Sviluppo dei Linfociti B

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1 Sviluppo dei Linfociti B Fase Antigene-indipendente: Midollo Organi Linfoidi Secondari Fase Antigene-dipendente: Organi Linfoidi Secondari risposta ad Antigeni T-dipendenti risposta ad Antigeni T-indipendenti

2 Alcuni marcatori dei B maturi Attivazione BCR: CD19: trasmette segnale CD45 (B220): tirosin-fosfatasi Molecole di adesione: VLA-4: integrina, lega VCAM-1 CD34: lega la L-selettina Recettori per il Complemento: CD21: rec C3d CD35: rec C3b Differenziamento: CD10: sui B precursori CD43: su B immaturi Cooperazione T/B: CD80 (B7): lega CD28 e CTLA-4 sui T CD40: lega CD40L sui T

3 MATURAZIONE DEI LINFOCITI B NEL MIDOLLO

4 i Progenitori dei Linfociti B nel Midollo Progenitori marker Potenzialità e attività HSC MPP ELP (precursore linfoide precoce) CLP (progenitore linfoide comune) ckit++ ckit++ Flt3 ckit+ Rag+ ckit+ IL-7R+ Rag+ Progenitore totipotente Progenitore multipotente: CMP e ELP dà origine a T,B,NK Inizia riarrangiamento D-J catena H dà origine a T,B,NK riarrangiamento D-J catena H

5 Maturazione dei Linfociti B nel midollo HSC MPP ELP CLP pro -B pre-bi Large prebii Small prebii Immature B

6 i Progenitori dei Linfociti B nel Midollo Progenitori marker Attività Pro-B Pre-B I Pre-B II grande Pre-B II piccola B Immaturo B220 (CD45)+ IL-7R+, IL-7R+, B220+, CD19+, CD10, RAG+, VpreB, λ5,iga e Igb IL-7R+, B220+, CD19+, CD10, Igα, Igβ, µ, VpreB, µλ5 IL-7R low, B220+,CD19+, RAG+, Igα, Igβ, µ B220+, CD19+, RAG low, Igα, Igβ, µ, k/λ B (T) riarrangiamento D-J catena H Completa il riarrangiamento D- J e inzia il V-DJ catena H Esprime il pre-bcr esclusione allelica - Prolifera Riarrangiamento V-J catena L. Non prolifera Esprime BCR con IgM Test di Autoreattività: Revisione del recettore Selezione Negativa

7 Pre-BCR Struttura: Surrogato della catena L invariante: catena VpreB + catena λ5 con una specificità unica (regione UR) Catena μ Igα+ Igβ

8 Struttura differenziale del Pre-BCR U R (regione unica)

9 Geni e Struttura del Surrogato della catena L

10 Funzioni del pre-bcr nel Pre-B II grande: Induce il segnale di proliferazione Inibisce l espressione del surrogato Induce il riarrangiamento della catena L Induce l esclusione allelica Induce l eliminazione dei cloni autoreattivi tramite Selezione Negativa e Revisione del Recettore

11 Il pre BCR autoreattivo induce la Prima Ricombinazione del gene L (prima Revisione del Recettore ) il BCR nei B immaturi autoreattivi induce una Seconda Ricombinazione del gene L (seconda Revisione del Recettore )

12 Nello sviluppo dei B i recettori autoreattivi stimolano la Proliferazione e la Revisione del Recettore Revisione del Recettore

13 Importanza dell Autoreattività nei primi stadi dello sviluppo dei B Induce l espansione clonale dei precursori E necessaria per la generazione della diversità Il pre-bcr, esprimendo un recettore invariante autoreattivo, assicura la sopravvivenza dei B che hanno espresso una catena H produttiva

14 Eliminazione dei Cloni Autoreattivi = Induzione della Tolleranza Nella maturazione e nell attivazione dei Linfociti B si possono formare cloni che riconoscono il self: Durante il riarrangiamento V(D)J sia primario che secondario (Revisione del Recettore, centrale e periferica) Durante l Ipermutazione Somatica nei Centri Germinativi, dopo il contatto con l antigene L Eliminazione dei cloni autoreattivi avviene: sia nel Midollo che in Periferia tramite la Selezione Negativa: Delezione Clonale (apoptosi) Anergia (arresto del differenziamento) nel Midollo tramite la Revisione del Recettore

15 MATURAZIONE DEI LINFOCITI B NEGLI ORGANI LINFOIDI SECONDARI I linfociti B immaturi igm+ escono dal midollo e migrano nella milza dove si differenziano in Linfociti B Maturi Vergini igm+igd+ I B maturi vergini (CXCR5+) ricircolano e migrano nelle aree B-dipendenti degli OLS (CXCL13+), dove incontrano l antigene e vengono attivati

16 Sottopopolazioni di Linfociti B Periferici Vergini Linfociti B1 Linfociti B di Transizione (nella milza) Linfociti B2 : Follicolari Zona Marginale della milza

17 Sottopopolazioni dei Linfociti B

18 Linfociti B1 Originano dal fegato fetale Si trovano nelle cavità sierose e nelle mucose B220low e IgDlow Producono Plasmacellule secernenti IgM e IgA poco variabili (Anticorpi Naturali), spontaneamente o in risposta ad antigeni TI. Difesa immediata antibatterica

19 Linfociti B2: Differenziamento in periferia B2 cell B2 cell

20 Linfociti B2 B220+ B di Transizione IgM +++, IgD+ Selezione Negativa Periferica Breve vita Sensib. apoptosi B2 Matura Follicolare IgM +, IgD+++ Presentano Ag ai linfociti T B2 Matura Zona Marginale IgM +++, IgD+ Proliferano Differenziano in Plasma cellule

21 Linfociti B 2 B Marginali: sono localizzati solo nella Zona Marginale della milza (nell uomo anche in altri OLS e circolanti). Producono anche Anticorpi Naturali Hanno BCR polireattivi e TLR e hanno funzione di Linfociti B Innati. Dopo contatto con l antigene attivano una rapida (1-2gg) risposta sia di tipo innato TI che adattativa TD con anticorpi a bassa affinità B Follicolari: sono circolanti o localizzati nelle aree B dipendenti degli OLS. Hanno BCR monoreattivi. Dopo contatto con l antigene, attivano una lenta (circa 7 gg) risposta immune adattativa TD con anticorpi ad alta affinità

22 Linfociti B regolatori (Breg) Sono una popolazione di B, individuata nel 1970 nei topi, con ruolo immunosoppressivo: inibisce le altre cellule immuni tramite produzione di citochine (Il-10 e TGF-β) e presentazione antigenica. Non hanno un fenotipo specifico Sono note come B10, perché regolano la risposta immune tramite la produzione di IL-10, che è una citochina anti-infiammatoria L IL-10 prodotta dai Breg regola la produzione di TNF-αdai monociti, inibisce la produzione di citochine pro-infiammatorie dai TCD4+, sopprime la proliferazione cellulare e attiva i Treg Sono potenti regolatori delle malattie allergiche e autoimmuni, del cancro, delle infezioni, del rigetto ai trapianti. La recente scoperta di B10 umane permette alla ricerca clinica di utilizzare il potenziale regolatore di queste cellule nel trattamento di malattie immunitarie (SLE e MS) e di risposte immuni aberranti

23 Mouse B1, B2 and regulatory B cell subsets phenotype.

24 DESTINO DELLE CELLULE B MATURE La vita delle cellule B mature dipende dalla selezione con l antigene Cellule B non stimolate sopravvivono al massimo qualche giorno La reazione con l antigene porta all attivazione e alla diversificazione delle cellule B2

25 Ruolo dell Antigene nel Destino dei Linfociti B Antigeni Self: Presentati nel midollo a cloni B immaturi autoreattivi inducono la Selezione Negativa (anergia, delezione) o la Revisione del Recettore Presentati nella milza ai B immaturi autoreattivi inducono la Selezione Negativa Antigeni non Self: Presentati negli OLS a cloni B maturi inducono l attivazione e l ulteriore differenziamento

26 ATTIVAZIONE DEI LINFOCITI B 1a fase: Riconoscimento dell Antigene 2a fase: a) Cooperazione con i Linfociti T e differenziamento in Plasmacellule b) Migrazione nei Centri Germinativi e ulteriore differenziamento

27 Cattura dell antigene da parte dei Linfociti B nei Linfonodi Grazie a tecniche di microscopia in vivo si sono evidenziate due vie che dipendono dalla natura dell antigene: 1.Antigeni Piccoli Solubili (<60kD): trasportati passivamente nei Condotti Reticolari del follicolo catturati direttamente dai linfociti B 2.Antigeni Particellati (virus, Complessi Immuni ): catturati dai macrofagi del SCS o dalle FDC nei follicoli presentati ai linfociti B.

28 Condotti Reticolari Sono costituiti da Fibre Reticolari formate da collagene e rivestite da Fibroblasti Reticolari (FRC) Sede: Nel linfonodo: nei follicoli associati alle FDC e nella zona paracorticale Nella milza: nelle aree T e B dip Funzioni: Secrezione di chemochine specifiche migrazione dei linfociti e delle DC Trasporto passivo di piccoli antigeni

29 Sezioni longitudinale e trasversale di un condotto reticolare

30 Condotti Reticolari differenti per la Migrazione dei Linfociti T e B nei Linfonodi CXCR5+ CCR7+

31 Vie di trasporto dell antigene (Solubile e Particellato) nel linfonodo

32 Dinamica della cattura dell antigene nel linfonodo (in vivo) Macrofagi del SCS Antigeni nel SCS Antigeni nel follicolo e nella midollare Antigeni nel GC Macrofagi Midollari

33 cattura degli antigeni particellati nel linfonodo Gli Antigeni nativi (>60 kda), entrati tramite i vasi linfatici afferenti nel seno sottocapsulare (SCS), si legano ad anticorpi o complemento (CI): Sono catturati dai Macrofagi Sottocapsulari (in pochi minuti) Migrano nella regione midollare per essere catturati e degradati dai Macrofagi Midollari (in poche ore) Si infiltrano nei follicoli dove sono trattenuti sulle FDC (per giorni o settimane)

34 Ruolo dei B nella cattura dell antigene nativo presente sui macrofagi del SCS Non cognate B cell Cognate B cell

35 Riconoscimento degli antigeni nativi da parte dei Linfociti B In pochi minuti: I Linfociti B Marginali affini riconoscono i complessi immuni (CI) presenti sui macrofagi del SCS Trasportano i CI al bordo dei follicoli dove cooperano con i T e si differenziano in Plasmacellule precoci secernenti anticorpi a bassa affinità Altri B non affini trasportano i CI all interno del follicolo sulle FDC Entro diversi giorni/settimane: I Linfociti B follicolari affini catturano i CI presenti su FDC nei follicoli cooperano con i T differenziandosi in Plasmacellule secernenti anticorpi ad alta affinità

36 ATTIVAZIONE DEI LINFOCITI B2 con antigene T-indipendente: Antigene T-indipendente Linfociti B2 MZ Plasmacellule Extrafollicolari che producono Ig a vita breve e a bassa affinità

37 Attivazione dei B2 Marginali umani con Antigeni TI Nat.Rev.Immunol 2013,13

38 Attivazione TD dei B2 MZ nella milza CG

39 ATTIVAZIONE DEI LINFOCITI B2 con Antigene T-dipendente : Antigene T-dipendente Plasmacellule a breve vita: Ig a bassa affinità Linfociti B2 MZ Linfociti attivati Th Attivazione rapida dei B Linfociti B2 FO Linfociti T FH Attivazione tardiva dei B Plasmacellule a lunga vita: Ig ad alta affinità cellule della memoria

40 Cooperazione Primaria T-B PC CG

41 Cooperazione B/T primaria : Attivazione B

42 Migrazione dei B attivati dall antigene verso la zona esterna del follicolo (mediata da CCR7) Cooperazione 1 dei B con i T attivati (T H ) Via Extrafollicolare : Via Follicolare: Proliferazione Differenziamento in Plasmacellule a breve vita con anticorpi a bassa affinità Nel Centro Germinativo Zona Scura: Proliferazione e Diversificazione Zona Chiara: Cooperazione 2 B/T

43 Differenziamento dei Linfociti B2 follicolari nei Centri Germinativi Proliferazione e Diversificazione nella Zona Scura dei GC Migrazione nella zona chiara del GC: 2 Riconoscimento dell antigene, presentato dalle FDC 2 Cooperazione con i T FH Differenziamento in : 1. - Plasmacellule a lunga vita e ad alta affinità 2. - B memoria

44 T Helper Follicolari : T FH " Sono Th attivati (CXCR5++) che migrano nei Follicoli (CXCL13+) " Sono specializzati per cooperare con i B nei follicoli durante il loro differenziamento antigene-specifico " Promuovono l espansione clonale dei B, lo scambio isotipico, il differenziamento in plasmacellule e in cellule di memoria e la formazione dei CG " Sono attivati da Cellule Dendritiche, Linfociti B, IL-12

45 Legame dei B con FDC e Tfh nel Centro Germinativo

46 Eventi maturativi dei B nel Centro Germinativo

47 TFh Selezione dei Lnfociti B nel Centro Germinativo CXCL13 + CXCL12 + Ann.Rev.Immu. 2012,12

48 Eventi maturativi nel Centro Germinativo ZONA SCURA: Espansione clonale dei B attivati Diversificazione del BCR: Ipermutazione somatica e Revisione del recettore Maturazione dell'affinità Apoptosi ZONA CHIARA: Riconoscimento con l antigene presentato dalle FDC Selezione Positiva dei cloni con alta affinità Cooperazione con i T FH B memoria (Ricircolo) e PC a lunga vita Apoptosi Apoptosi

49 Linfociti B di Memoria Cellule a lunga vita con elevata affinità specifica verso gli antigeni: cellule secernenti anticorpi (Plasmacellule a lunga vita) cellule non-secernenti Attivazione delle cellule di memoria non- secernenti, dopo riesposizione all'antigene: Rapida espansione clonale Rapida attivazione dei CG. Elevati livelli di anticorpi circolanti ad alta affinità

50 Schema Risposte TD dei B2 nella milza Nat.Rev.Immunol 2013,13

51 Meccanismi dell Attivazione dei Linfociti B Legame del BCR con l Ag Attivazione del Recettore Trasduzione del segnale Attivazione del Citoscheletro Internalizzazione Ag Processazione Ag Presentazione Ag ai Th Cooperazione B/T Attivazione dei B e dei T

52 Attivazione dei B Legame con l antigene tramite BCR, Cd21 e TLR CD8 1

53 primi segnali di attivazione di BCR e CD21 o CD21

54 modello dell inizio dell attivazione dei B in risposta al legame con l antigene legato su APC Legame del BCR con l antigene Cambiamento conformazionale del recettore Reclutamento delle kinasi Lyn Fosforilazione delle ITAM di Igα/β Formazione dei Microcluster

55 Sinapsi Immunologiche nei Linfociti B Funzioni dei microcluster: Trasduzione del segnale e Polimerizzazione dell Actina Nat.Rev.Immunol. 2013,13,475

56 Attivazione dei Linfociti : Formazione delle Sinapsi Gli antigeni nativi, legati sulla membrana delle APC specializzate (Macrofagi, FDC, DC), vengono riconosciuti dai BCR delle cellule B Si forma una piccola piattaforma di segnale o "Microcluster :. Attivazione di Igα/Igβe di CD19,. Attivazione di prime molecole di segnale (Src),. Attivazione delle Integrine (LFA1, VLA4) che promuove l adesione dei B con le APC. Polimerizzazione rapida dell actina che porta alla riorganizzazione del citoscheletro: allargamento e contrazione della piattaforma La concentrazione di molti "Microclusters e la polarizzazione dei microtubuli formano la Sinapsi Immunologica

57 Nat.Rev.Immunol. 2013,13,475 Sinapsi Immunologiche nei Linfociti B

58 Sinapsi Immunologica dei Linfociti B: Struttura Area della membrana specializzata ricca di colesterolo, glicosfingolipidi, molte proteine del segnale e Molecole Adattatorie. E associata a proteine del citoscheletro Una Sinapsi matura è formata da tre zone concentriche: 1. centrale: con BCR + ag 2. mediana: con molecole di adesione e Lisosomi 3. periferica: con actina

59 Sinapsi Immunologica dei Linfociti B: Funzioni Trasporto di lisosomi al sito dell incontro con Ag Esocitosi di proteasi lisosomiali in situ Estrazione dell Antigene dalle APC Internalizzazione del complesso BCR/Ag Processazione Ag e Presentazione ai Linfociti T

60 Membrane trafficking events required for antigen processing in B cells

61 APC Synapse I 1 Cooperazione T/B In tutte le Cooperazioni si formano Sinapsi Immunologiche 2 Cooperazione T/B

62 La Maturazione dei B è controllata a livello trascrizionale da diversi fattori Durante lo sviluppo nel midollo osseo : Recettori Transmembranari: c-kit, Flt3, IL-7R: controllano i progenitori e non sono specifici Fattori di Trascrizione: non specifici: NFkB, PU.1, Ikaros, IRF specifici: E2A, EBF: controllano il riarrangiamento V(D)J Pax5: attiva la trascrizione di geni specifici dei B reprime geni della linea non-b

63 Azione dei Fattori di Trascrizione nello sviluppo dei B nel midollo Specifici dei B

64 Controllo trascrizionale nei B durante il differenziamento in periferia : Recettori Transmembranari : BCR, BAFF-R (specifici per i B) Fattori di Trascrizione : NFkB, Notch2, Aiolos (non specifici) OCT2, OBF1, Pax5 (specifici per i B)

65 Controllo Trascrizionale del Differenziamento dei Linfociti B in periferia (B2)