Indice IX X Prefazione Il codice genetico e la nomenclatura a singola lettera degli aminoacidi Capitolo 1 LA MANIPOLAZIONE GENICA, UNA TECNICA DALLE VASTE 1 APPLICAZIONI 1 Introduzione 1 Sequenziamento di DNA 2 Analisi biochimica in vivo 3 La medicina molecolare 4 Una nuova industria: le biotecnologie 5 SCHEDA 1.1 LA NASCITA DI UN INDUSTRIA 5 Il ruolo centrale di E. coli 5 Argomenti di questo libro Capitolo 2 LE TECNICHE 8 DI BASE 8 Introduzione 8 Il problema di base 8 Gli strumenti tecnici 9 Elettroforesi in gel di agarosio 11 Il trasferimento degli acidi nucleici su membrana (blotting) 11 Southern blotting 12 SCHEDA 2.1 IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI TRASFERITI SU MEMBRANA 13 Northern blotting 14 SCHEDA 2.2 IL PRINCIPIO DELL AUTORADIOGRAFIA 15 Western blotting 16 Tecniche alternative di blotting 17 La trasformazione di E. coli 18 Elettroporazione 18 La trasformazione di altri organismi 19 La reazione a catena della DNA polimerasi (Polymerase Chain Reaction, PCR) 19 La reazione di base 20 RT-PCR (PCR su RNA retrotrascritti) 21 SCHEDA 2.3 LA REAZIONE A CATENA DELLA DNA POLIMERASI PERMETTE DI OTTENERE IN MODO SEMPLICE UN ENORME AMPLIFICAZIONE DI SPECIFICHE SEQUENZE BERSAGLIO 21 PCR estesa ad alta fedeltà di incorporazione (Long Accurate PCR, LA-PCR) 22 I principali fattori che influenzano la PCR 22 PCR quantitativa in tempo reale Capitolo 3 TAGLIO E SALDATURA 25 DI MOLECOLE DI DNA 25 Taglio di molecole di DNA 25 Restrizione e modificazione mediata dall ospite 26 Tipi di sistemi di restrizione-modificazione (sistemi R-M) 27 SCHEDA 3.1 LA RESTRIZIONE: DA SISTEMA NATURALE DI CONTROLLO DELLA GENETICA BATTERICA A STRUMENTO RIVOLUZIONARIO DELLE TECNOLOGIE DEL DNA RICOMBINANTE 28 Nomenclatura dei sistemi R-M 28 I siti di riconoscimento 29 Numero e dimensione dei frammenti di restrizione 30 Taglio e saldatura di molecole di DNA: variazioni sul tema 30 Le metilasi Dam e Dcm di E. coli
IV Indice 88-08- 9031 31 L importanza dell eliminazione dei sistemi di restrizione nei ceppi di E. coli utilizzati come ospiti di molecole ricombinanti 32 Importanza della qualità degli enzimi di restrizione 32 La saldatura di molecole di DNA 33 Le DNA ligasi 34 SCHEDA 3.2 UTILIZZO DELL X-GAL PER VERIFICARE LA α-complementazione DELL ATTIVITÀ β-galattosidasica 34 Adattatori 36 Sintesi di code omopolimeriche con la terminal transferasi 38 La saldatura di frammenti prodotti mediante PCR 39 Incorporazione di sequenze extra al 5 del primer in un prodotto di PCR 40 La saldatura non enzimatica di molecole di DNA Capitolo 4 LA BIOLOGIA DI BASE DEI VETTORI PLASMIDICI 41 E FAGICI 41 Caratteristiche essenziali dei plasmidi e vettori plasmidici di base 43 Lo spettro d ospite dei plasmidi 43 Il numero di copie dei plasmidi 45 La ripartizione dei plasmidi e la stabilità segregativa 45 Incompatibilità tra plasmidi 45 La purificazione del DNA plasmidico 47 Caratteristiche desiderabili dei plasmidi come vettori di clonaggio 47 pbr322, il capostipite dei vettori plasmidici artificiali 50 Il batteriofago λ Caratteristiche essenziali 52 SCHEDA 4.1 L IMPORTANTE RUOLO DEL BATTERIOFAGO λ NELLA BIOLOGIA MOLECOLARE E NELLE TECNOLOGIE DEL DNA RICOMBINANTE 52 Promotori e sistemi di controllo 54 Organizzazione del DNA nei vettori λ 55 Vettori λ avanzati 56 L impaccamento in vitro del DNA di λ 57 Clonaggio in vettori a DNA a singolo filamento 57 La biologia dei colifagi filamentosi 59 Utilizzi dei vettori a singolo filamento 59 Lo sviluppo dei vettori basati sui fagi filamentosi Capitolo 5 COSMIDI, FASMIDI 61 E ALTRI VETTORI AVANZATI 61 Introduzione 61 Vettori per il clonaggio di grandi frammenti di DNA 61 Vettori cosmidici 64 I vettori BAC e PAC come alternativa ai cosmidi 66 Scelta del vettore di clonaggio 67 Vettori per applicazioni specializzate 67 Vettori in grado di produrre DNA a singolo filamento per il sequenziamento 67 Vettori di espressione 68 Vettori per la preparazione di sonde a RNA 69 Vettori che massimizzano la sintesi proteica 72 Vettori che semplificano la purificazione delle proteine ricombinanti 73 SCHEDA 5.1 OTTIMIZZAZIONE DELL EFFICIENZA DI TRADUZIONE 77 SCHEDA 5.2 INTEINE, EXTEINE E LO SPLICING DI PROTEINE 77 Vettori che favoriscono la solubilizzazione delle proteine espresse 79 Vettori che promuovono l esportazione delle proteine 80 Vettori di espressione a multifunzione Capitolo 6 STRATEGIE 82 DI CLONAGGIO 82 Introduzione 83 Il clonaggio di DNA genomico 83 Le genoteche di DNA genomico 88 La PCR come alternativa al clonaggio di DNA genomico 89 Il clonaggio di cdna 89 Proprietà del cdna 89 Genoteche di cdna 90 SCHEDA 6.1 VETTORI λ PER IL CLONAGGIO E L ESPRESSIONE DI CDNA 91 Preparazione dei cdna per la generazione di genoteche 95 Il clonaggio di cdna interi 96 La PCR come alternativa al clonaggio di cdna 98 SCHEDA 6.2 USO DELLE EXPRESSED SEQUENCE TAGS (EST) NELLA GENOMICA 100 Strategie di analisi (screening) delle genoteche 100 Analisi di genoteche basata sulla sequenza dei cloni
88-08-07581-8 Indice V 102 SCHEDA 6.3 IBRIDAZIONE DI GENOTECHE DI RIFERIMENTO ORGANIZZATE IN SET DI CLONI ORDINATI (ARRAYED LIBRARIES O GRIDDED LIBRARIES) 104 SCHEDA 6.4 UNA PIETRA MILIARE DELLA LETTERATURA SCIENTIFICA: L IDENTIFICAZIONE DEL GENE DELLA FIBROSI CISTICA MEDIANTE CHROMOSOME WALKING E CHROMOSOME JUMPING 105 Analisi delle genoteche di espressione (clonaggio di espressione) 110 Clonaggio differenziale 110 Clonaggio differenziale con genoteche di DNA 111 SCHEDA 6.5 ANALISI DIFFERENZIALE MEDIANTE CHIP DI DNA 112 SCHEDA 6.6 UNA PIETRA MILIARE DELLA LETTERATURA SCIENTIFICA: IL CLONAGGIO PER SOTTRAZIONE DEL GENE UMANO DELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE (DMD) 112 Clonaggio differenziale mediante PCR Capitolo 7 SEQUENZIAMENTO 115 E MUTAGENESI 115 Introduzione 115 Le tecniche di base per il sequenziamento di DNA 116 Modifiche del protocollo di sequenziamento mediante terminatori dideossi 118 Il sequenziamento automatico di DNA 120 Accuratezza delle sequenze 121 Sequenziamento di interi genomi 121 Analisi dei dati di sequenza 121 I database di sequenze 121 Analisi dei dati di sequenza 125 Ricerche nei database 126 La mutagenesi sito-specifica 127 Mutagenesi a cassetta 127 Mutagenesi per estensione di un primer: il metodo a singolo oligonucleotide 129 Metodi di mutagenesi sito-specifica basati sulla PCR 129 Selezione di peptidi mutanti tramite phage- e phasmid-display 132 Mutagenesi sito-specifica in vivo Capitolo 8 IL CLONAGGIO IN BATTERI 133 DIVERSI DA ESCHERICHIA COLI 133 Introduzione 133 Introduzione di DNA in cellule batteriche 134 Mantenimento del DNA ricombinante all interno di un nuovo ospite 135 SCHEDA 8.1 TRASFORMAZIONE DI BACILLUS SUBTILIS CON DNA PLASMIDICO 137 Integrazione del DNA ricombinante 138 Clonaggio in batteri Gram-negativi diversi da E. coli 139 Vettori derivati dal gruppo di plasmidi IncQ: il plasmide RSF 1010 139 Vettori derivati dai plasmidi del gruppo IncP 140 Vettori derivati dal plasmide Sa del gruppo IncW 141 Vettori derivati da pbbr1 141 Clonaggio in batteri Gram-positivi 142 Vettori per il clonaggio in Bacillus subtilis ed altri organismi a basso contenuto di GC 142 Influenza della modalità di replicazione del DNA: vettori derivati da pamβ1 144 SCHEDA 8.2 LE DUE MODALITÀ DI REPLICAZIONE DEI DNA CIRCOLARI 145 Trascrizione e traduzione 146 Espressione controllata in B. subtilis ed in altri ospiti a basso contenuto di GC 146 Vettori di secrezione per i batteri a basso contenuto di GC 146 Vettori per l inattivazione sistematica di geni 147 Clonaggio in streptomiceti 148 Vettori per gli streptomiceti 149 Ricombinazione omeologa Capitolo 9 CLONAGGIO IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE 150 ED IN ALTRI FUNGHI 150 Introduzione 150 Introduzione di DNA nei funghi 151 Il destino del DNA introdotto nei funghi 152 Vettori plasmidici utilizzabili nei funghi 152 Plasmidi episomici di lievito 152 Plasmidi replicativi di lievito 153 Plasmidi centromerici di lievito 153 Cromosomi artificiali di lievito 153 Vettori retrovirus-simili 154 Scelta del vettore per il clonaggio 158 Costruzione di plasmidi mediante ricombinazione omologa in lievito 158 Espressione dei geni clonati 159 Sovraespressione di proteine in funghi 160 SCHEDA 9.1 IL METABOLISMO DEL GALATTOSIO ED IL SUO CONTROLLO IN S. CEREVISIAE 162 Vettori specializzati
VI Indice 88-08-07581-8 163 Surface display in lievito 163 Individuazione di interazioni proteinaproteina 164 Identificazione di geni che codificano per specifiche attività cellulari 165 SCHEDA 9.2 VARIAZIONI SUL TEMA DEL SISTEMA A DUE IBRIDI 166 Attribuzione della funzione associata ai geni isolati 201 Possibili applicazioni dei topi geneticamente modificati 203 SCHEDA 11.1 EFFETTO DI POSIZIONE 205 Altri mammiferi ed uccelli 208 Trasferimento di DNA in altri vertebrati 208 Trasferimento genico in Xenopus 210 Trasferimento genico nei pesci 211 Trasferimento di DNA in invertebrati 211 Mosche transgeniche Capitolo 10 TRASFERIMENTO GENICO 169 IN CELLULE ANIMALI 169 Introduzione 169 Panoramica sulle strategie di trasferimento genico 170 Trasformazione mediata da DNA 170 Tecniche di trasformazione 172 Trasformazione con DNA non replicativo 172 SCHEDA 10.1 GENI REPORTER E ANALISI DI PROMOTORI 179 Trasformazione con vettori contenenti repliconi 182 Trasferimento genico mediante trasduzione virale 182 Principi generali di funzionamento dei vettori virali 183 Adenovirus 184 Virus adenoassociato 185 Baculovirus 186 Vettori basati su herpesvirus 188 Vettori retrovirali 190 Sindbis virus e Semliki forest virus (alfavirus) 191 Il virus del vaiolo vaccino ed altri vettori basati su poxvirus 193 Riassunto dei sistemi di espressione per le cellule animali 193 SCHEDA 10.2 REALIZZAZIONE DI COSTRUTTI PER OTTENERE ALTI LIVELLI DI ESPRESSIONE IN CELLULE ANIMALI Capitolo 12 IL TRASFERIMENTO GENICO 214 NELLE PIANTE 214 Introduzione 214 Il callo e la coltivazione in vitro di cellule vegetali 217 Panoramica sulle strategie di trasferimento genico 217 Trasformazione mediata da Agrobacterium 217 Tumore del colletto (crown-gall disease) 218 Plasmidi che inducono tumori: i plasmidi Ti 219 Il trasferimento del T-DNA 220 Plasmidi Ti disarmati come vettori per il trasferimento genico nelle piante 222 SCHEDA 12.1 IL CONTROLLO DELL ESPRESSIONE DEI GENI ESOGENI NELLE PIANTE 223 SCHEDA 12.2 MARCATORI DI SELEZIONE NELLE PIANTE 225 Una semplice procedura sperimentale per la trasformazione mediata da Agrobacterium 227 Agrobacterium e le monocotiledoni 227 Vettori binari ad alta capacità 228 Agrobacterium rhizogenes e plasmidi Ri 229 Trasferimento diretto di DNA alle piante 229 Trasformazione di protoplasti 229 Bombardamento con particelle 230 Altri metodi per il trasferimento genico diretto 231 Trasformazione in planta 231 Trasformazione di cloroplasti 232 I virus delle piante come vettori 233 I virus a DNA come vettori di espressione 235 I virus a RNA come vettori di espressione Capitolo 11 MANIPOLAZIONE GENETICA 196 DEGLI ANIMALI 196 Introduzione 197 Manipolazione genetica in mammiferi 197 Metodi per la produzione/generazione di topi transgenici 199 Gene targeting in cellule ES Capitolo 13 PROGRESSI DELLE TECNICHE 237 DI TRANSGENESI 237 Introduzione 237 Sistemi di espressione inducibili 237 Promotori inducibili endogeni 238 Sistemi inducibili ricombinanti
88-08-07581-8 Indice VII 243 Applicazioni della ricombinazione sito-specifica 243 La ricombinazione sito-specifica 244 Delezione sito-specifica di sequenze del transgene 246 Integrazione sito-specifica del transgene 246 SCHEDA 13.1 GENI MARCATORI CON FENOTIPO RILEVABILE VISIVAMENTE 247 Ingegneria cromosomica 248 Creazione di mutanti condizionali nel topo mediante l utilizzo di Cre 249 Ulteriori metodiche transgeniche per inibire l espressione genica 249 Inibizione genica a livello dell RNA 251 SCHEDA 13.2 SILENZIAMENTO DEL TRANSGENE, COSOPRESSIONE E RNA INTERFERENCE 253 Inibizione genica a livello di prodotto proteico 255 Le tecnologie transgeniche nella genomica funzionale 255 Mutagenesi inserzionale 256 Gene tagging 258 Costrutti di intrappolamento 261 SCHEDA 13.3 INTERNAL RIBOSOME ENTRY SITE Capitolo 14 APPLICAZIONI DELLA TECNOLOGIA 263 DEL DNA RICOMBINANTE 263 Introduzione 263 Tema 1: gli acidi nucleici come strumenti diagnostici 263 Introduzione al tema 264 Individuazione di sequenze mediante ibridazione e PCR 266 Analisi comparativa di sequenze: polimorfismi di singoli nucleotidi (SNP) 267 Polimorfismi dovuti alla variazione del numero di sequenze ripetute in tandem (Variable Number Tandem Repeats, VNTR) 268 Applicazioni dei VNTR nella genetica forense 270 SCHEDA 14.1 USO DEL DNA FINGERPRINTING IN UN PROCESSO PER IMMIGRAZIONE CLANDESTINA 270 La genetica nelle datazioni e nelle ricostruzioni storiche 271 Tema 2: nuovi farmaci e nuovi trattamenti per le malattie genetiche 271 Introduzione al tema: le proteine come farmaci 271 Animali e piante transgenici come bioreattori 273 Le piante come bioreattori 274 L impatto della genomica 274 Animali transgenici come modello di patologie umane 275 SCHEDA 14.2 XENOTRAPIANTO 276 Trasferimento genico nell uomo terapia genica 279 L importanza degli SNP 280 Tema 3: lotta alle malattie infettive 280 Introduzione al tema 280 Nuove vie per la vaccinazione 284 Individuazione di bersagli molecolari per nuovi agenti antimicrobici 284 In Vivo Expression Technology (IVET) 285 Induzione di fluorescenza differenziale 286 Mutagenesi signature-tagged 286 Environomics 287 Tema 4: ingegnerizzazione di proteine 287 Introduzione al tema 287 Miglioramento di proteine terapeutiche mediante cambiamenti di singoli aminoacidi 287 Miglioramento di enzimi: la subtilisina come paradigma dell ingegnerizzazione di proteine 288 SCHEDA 14.3 VARIANTI DELLA α 1 -ANTITRIPSINA (AAT) RESISTENTI ALL OSSIDAZIONE 288 Metodi per l ingegnerizzazione di proteine: l approccio razionale 289 L ingegnerizzazione di proteine mediante «evoluzione guidata» 289 Le famiglie geniche come strumento di supporto per l ingegnerizzazione di proteine 290 Tema 5: ingegneria metabolica 290 Introduzione al tema 291 Sovraespressione pianificata di fenilalanina 292 Nuove vie per la sintesi di piccole molecole 294 Biosintesi combinatoria 295 Controllo di vie metaboliche ricombinanti mediante ingegneria metabolica 296 Ingegneria metabolica nelle cellule vegetali 298 Tema 6: selezione e coltivazione di specie vegetali nel ventunesimo secolo 298 Introduzione al tema 298 Miglioramento delle caratteristiche agronomiche 303 Modifiche delle caratteristiche produttive 304 SCHEDA 14.4 LA TECNOLOGIA DEI SEMI TERMINATORI: COME PROTEGGERE I PROPRI INVESTIMENTI 305 Epilogo: dai geni ai genomi 307 Bibliografia 364 Indice analitico