Elettroforesi = migrazione in campo elettrico Molte molecole di interesse biologico possiedono gruppi ionizzabili. In opportune condizioni di ph presentano una carica elettrica + o e quindi sono in grado di migrare in un campo elettrico. Se e V = voltaggio applicato d = distanza tra gli elettrodi E = V/d gradiente di potenziale elettrico La molecola di carica q (coulomb) subisce una forza Eq (newton) Se f = coefficiente frizionale (dipende dalla massa, dalla forma della molecola e dalla viscosità del mezzo), la velocità di migrazione v è data da : v = Eq f Spesso si utilizza il termine mobilità elettroforetica (v/e)
Cameretta elettroforetica Alimentatore V=IR (legge di Ohm) W =VI= I 2 R (legge di Joule)
Agarosio E un polimero di agarobiosio (polisaccaride componente dell agar). Viene sciolto (0,6% fino 3% w/vol) al calore in opportuno tampone, versato nella cella elettroforetica e lasciato raffreddare Supporti per l elettroforesi OH O CH 2 OH O OH O O OH O O
Supporti per l elettroforesi - Acrilamide Acryl/BisAcryl (37.5:1) (29:1) (19:1) Catalizzatori della polimerizzazione: TEMED (N,N,N',N -tetrametiletilendiammina) catalizza la decomposizione dell APS nello ione persolfato con produzione del corrispondente radicale libero
Il supporto agisce da setaccio molecolare _ +
- condizioni non denaturanti - le proteine si separano in base a: PolyAcrylamide Gel Electrophoresis peso molecolare carica
5 15 45 65 Electrophoresis Time (Minutes)
Discontinuous SDS-PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis in SDS stacking gel (4% acrilammide, ph6.8) resolving gel (12% acrilammide, ph8.8) - condizioni denaturanti - le proteine si separano in base a: peso molecolare
Stacking gel (4%) ph 6.8 serve per concentrare le proteine in un unica banda e portarle nel resolving gel tutte nello stesso momento Separating gel (7-20%) ph 8.8 consente la separazione delle proteine in base al loro peso molecolare
SDS-PAGE si effettua in condizioni denaturanti e riducenti SDS si lega alle proteine nel rapporto 1g proteina: 1,4 g SDS 1 molecola di SDS ogni due aminoacidi ciò impartisce una densità di carica uniforme alle proteine agenti riducenti (2- mercaptoetanolo/dtt) rompono ponti disolfuro inter e intra-catena la denaturazione è completata da calore (campioni bolliti per 5 )
-Proteine caricate in tampone con blu di bromofenolo -Presenza di uno standard Visualizzazione della corsa elettroforetica Possibilità di colorazione
Colorazione delle bande di proteine.1 Blu di Coomassie
Il blu di Coomassie ci rivela anche se le nostre proteine si sono separate correttamente
Colorazione delle bande di proteine.2 Silver staining
Colorazione delle bande di proteine.3 Individuazione di attività enzimatica mediante colorazione specifica
Acquisizione
Quantificazione-costruzione una retta di taratura
log Determinazione del PM di una proteina mediante SDS-PAGE In un gel di acrilammide e SDS la mobilità relativa di una specie molecolare è inversamente proporzionale al log della massa molecolare.
La carica elettrica di una proteina dipende dai residui aa carichi (acidi o basici) esposti sulla superficie. Le proteine hanno un PUNTO ISOELETTRICO (pi) che corrisponde al valore di ph a cui hanno carica nulla. _ + + + _ +
ISOELECTROFOCUSING (IEF) Sfrutta il principio per cui la carica netta della delle proteine cambia con il ph del mezzo Le proteine si possono separare elettroforeticamente in base ai loro pi
La corsa elettroforetica viene effettuata in un gel in cui è stato preformato un gradiente di ph utilizzando una miscela di polianfoliti. Al punto isoelettrico (pi) la carica netta è = 0 e pertanto la mobilità elettroforetica è = 0.
Elettroforesi bidimensionale Sfruttando contemporaneamente due diverse proprietà delle proteine si può ottenere una migliore separazione elettroforetica di miscele molto complesse (ad es. estratti citoplasmatici totali).
Elettroforesi di DNA (TAE, TBE) in loading buffer
_ Separazione di frammenti di DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio colorato con etidio bromuro +
Separazione di frammenti di restrizione
Corsa di amplificati di PCR C NT NT NT TG TG TG TG TG NT NT IL-2 hsod1
Corsa di RNA
Si possono separare anche frammenti di DNA che differiscono di un solo nucleotide (gel di PA) Metodo di Sanger (sequenziamento DNA)
Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) Inizio corsa Complessi oligonucleotide/proteina Fine corsa (oligonucleotide libero)