Polimorfismi LEZIONE 6 By NA 1
* Polimorfismo Variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1% Variazioni nell aspetto By NA 2
Polimorfismo proteico Variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1% che cosa mi dice questo gel? Che nella popolazione esistono piu fenotipi di questo enzima: fast, medium, slow: esistono 3 alleli a questo locus. La velocita della corsa dipende dalla carica della molecola, quindi ci sono delle sostituzioni amminoacidiche che modificano la carica. Queste sostituzioni non coinvolgono siti importanti per la funzione della proteina perche a meno di fare il gel non e possibile individuare le molecole varianti. Cioe a livello del fenotipo funzione della proteina, o fenotipo salute dell individuo gli M, gli F, o MF, MS sono indistinguibili. By NA 3
Polimorfismo proteico Variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1% Perche trovo individui MF, MS,? Perche non ho trovato individui solo S? HW: dipende dalla frequenza nella popolazione dell allele S Ovviamente la sostituzione amminoacidica corrisponde ad una mutazione nel DNA e se conosco la sequenza del DNA forse riesco a individuare un fenotipo variante del DNA cioe un polimorfismo del DNA By NA 4
* Polimorfismo del DNA Polimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP), minisatellite, microsatellite. Individuabili con southern blotting o PCR * Polimorfismi del DNA: sono mutazioni nella sequenza che modificano il fenotipo della sequenza. Questo fenotipo non e visibile a livello dell aspetto dell individuo perche per definizione il polimorfismo non modifica la funzione. * Una mutazione nella sequenza non viene definita polimorfismo, ma mutazione patogena quando la posso ricondurre ad un fenotipo patologico. By NA 5
& & Polimorfismo PCR Mini e micro satelliti: Riconosciuti su gel dopo amplificazione con PCR By NA 6
DNA genomico digerito con Enzimi di restrizione gel di agarosio colorato con EtBr Il righello serve per calcolare la lunghezza dei frammenti in funzione dello spazio percorso (cfr.foto succ. Marker per sapere come si sono distribuiti i frammenti La luminosita nei pozzetti deriva da DNA non ben digerito e/o da impurita per una estrazione poco accurata Questa banda piu intensa e data da sequenze ripetute che essendo tagliate periodicamente e in frammenti sempre della stessa lunghezza si accumulano alla stessa altezza La intensita equivalente del DNA delle diverse corsie indica che le quantita caricate di DNA dei campioni sono le stesse. Il DNA a basso peso verso il fondo del gel si vede male perche sono meno rappresentati infatti la maggior parte del DNA e nella parte alta del gel By NA 7
* Polimorfismo RFLP Polimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP), minisatellite, microsatellite. & RFLP: La sonda riconosce il polimorfismo con un particolare enzima, ma non con altri. Quindi e la coppia sonda-enzima che evidenzia il RFLP Enzima A Enzima B A1 B1 B2 A2 A3 A1 B1 B2 mutazione elimina il sito di restrizione A3 endonucleasi A endonucleasi B Pattern di ibridazione su filtro By NA 8
cdna di COL1A2 Il cdna di COL1A2 A1 14Kb A2 3.5Kb 10.5Kb A1 A3 A2 EcoR1 GEL filtro ibridato con cdna By NA 9
RFLP del cdna di COL1A2 In questo gruppo di individui il cdna riconosce nel genoma dopo digestione 2 frammenti di = lunghezzae : 14 kb perche su entrambi i cromosomi in quella regione non e presente un altro sito QUINDI UNA SOLA BANDA A1 A1 14Kb 14Kb A2 A2 Omozigoti per allele 14:14/14 In questo gruppo di individui il cdna riconosce nel genoma dopo digestione 4 frammenti 2 da 10.5 e 2 da3.5 kb perche su entrambi i cromosomi in quella regione e presente un altro sito che cade all interno della regione identificata dal cdna. QUINDI 2 BANDE 3.5Kb A1 3.5Kb A1 A3 10.5Kb 10.5Kb A2 A2 Omozigoti per allele 10.5,3.5: 10.5,3.5/ 10.5,3.5 In questo gruppo di individui il cdna riconosce nel genoma dopo digestione 3 frammenti : 1 da 10.5 e 1 da3.5 kb originati dalla digestione di un cromosoma (perche e presente un altro sito che cade all interno della regione identificata dal cdna) e 1 frammento da 14 originato dalla digestione dell altro cromosoma. QUINDI 3 BANDE A1 3.5Kb A1 14Kb A3 10.5Kb By NA 10 A2 A2 Eterozigoti per alleli 14 e10.5,3.5 14/10.5,3.5
Lunghezza dei frammenti Alleli identificati dall ibridazione su Southern I1 I2 II1 II2 I3 I4 III1 III2 III3 III4 III5 III6 III7 III8 Possibile interpretazione dei risultati & Polimorfismo RFLP esempio I II 1 2 3 4 1 2 III 1 2 3 4 5 6 7 8 By NA 11
due individui, tre enzimi La sonda viene testata sul filtro dove e stato trasferito il DNA di due soggetti non imparentati. Il DNA e stato digerito con tre enzimi in tre reazioni distinte. B=BamHI E= EcoRI H=HindIII Le tre corsie del gel hanno un aspetto diverso: B presenta un accumulo nella parte alta del gel, E ed H sono piu omogenei. Questo dipende dal quanto spesso l enzima trova la sua sequenza bersaglio e quindi se i frammenti sono piu o meno lunghi. La digestione B di Kwa non e particolarmente riuscita: c e una sfrangiatura che segnala la presenza DNA parzialmente indigerito, inoltre la quantita di DNA caricata e superiore a quella dell altro soggetto (la luminosita e piu forte). Gel Filtro corrispondente Dopo ibridazione si vede che la sonda si e legata a frammenti di lunghezza diversa:e che i soggetti hanno gli stessi siti E ed H, mentre sono diversi per B. By NA 12
due individui, tre enzimi B=BamHI E= EcoRI H=HindIII H E B B*E H B 10KB 3.7KB 2.8 13KB Gel Filtro corrispondente Evidentemente c e un sito B polimorfico perche un soggetto e omozigote per 2.8 e l altro per 13. La lunghezza dei frammenti mi permette di costruire una mappa di restrizione e di mappare la sonda rispetto ai siti. La differente quantita di DNA fra i due campioni e evidente dalle diverse dimensioni del segnale E quindi presente un polimorfismo, probabilmente frequente nella popolazione: infatti se prendendo due individui a caso nella popolazione trovo due eterozigoti e probabile che gli eterozigoti siano frequenti. Per gli altri due siti non si puo dire se siano polimorfici o no: due individui sono troppo pochi per escluderlo. By NA 13
SNPs La sostituzione di una base puo provocare la perdita o l insorgenza di un sito di restrizione, utilizzando PCR e digestione dell amplificato si puo rapidamente evidenziare l avvenuto cambiamento senza utilizzare il southern, il radioattivo etc.. 1241bp 750bp 491bp Gene qualunque: non e importante chi e e il concetto che conta L allele X T e X C sono distinguibili dopo digestione con TaqI. L amplificato e di 1241 bp dopo digestione se e presente la sostituzione si hanno 2 bande X C X C X C X T X C X C X C X C By NA 14
SNPs Gene qualunque: non e importante chi e e il concetto che conta L allele X T e X G sono distinguibili dopo digestione con PvuII. L amplificato e di 1392 bp dopodigestione se e presente la sostituzione si hanno 2 bande: 1163 e 229 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1392bp 1163bp La banda di 229 non si vede 1, 2, 4, 7, 8 sono eterozigoti X T X G 3,9, 12 sono omozigoti X T X T 5,6,10, 11 sono omozigoti X G X G By NA 15
SNPs Gene qualunque: non e importante chi e e il concetto che conta L allele Y T e Y C sono distinguibili dopo digestione con HgaI. Y T non si digerisce e rimane di 220 bp, Y C origina due bande 180bp e 40bp (che non si vede) C 0 1 2 3 4 5 6 7 220bp 180bp C 0 controllo senza DNA :il bianco e importante nella PCR come il marker 3 omozigote Y T Y T - 1, 4, 6, 7, omozigoti Y C Y C - 2, 5 eterozigoti Y C Y T By NA 16
PCR SSCP : Single Strand Conformational Polymorphism Omozigote W ild-type C G C G Eterozigote C G A T OmozigoteMutante A T A T Denaturazione C G C G C G A T T T A A Reverse G 1 2 3 Reverse T A Caricamento su gel C Forward Omo W T etero Omo mut Forward VARIAZIONI ANCHE DI 1 SOLA BASE PROVOCANO UNA DIFFERENZA NELLA CORSA SU GEL Questo test si utilizza per identificare la variazione di una base senza dover ricorrere al sequenziamento. Si possono identificare il 70%-95% delle mutazioni di singola base in frammenti di lunghezza inferiore alle 200pb. By NA 17
DHPLC By NA 18
Il materiale didattico e presente in rete: http://www.dipartimentodibiologiabari.it/didattica NON sono dispense, ma un ausilio allo studio sul libro By NA 19