Attuazione della direttiva 98/83/EC. Recepita in Italia con Il DL.vo del 2 febbraio 2001 n 31 e successive modifiche ed integrazioni (DL.

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2 Attuazione della direttiva 98/83/EC Recepita in Italia con Il DL.vo del 2 febbraio 2001 n 31 e successive modifiche ed integrazioni (DL.vo 27/2002)

3 E. coli 0 (numero/100 ml) Enterococchi 0 (numero/100 ml) Per le acque in vendita in bottiglie e contenitori: E. coli 0/250 ml Enterococchi 0/250 ml Pseudomonas aeruginosa 0/250 ml Conteggio colonie a 22 C 100/mL Conteggio colonie a 37 C 20/mL

4 Clostridium perfringens (spore) 0 /100 ml Conta batterica a 22 C senza variazioni anomale Batteri coliformi a 37 C 0 /100 o 250 ml

5 Alghe Batteriofagi anti E.coli* Nematodi a vita libera Enterobatteri patogeni* Enterovirus* Funghi Protozoi Pseudomonas aeruginosa Stafilococchi patogeni*

6 Parametri per i quali sono specificati i metodi di analisi: Batteri coliformi ed E. coli ISO Enterococchi ISO Pseudomonas aeruginosa ISO Conteggio delle colonie a 22 C ISO 6222 Conteggio delle colonie a 37 C ISO 6222 Clostridium perfringens non sono definiti, né richiesti dati di prestazione

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8 II SOTTOCOMMISSIONE DI STUDIO METODI ANALITICI Coordinatore generale: M. Ottaviani, Istituto Superiore di Sanità Gruppo di lavoro Metodi microbiologici e biologici Coordinatore: L. Bonadonna, Istituto Superiore di Sanità Alava F. BAS-SII, Bergamo Berchielli S. Publiacqua SpA, Firenze Bonanni E. LaboratoRI SpA (Gruppo ACEA) Bonetta S. Università del Piemonte Orientale, Alessandria Briancesco R. Istituto Superiore di Sanità, Roma Burrini D. Publiacqua SpA, Firenze Cangini M. Centro Ricerche Marine S conspa, Cesenatico Carraro E. Università del Piemonte Orientale, Alessandria Cataldo C. Istituto Superiore di Sanità, Roma de Lellis L. HERA SpA, Ravenna Della Libera S. Istituto Superiore di Sanità, Roma Divizia M. Università di Tor Vergata, Roma Donia D. Università di Tor Vergata, Roma Ferrara L. ARPA Piemonte, Novara Ferrari G. ASL di Vallecamonica-Sebino, Darfo Boario Terme Fronticelli Baldelli A. HERA SpA, Ravenna Garizio M. Società Metropolitana Acque Torino SpA, Torino Graziani G. Romagna Acque - Società delle Fonti SpA, Forlì Mancini F. HERA SpA, Ravenna Manuppella A. ARPA Molise, Isernia Miana P. VESTA SpA, Venezia Mirolo G. ARPA, Ferrara Montemurro P. Acquedotto Pugliese SpA, Bari Nusca A. Istituto Superiore di Sanità, Roma Palumbo F. Iride Acqua Gas SpA, Genova (ex Az. Mediterranea Gas e Acqua - AMGA SpA) Panà A. Università di Tor Vergata, Roma Piovano B. ARPA Piemonte, Torino Pompei M. Centro Ricerche Marine S conspa, Cesenatico Sangiuolo A. ARPA Liguria, Genova Semproni M. Istituto Superiore di Sanità, Roma Viglione D. ARPA Liguria, Genova

9 Rapporto ISTISAN 07/5 raccoglie i metodi microbiologici Sostituisce o integra le metodiche dei Rapporti ISTISAN 97/8 e 00/14

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11 Aeromonas Batteriofagi RNA F-specifici Giardia

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13 metodi con dati di prestazione NO Sì Rapporti ISTISAN 07/5 : Standard Methods (APHA) AOAC ISO CEN UNI APAT-IRSA 2003 EPA Colilert 18 Quanti Tray (E. coli e coliformi a 37 C) m Endo Agar Les (coliformi) ISO (E. coli e coliformi) ISO (enterococchi) ISO (Pseudomonas aeruginosa)

14 Partecipanti ai confronti interlaboratorio per gli studi di comparazione Coordinatore: L. Bonadonna, Istituto Superiore di Sanità BAS-SII, Bergamo ARPA Emilia Romagna, Forlì ARPA Molise, Isernia ARPA Emilia Romagna, Ferrara Publiacqua SpA, Firenze LaboratoRI SpA (Gruppo ACEA) Iride Acqua Gas SpA, Genova (ex Az. Mediterranea Gas e Acqua - AMGA SpA) Istituto Superiore di Sanità, Roma Centro Ricerche Marine S. cons.p.a., Cesenatico VESTA SpA, Venezia ARPAT Toscana, Pistoia ASL di Vallecamonica-Sebino, Darfo Boario Terme LaboratoRI SpA (Gruppo ACEA) Acquedotto Pugliese SpA, Bari Università di Helsinki, Finlandia Università La Sapienza, Roma ARPA Lombardia, Brescia ARPA Piemonte, Torino ARPA Liguria, Genova

15 Metodo di riferimento (ISO ): MF su terreno agarizzato al lattosio TTC con eptadecilsolfato Metodo alternativo MPN a multi-pozzetto : Nel 1989 L Environmental Protection Agency americana (US EPA) ha approvato il metodo e le sue successive modifiche sotto il nome di MMO-MUG test Nel 1996, Il metodo è stato riportato dal Manuale Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, sotto il nome di Enzyme Substrate Coliform Test Dal 1995 l Association of Official Analytical Chemists (AOAC) ha approvato il metodo con il nome di Defined Substrate Technology (Colilert) È riconosciuto per l analisi delle acque potabili nella gran parte dei paesi dell Unione Europea e in alcune decine di paesi nel mondo ed è riportato nel Manuale dei APAT-IRSA Metodi Analitici per le Acque del 2003

16 Valutazione delle prestazioni del metodo - programma di prove tra 4 laboratori: Sensibilità: 99% Specificità: 98 % Recupero (E. coli ATCC 25922): 108% Escherichia coli: Ripetibilità = 0,000; Riproducibilità = 0,004 Intervalli di confidenza: corrispondenti a quelli calcolati sulla base della formula MPN = N x ln N/N-X (dove N = numero totale di pozzetti e X = numero di pozzetti risultati positivi) Valutazione dell equivalenza del metodo (ISO 17994) - programma di prove tra 9 laboratori: Normalità (Rankit plots - Wilk-Shapiro): 99% N. colonie sottoposte a conferma 2145 : tasso di conferma 85% Differenza media relativa minima significativa delle conte confermate rispetto a UNI EN ISO : + 8% Valutazione dell equivalenza del metodo (ISO 17994) - programma di prove tra 9 laboratori: N Colonie sottoposte a conferma 5185: tasso di conferma 32%

17 Terreno Slanetz e Bartley Prova dell idrolisi dell esculina

18 Valutazione delle prestazioni del metodo - prove intra-laboratorio: Specificità: tasso falsi positivi: 10%; tasso falsi negativi: 12% Recupero (Enterococcus faecalis ATCC 29212): 81% Precisione, come massima deviazione standard relativa: 21%

19 Metodo UNI EN 12780:2002 Sostituito dalla norma ISO è cambiato il campo di applicazione

20 Valutazione delle prestazioni del metodo - prove intra-laboratorio : Tasso falsi positivi: 64%; tasso falsi negativi: 0% Specificità (colonie verdi tipiche): 98% Specificità (colonie fluorescenti tipiche): 23% Recupero (Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027): 15% Precisione, come massima deviazione standard relativa: 12%

21 Valutazione delle prestazioni del metodo - programma di prove tra 4 laboratori : Sensibilità: 100% Specificità: 98% Recupero (E. coli NCTC 9001, Kl. aerogenes NCTC 9528): 110% Klebsiella pneumoniae: Ripetibilità = 0,008; Riproducibilità = 0,007 Intervalli di confidenza: corrispondenti a quelli calcolati sulla base della formula MPN = Nx ln N/N-X (dove N = numero totale di pozzetti e X = numero di pozzetti risultati positivi) Valutazione dell equivalenza del metodo (ISO 17994) - programma di prove tra 9 laboratori: Normalità (Rankit plots - Wilk-Shapiro): 97% N. colonie sottoposte a conferma 4263 (n % di z =90%); tasso di conferma 89% Differenza media relativa minima significativa delle conte confermate rispetto a UNI EN ISO : + 65% m-endo agar LES alternativo Valutazione delle prestazioni del metodo - programma di prove tra laboratori : Sensibilità: 87% Specificità: 80% Valutazione dell equivalenza del metodo (ISO programma di prove tra 7 laboratori: Normalità (Rankit plots - Wilk-Shapiro): 97% N Colonie sottoposte a conferma 4606 (n % di z =92%); tasso di conferma 71% Differenza media relativa minima significativa delle conte confermate rispetto a UNI EN ISO :+ 31% Terreno agarizzato al lattosio TTC con eptadecilsolfato (UNI EN ISO ) Programma di prove tra 15 laboratori per la valutazione dell equivalenza (ISO 17994) : N Colonie sottoposte a conferma (n % di z =88%); tasso di conferma 49%

22 Metodo di riferimento : m-cp agar (Allegato III) fornisce risultati variabili e bassi valori di recupero del microrganismo Metodo alternativo : proposto nel 2005, dall Health Protection Agency (HPA) come metodo standard in Gran Bretagna

23 Parametro Rif. 31/2001 Metodi Alghe Avvertenza 1 Batteriofagi anti-e.coli Avvertenzq 3 Batteriofagi RNA specifici Supplementare 1 Aeromonas Supplementare 1 Nematodi a vita libera Avvertenza 2 Enterovirus Avvertenza 1 Funghi Avvertenza 3 Giardia e Cryptosporidium Avvertenza e nota 2 Stafilococchi patogeni Avvertenza 2 Enterobatteri patogeni: Salmonella Vibrio Shigella Avvertenza 3 1 3

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