1 Capitolo 7. Recettori antigenici e molecole accessorie dei linfociti T I linfociti T hanno una doppia specificità: per i residui di MHC e per l antigene. Il recettore che riconosce questi complessi MHC-antigene prende il nome di TCR (T-Cell Receptor) ed è distribuito in maniera clonale, cioè cloni di cellule T con diverse specificità avranno diversi TCR. Le cascate biochimiche di segnalazione iniziate dal TCR non sono da esso trasdotte: questo compito viene svolto dalle proteine invarianti CD3 e ζ, che insieme al recettore formano il cosiddetto complesso TCR. La segnalazione è dunque legata a elementi estremamente variabili (il TCR) e a elementi costanti. Le cellule T esprimono altri recettori di membrana che non riconoscono l antigene ma che contribuiscono alla risposta: in generale si parla di molecole accessorie. Il ruolo fisiologico è per alcune di facilitare la segnalazione del complesso TCR, per altre di fornire secondi segnali che attivano completamente le cellule. Altre molecole accessorie ancora servono a stabilizzare il legame con le APC, in modo da garantire il tempo necessario alla trasduzione del segnale. 1.1 αβ-tcr per antigeni MHC-associati Il recettore antigenico sia dei linfociti CD4 + che dei CD8 + è un eterodimero costituito da una catena α e una β tra loro unite da un ponte disolfuro. Entrambe le catene sono costituite da un dominio simil-ig N terminale variabile, uno simil Ig costante, un dominio transmembrana e una piccola regione citoplasmatica; la porzione extracellulare è dunque simile alla porzione legante l antigene di un anticorpo, con una regione variabile e una costante sulla catena leggera e una variabile e una costante sulla catena pesante. Le regioni variabili V delle catene del TCR contengono piccole frazioni sulle quali la grande variabilità è concentrata: si parla di CDR, o Complementarity Determing Regions. Tre CDR sulla catena α sono giustapposte a tre regioni simili sulla catena β a formare la parte del recettore che riconosce i complessi peptide-mhc. La regione variabile della catena β contiene poi una quarta regione ipervariabile che è il sito di legame per i cosiddetti superantigeni. Ogni catena del TCR è codificata da più segmenti genici che subiscono riarrangiamento somatico durante la maturazione dei linfociti. In entrambe le catene la terza regione ipervariabile è composta da sequenze codificate dai segmenti genici V e J (catena α) o dai segmenti V, D, J (catena β). Le regioni costanti C di entrambe le catene formano cerniere che contengono i residui di cisteina per i ponti disolfuro. I TCR e gli anticorpi sono strutturalmente simili, ma vi sono delle profonde differenze. I TCR non esistono in froma secreta e non hanno funzioni effettrici da soli, inoltre non subiscono variazioni nella regione C e non hanno maturazione della loro affinità. 1
1.1.1 Ruolo del TCR nel riconoscimento dell antigene Il riconoscimento è mediato dalle regioni determinanti la complementarietà, o CDR, formate da entrambe le catene del TCR. Queste catene formano un singolo recettore eterodimerico responsabile sia della specificità per il peptide che per l MHC. Il sito di legame per l antigene è formato dalle sei CDR sulle due catene che formano un interfaccia molto simile a quella degli anticorpi. Il contatto tra il TCR e il complesso peptide-mhc è limitato a uno o due aminoacidi: le cellule T riconoscono dunque i loro substrati sulla base di differenze minime. L affinità del TCR per i complessi è bassa, molto più di quella della maggior parte degli anticorpi. Questa bassa affinità è probabilmente la ragione per cui sono necessarie le molecole di adesione per avere una risposta biologica. Il TCR e le sue molecole accessorie sul linfocita T si muovono in maniera coordinata ai loro ligandi sulle membrane delle APC per creare una struttura sopramolecolare detta sinapsi immunologica. 1.2 Proteine CD3 e ζ del complesso TCR Le proteine CD3 e ζ trasducono il segnale che porta all attivazione del linfocita dietro stimolo del TCR. La molecola CD3 è in realtà un insieme di tre proteine designate γ, δ e ε. Le tre proteine CD3 e la ζ sono sempre uguali in tutte le cellule T: non hanno infatti ruolo nel riconoscimento ma solo nella trasduzione del segnale. 1.2.1 Struttura Le tre proteine CD3 sono omologhe tra loro, e le regioni extracellulari di tutte contengono un singolo dominio simil-ig: queste tre proteine sono dunque membri della superfamiglia delle Ig. I domini citoplasmatici variano da 44 a 81 aminoacidi di lunghezza e ciascuno contiene una copia di una sequenza conservata detta ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) che gioca un ruolo fondamentale nella segnalazione da parte del complesso. La catena ζ ha una piccola regione extracellulare, una transmembrana e una lunga regione citoplasmatica contentente tre ITAM. L espressione del complesso TCR richiede la sintesi di tutti i suoi componenti. Nei linfociti T maturi infatti l intero complesso viene prodotto nel RE e trasportato sulla membrana. 2
1.2.2 Funzione Il primo evento intracellulare a seguito del riconoscimento antigenico è la fosforilazione dei residui di tirosina contenuti nei domini ITAM di CD3 e ζ da parte di kinasi quali Lck o Fyn. Lck si associa alle code citoplasmatiche di CD4 e CD8, Fyn a CD3. Le fosfotirosine così create diventano siti di attacco per una tirosin kinasi, ZAP-70, che viene reclutata dalla catena ζ e porterà alla variazione dell espressione genica delle cellule T. 1.3 Recettori antigenici dei linfociti γδ Il γδtcr è un secondo tipo di eterodimero espresso in un piccolo set di linfociti T αβ-negativi; questo recettore è comunque associato alle proteine CD3 e ζ. La maggioranza delle cellule con questo recettore non esprimono CD4 o CD8. Le cellule che esprimono questo recettore sono linearmente distinte da quelle che esprimono il più comune αβtcr: in totale meno del 5% dei linfociti esprime questa struttura. Queste cellule, insieme alle cellule NK-T, i linfociti B di tipo B-1 e le cellule MZ B, potrebbero rappresentare un importante collegamento tra l immunità innata e quella adattativa. Le cellule con recettore γδ non riconoscono gli antigeni peptidici MHC-associati e non sono MHC ristrette; alcune riconoscono piccole molecole fosforilate o lipidi comuni nei batteri, altre riconoscono proteine che non richiedono processamento o collaborazione delle APC. Il ruolo di queste cellule è comunque poco definito in quanto topi deficitari non si mostrano particolarmente immunodeficienti o maggiormente suscettibili alle infezioni batteriche. 1.4 Recettori antigenici delle cellule NK-T Una piccola popolazione di linfociti T esprime i markers tipici delle cellule NK: si tratta delle cellule NK-T. Le catene alfa del TCR di queste cellule hanno una diversità limitata e sono caratterizzate da un riarrangiamento caratteristico nell uomo; queste cellule fanno ancora una volta da ponte tra l immunità innata e quella adattativa. Tutte i TCR delle cellule NK-T riconoscono lipidi legati alle molecole simil-mhci CD1. Queste cellule producono rapidamente citochine quali IL-4 e IFN-γ a seguito della stimolazione. 1.5 Corecettori e recettori costimolanti nelle cellule T I corecettori sono una categoria di proteine di membrana che amplificano il segnale di TCR; queste strutture legano le molecole di MHC. I costimolanti conducono anch essi dei segnali che attivano le cellule T, ma riconoscono molecole sulle APC che non sono parte del complesso MHC-peptide. 1.5.1 CD4 e CD8: Corecettori coinvolti nell attivazione delle cellule T MHC- ristrette Le cellule T αβ mature esprimono CD4 o CD8, ma mai entrambi. Queste strutture interagiscono con entrambe le classi di MHC quando i TCR della cellula riconoscono i complessi MHC-peptide dell APC. La funzione principale è nella trasduzione del segnale al momento del riconoscimento, ma possono 3
anche aumentare l efficacia del legame tra cellula T ed APC. Nel pool dei linfociti maturi circa il 65% esprime CD4 e il 35% CD8. Struttura Entrambi i corecettori sono glicoproteine transmembrana facenti parte della superfamiglia Ig. CD4 viene espresso come monomero e presenta quattro domini simil-ig extracellulari, una regione transmembrana e una coda basica citoplasmatica. I due domini simil-ig amino terminali del CD4 legano il dominio β2 non polimorfico dell MHCII. Le molecole CD8 esistono quasi sempre sotto forma di eterodimeri di due catene dette CD8α e CD8β. Entrambe presentano un singolo dominio Ig extracellulare, una regione transmembrana e la coda citoplasmatica basica. Il dominio Ig di CD8 lega il dominio α2 non polimorfico delle molecole di MHCI. Funzione La separazione delle risposte dei linfociti CD4 + e CD8 + è dovuta alla capacità di queste molecole di legare solamente una classe di MHC e non l altra. CD4 è in grado di legare MHCII e viene espresso sui linfociti i cui TCR riconoscono i complessi peptidici di questo tipo. Quasi tutti i linfociti CD4 + sono cellule di supporto che producono citochine. CD8 è in grado di legare le molecole MHCI. Quasi tutti i linfociti CD8 + sono linfociti citotossici il cui ruolo è sradicare le infezioni intracellulari. Esistono linfociti CD4 + con funzioni citotossiche ma sono comunque MHCII ristretti. CD4 e CD8 partecipano ai primi eventi segnalatori dopo il riconoscimento del complesso MHC-peptide. Queste funzioni sono mediate da una tirosin chinasi specifica dei linfociti T che prende il nome di Lck: questo enzima è associato in modo non covalente alle code sia del CD4 che del CD8. Quando un linfocita riconosce il complesso MHC l interazione di CD4/8 con l MHC porta il corecettore e la sua Lck nelle vicinanze del CTR; Lck a questo punto fosforila i domini ITAM delle proteine CD3 e ζ e da il via alla segnalazione. 1.5.2 Recettori costimolanti ed inibitori della famiglia CD28 CD28 è una proteina che trasduce il segnale in associazione ai segnali in arrivo dal complesso TCR per attivare le cellule T naive. I linfociti T naive in generale necessitano di due segnali extracellulari distinti per proliferare e differenziare; il primo deriva dal legame dell antigene al recettore e garantisce la specificità della risposta. Il secondo segnale viene fornito da molecole che vengono definite in generale costimolatori. I costimolatori meglio definiti per i linfociti T sono chiamati B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86) e sono espressi sulle cellule dendritiche, sui macrofagi e sui linfociti B; queste molecole hanno specifici recettori sul linfocita. Il primo recettore per B7 scoperto fu la molecola CD28, espressa su quasi tutti i CD4 + e su metà dei CD8 +. Il legarsi delle molecole B7 delle APC a CD28 fornisce al linfocita il segnale per esprimere proteine anti apoptosi, per produrre fattori di crescita e citochine e per promuovere proliferazione e differenziazione. 4
Un secondo recettore per molecole B7 venne successivamente scoperto e chiamato CTLA-4; questa struttura è omologa a CD28 e viene espressa sui linfociti recentemente attivati: la sua funzione è inibire l attivazione controbilanciando i segnali in arrivo dal complesso TCR e da CD28. Molte altre strutture sono state scoperte in grado di legare le molecole B7 e sono equamente divise tra vie di attivazione e vie di terminazione. 1.5.3 CD2 e la famiglia SLAM di recettori costimolanti Un importante famiglia di proteine che gioca un ruolo nell attivazione delle cellule T ed NK è un gruppo di proteine strutturalmente legate ad un recettore detto CD2. Questo recettore contiene due domini Ig extracellulari, una regione di membrana e una lunga coda citoplasmatica. Nell uomo il principale ligando è la molecola LFA-3 (Leukocyte Function-associated Antigen 3) che è espressa in molte cellule ematopoietiche e non. CD2 è esempio di molecola accessoria che funziona sia come una molecola di adesione che come trasduttore del segnale. Un sottogruppo distinto di protine CD2 è detto SLAM (Signaling Lymphocytic Activation Molecule). Le SLAM sono proteine integrali di membrana con due domini Ig extracellulari e una coda citoplasmatica che contiene un dominio detto ITSM (Immunoreceptor Tyrosin-based Switch Motif); il dominio si lega ad un adattatore detto SAP (SLAM Associated Protein) che contiene un dominio SH2 in grado di fare da ponte tra SLAM e Fyn, una chinasi. Un importante membro della famiglia SLAM è 2B4, mutazioni in questa molecola possono seriamente danneggiare il sistema immunitario. 1.5.4 Altre molecole accessorie dei linfociti T CD44 è una glicoproteina espressa in varie cellule, tra cui linfociti T maturi, timociti, cellule B, granulociti, macrofagi, eritrociti e fibroblasti. Questa molecola lega lo ialuronato e questa proprietà è responsabile della detenzione dei linfociti T nei siti extravascolari di infezione. Le cellule CD4 + attivate esprimono una proteina della famiglia del TNF detta CD40L, che lega CD40 dei linfociti B e di altre cellule e le attiva. CD40L è quindi un importante mediatore delle funzioni helper di questi linfociti. I linfociti attivati esprimono anche il FAS ligand; l attivazione di FAS da parte di FASL porta all apoptosi ed è importante per eliminare le cellule T iperstimolate. 5