murini sperimentalmente indotti o di origine spontanea. MATERIALI E METODI Sono stati valutati 20 topi con tumori ematopoietici indotti mediante due differenti strategie sperimentali e 2 topi con linfomi di origine spontanea. I tessuti sono stati fissati in formalina tamponata al 10% e processati per l inclusione in paraffina. Sezioni di 4 µm sono state colorate con Ematossilina-Eosina per la valutazione morfologica. Per alcuni casi sezioni seriate dei tessuti coinvolti dall infiltrazione neoplastica sono state colorate con metodica immunoistochimica con anticorpi policlonali di coniglio diretti contro CD3 e mieloperossidasi. Per 10 casi di tumori ematopoietici sperimentalmente indotti è stata anche eseguita una valutazione citologica di strisci di sangue periferico prelevati prima dell eutanasia dei soggetti. Gli strisci di sangue sono stati colorati con May-Grünwald Giemsa ed esaminati al microscopio ottico per l identificazione di cellule neoplastiche circolanti. Sulla base dei reperti istopatologici, immunoistochimici e citologici disponibili i tumori ematopoietici sono stati classificati secondo gli schemi proposti dal MMHCC (6-7). RISULTATI Nel gruppo di topi con tumori sperimentalmente indotti sono state identificati 3 casi di linfoma timico T-linfoblastico, 7 casi di leucemia mieloide senza maturazione e 10 casi di leucemia mieloide con maturazione. I linfomi timici erano caratterizzati da una popolazione neoplastica relativamente monomorfa di elementi linfoidi di medie dimensioni con scarso citoplasma e nuclei per lo più tondeggianti od ovali con cromatina fine e nucleoli spesso prominenti. Frequente appariva il riscontro di macrofagi con accumulo citoplasmatico di residui di cellule apoptotiche che conferivano il caratteristico aspetto starry sky (fig. 1). In tutti i casi di linfoma timico era presente un cospicuo coinvolgimento polmonare con estensivi infiltrati neoplastici caratterizzati da una tipica distribuzione perivascolare e peribronchiale. Più variabili apparivano le evidenze di disseminazione metastatica a livello splenico, epatico, linfonodale, renale e del midollo osseo. In tutti i casi di linfoma timico le cellule neoplastiche evidenziavano una consistente espressione di CD3 (fig. 2). Il complesso dei reperti morfologici ed immunoistochimici appariva consistente con una diagnosi di linfoma timico T-linfoblastico. Tutti i casi di leucemia mieloide erano costantemente caratterizzati da un estensiva o diffusa infiltrazione neoplastica a carico della milza e del midollo osseo. Molto frequente appariva la disseminazione a livello epatico (fig. 3), polmonare, e più variabili le evidenze di coinvolgimento renale e linfonodale. In 5 casi di leucemia mieloide senza maturazione le cellule neoplastiche dimostravano una positività citoplasmatica per mieloperossidasi variabile da scarsa a moderata (fig. 4). In 6 casi di leucemia mieloide con maturazione l espressione di mieloperossidasi nelle cellule neoplastiche appariva più prominente. In 4 casi di leucemia mieloide con maturazione, pur in assenza di dati immunoistochimici sull espressione di mieloperossidasi, consistenti evidenze di maturazione granulocitaria erano evidenti anche solo su base morfologica (fig. 5 e 6). La valutazione citologica del sangue periferico in 10 casi di leucemia mieloide ha consentito di identificare la presenza di forme immature circolanti. Le forme mieloidi neoplastiche circolanti erano rappresentate da elementi di medie e grandi dimensioni con citoplasma blu, in alcuni casi caratterizzato dalla presenza di granulazioni azzurrofile. In 3 casi di leucemia mieloide senza maturazione e in 4 casi di leucemia mieloide con maturazione la percentuale di forme mieloidi immature nel sangue periferico era superiore al 20%. In 3 casi di leucemia mieloide con prominente maturazione granulocitaria evidente a livello istologico, la percentuale di forme mieloidi immature nel sangue periferico risultava inferiore al 20% e il quadro ematologico era caratterizzato da una prominente presenza di neutrofili alla quale si associava anche il riscontro di alcune forme mieloidi a stadi intermedi di maturazione. Nei due topi con tumori linfoidi di origine spontanea la classificazione dei tumori è stata eseguita sulla base dei soli reperti istologici, non essendo disponibili dati immunoistochimici. I due tumori sono stati classificati come linfomi diffusi a larghe cellule di tipo centroblastico e istiocito-associato. Il linfoma centroblastico era caratterizzato da un diffuso coinvolgimento della milza e dei linfonodi e da reperti di estensiva disseminazione a livello epatico, polmonare, intestinale e renale. Il linfoma istiocito-associato evidenziava un diffuso coinvolgimento dei linfonodi e disseminazione a livello splenico ed epatico, ed era contraddistinto da aspetti morfologici molto caratteristici e distintivi. La popolazione neoplastica era costituita da elementi linfoidi di medie e grandi dimensioni ai quali erano associate sparse prominenti cellule giganti multinucleate e aree caratterizzate da una prevalenza elementi istiocitari con abbondante citoplasma eosinofilo. 86

4 DISCUSSIONE Il presente studio ha fornito preliminari indicazioni sull applicabilità degli schemi classificativi proposti dal MMHCC alla caratterizzazione di tumori ematopoietici murini sperimentalmente indotti e di origine spontanea. Nella casistica esaminata dati immunoistochimici erano disponibili solo per una parte dei tumori sperimentalmente indotti. L anticorpo policlonale diretto contro CD3 ha dimostrato una buona efficacia nell identificazione dei linfomi timici. Nei casi di linfoma timico osservato i caratteri morfologici delle cellule, i reperti di starry sky e l espressione di CD3 sono stati considerati elementi sufficienti a supportare la diagnosi di linfoma T-linfoblastico. Nei casi di tumori ematopoietici non linfoidi l anticorpo policlonale diretto contro mieloperossidasi ha rappresentato uno strumento utile per la caratterizzazione delle leucemie mieloidi, in particolare di quelle forme che apparivano caratterizzate da meno prominenti evidenze morfologiche di maturazione granulocitaria. E pero opportuno sottolineare che, ferma restando l importanza delle analisi istopatologiche ed immunoistochimiche, un appropriata caratterizzazione delle leucemie mieloidi deve essere supportata dalla valutazione citologica del sangue periferico. I due linfomi di origine spontanea sono stati classificati sulla base dei soli morfologici che sono stati considerati distintivi, purtuttavia la mancanza di dati immunoistochimici non ha consentito di specificare l origine dei due tumori dai linfociti B. Una rigorosa integrazione dei reperti macroscopici e istologici può fornire elementi utili alla classificazione dei tumori pur in assenza di dati immunoistochimici o molecolari. Nei casi in cui fossero disponibili solo reperti macroscopici e istologici e questi non dovessero apparire sufficienti, sarebbe opportuno omettere una sottoclassificazione precisa del tumore ematopoietico e porre possibili diagnosi differenziali sulla base dei dati disponibili. CONCLUSIONE Gli schemi classificativi proposti dal MMHCC costituiscono un valido strumento scientifico per la caratterizzazione dei tumori ematopoietici murini sperimentalmente indotti o di origine spontanea, ma la loro applicazione nella pratica quotidiana di un laboratorio di patologia implica la necessità di un consistente supporto tecnico e di esperienza interpretativa nell ambito dell ematopatologia. BIBLIOGRAFIA 1) Dunn T Normal and pathologic anatomy of the reticular tissue in laboratory mice with a classification and discussion of neoplasms. J Natl Cancer Inst 14: , ) Pattengale PK and Taylor CR Experimental models of lymphoproliferative disease: the mouse as a model for human non-hodgkin lymphomas and related leukemias. Am J Pathol 113: , ) Perkins AS The pathology of murine myelogenous leukemias. Curr Topics Microbiol Immunol 149: 3-21, ) Fredrickson TN, Hartley JW, Morse HC III rd, Chattopadhyay SK, Lennert K Classification of mouse lymphomas. Curr Topics Microbiol Immunol 194: , ) Morse HC III rd, Qi C-F, Taddesse-Heath L, Chattopadhyay SK, Ward JM, Coleman A, Hartley JW, Fredrickson TN Novel aspects of murine B cell lymphomas. Curr Topics Microbiol Immunol 246: , ) Kogan SC, Ward JM, Anver MR, Berman JJ, Brayton C, Cardiff RD, Carter JS, de Coronado S, Downing JR, Fredrickson TN, Haines DC, Harris AW, Harris NL, Hiai H, Jaffe ES, MacLennan ICM, Pandolfi PP, Pattengale PK, Perkins AS, Simpson RM, Tuttle MS, Wong JF, Morse HC III rd Bethesda proposals for classification of nonlymphoid hematopoietic neoplasms in mice. Blood 100: , ) Morse HC IIIrd, Anver MR, Fredrickson TN, Haines DC, Harris AW, Harris NL, Jaffe ES, Kogan SC, MacLennan ICM, Pattengale PK, Ward JM Bethesda proposals for classification of lymphoid neoplasms in mice. Blood 100: ,

5 Figura 1 Linfoma timico T-linfoblastico. Timo: diffusa infiltrazione di elementi linfoidi neoplastici di medie dimensioni con scarso citoplasma, nuclei rotondi od ovali con cromatina fine e nucleoli prominenti. Sono presenti sparsi macrofagi con citoplasma stipato di detriti cellulari apoptotici che impartiscono il caratteristico aspetto starry sky. Ematossilina Eosina, 400. Figura 2 Linfoma timico T-linfoblastico. Polmone: un infiltrato perivascolare-peribronchiale di elementi linfoidi neoplastici caratterizzati da consistente espressione di CD3. Immunoistochimica ABC per CD3, controcolorazione con Ematossilina di Mayer, 400. Figura 3 Leucemia mieloide senza maturazione. Fegato: estensiva infiltrazione periportale di elementi mieloidi immaturi senza evidenze morfologiche di maturazione granulocitaria, caratterizzati da scarso citoplasma debolmente eosinofilo, nuclei rotondi od ovali o leggermente ripiegati e irregolari con cromatina fine e nucleoli multipli. Ematossilina Eosina, 400. Figura 4 Leucemia mieloide senza maturazione. Fegato: gli elementi mieloidi neoplastici nell infiltrato periportale evidenziano una moderata espressione di mieloperossidasi. Immunoistochimica ABC per mieloperossidasi, controcolorazione con Ematossilina di Mayer, 400. Figura 5 Leucemia mieloide con maturazione. Midollo osseo: diffusa infiltrazione di elementi mieloidi con prominenti evidenze morfologiche di maturazione granulocitaria. Ematossilina Eosina, 400. Figura 6 Leucemia mieloide con maturazione. Fegato: un infiltrato perivascolare di elementi mieloidi neoplastici caratterizzati da prominenti evidenze morfologiche di maturazione granulocitaria. Ematossilina Eosina,