I LOVE RESEARCH CatanzaroOrienta Promosso dalla Fondazione Università Magna Graecia in collaborazione con l Amministrazine Provinciale TITOLO DEL PROGETTO: IDENTIFICAZIONE DI MUTAZIONI SOMATICHE IN LINFOCITI INFILTRANTI IL TUMORE IN SOGGETTI AFFETTI DA CANCRO COLORETTALE STUDENTI partecipanti: FALVO MARCO MARUCA FRANCESCO MAIDA ANGELO MANCUSO TOMMASO SCALZO GUGLIELMO LICEO SCIENTIFICO I.I.S. L.COSTANZO DECOLLATURA TUTORS: DOTT.SSA EMILIA DORA GIOVANNONE DOTT.SSA AURORA ANNA RITA NOCERA
OBIETTIVO FINALE DEL PROGETTO Ad oggi diversi studi hanno considerato il microambiente tumorale geneticamente normale, focalizzando l attenzione sulle mutazioni presenti nelle cellule neoplastiche. Ipotizzando che ci possano essere mutazioni a carico del microambiente in grado influenzare la crescita e progressione tumorale, è stato deciso di valutare l eventuale presenza di mutazioni nei linfociti infiltranti il tumore in pazienti affetti da cancro colorettale. BASE DI PARTENZA SCIENTIFICA Il cancro colorettale (CRC) è una delle neoplasie più frequenti, rappresenta la terza causa più comune di cancro e la quarta causa di morte su scala mondiale. L incidenza di tale neoplasia aumenta progressivamente con l età e la diagnosi mediamente viene effettuata in età compresa tra i 50 e 70 anni. Si registra una maggiore incidenza nei Paesi Europei, in Nord America ed Oceania mentre una più bassa incidenza è registrata nell Asia Centrale e Meridionale e in Africa. La prognosi dei pazienti affetti da cancro colorettale ha subito un lento ma costante miglioramento nel corso degli ultimi decenni in molti paesi. La sopravvivenza a 5 anni ha raggiunto quasi il 65% nei Paesi sviluppati (Australia, Canada, USA e paesi Europei) ma resta più bassa (circa il 50%) nei Paesi sottosviluppati, risultando in generale maggiore nelle donne rispetto agli uomini. Diversamente dalle altre forme neoplastiche, per il cancro colorettale così come per il cancro al polmone, non esiste un solo fattore di rischio. Oltre ad età e sesso, gli altri fattori di rischio identificati sono: storia familiare, patologie infiammatorie intestinali, fumo, eccessivo consumo di alcool e carne rossa, obesità e diabete (Brenner et al., 2014). Il microambiente tumorale è formato dalle cellule stromali (fibroblasti, cellule endoteliali, periciti e cellule mesenchimali), da cellule dell immunità innata (macrofagi, neutrofili, mastociti, cellule dendritiche e cellule natural killer) e da cellule dell immunità adattativa (linfociti B e T). Queste cellule comunicano tra di loro sia mediante contatto diretto sia mediante la produzione di citochine e chemochine e controllano la crescita della massa tumorale mediante segnalazione paracrina o autocrina (Grivennikov et al., 2010). Il cancro al colon è una delle neoplasie più studiate per la relazione tra tumore e immunità poiché è altamente immunogenico e comunemente presenta leucociti infiltranti. È noto che la risposta immunitaria di tale forma tumorale è diversa rispetto alla mucosa sana adiacente. Questi dati implicano che il cancro al colon-retto induce una specifica risposta immunitaria che però differisce ampiamente tra i pazienti. L immunità tumorale sta dunque emergendo come un fattore importante, sebbene non completamente chiaro, della progressione tumorale. In particolare, la capacità di un tumore di evadere e sopprimere la risposta dei linfociti T, influisce sulla sua sopravvivenza, così come sulla sua progressione e capacità di metastatizzare. La presenza di linfociti tumorali infiltranti (TIL) è spesso interpretata come un tentativo di rispondere alla proliferazione cellulare. (Sherwood A.M. et al., 2013). E noto in letteratura, che gli stessi linfociti T citotossici così come i linfociti T helper di tipo 1 (Th1), di tipo 2 (Th2) e di tipo 17 1
(Th17), sono coinvolti nella progressione tumorale. Allo stesso modo le cellule Treg che di solito mostrano un effetto tumorigenico, in alcuni casi presentano un azione antitumorale, consistente nella soppressione del processo infiammatorio associato al tumore. L unica tipologia cellulare che ad oggi non sembra mostrare un azione tumorigenica sono le cellule natural killer (NK). L espressione dei vari modulatori e mediatori della risposta immune, così come la presenza di diverse tipologie cellulari nel microambiente tumorale, può quindi promuovere la crescita tumorale o agire da immunità antitumorale. Come detto in precedenza, inoltre, la stessa tipologia cellulare può avere in alcuni casi un effetto tumorigenico ed in altri un effetto antitumorale. Ad oggi non è nota la causa di tale eterogeneità. (Grivennikov et al., 2010). In molti tumori, incluso il cancro al colon-retto, la presenza, la densità e la tipologia dei TIL correlano con la prognosi e la sopravvivenza. Nel cancro al colon-retto, le correlazioni sono così forti da poter considerare la risposta antitumorale come un indicatore clinico prognostico affidabile. In particolare la presenza e l alta densità di CD3 + (CD8 +, CD4 + ) e cellule della memoria sono associati ad una prognosi favorevole, mentre la presenza e l alta densità di linfociti CD4 + Treg correla con una cattiva prognosi. Inoltre l alta espressione di geni coinvolti nella risposta delle cellule T citotossiche (ad esempio interferone gamma) è associata ad un basso rischio di ricaduta (Sherwood A.M. et al 2013). Recenti studi sul cancro alla mammella hanno evidenziato la presenza di alterazioni a carico delle cellule del microambiente tumorale, suggerendo che queste alterazioni possano favorire la cancerogenesi. In particolare sono state inoltre riscontrate, nei linfociti tumorali infiltranti mutazioni somatiche non presenti nelle cellule neoplastiche. (Kleppe M. et al 2015). Alla luce di queste osservazioni, considerare le cellule del microambiente come un compartimento geneticamente instabile, potrebbe fornire nuovi elementi per comprendere il motivo per il quale la medesima tipologia cellulare in alcuni casi promuova e in altri inibisca la progressione tumorale. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI - Brenner H, Kloor M, Peter Pox C. Colorectal cancer. Lancet 2014; 383:1490-1501 - Sherwood A.M., Emerson Ryan O., Scherer D., Habermann N., Buck K., Staffa J., Desmarais C., Halama N., Jaeger D. Tumor- infiltrating lymphocytes in colorectal tumors display a diversity of T cell receptor sequences that differ from T cells in adjacent mucosal tissue. Cancer Immunology, Immunotherapy 2013; 62:1453-1461. - Kleppe M. et al Somatic mutation in leucocyte infiltranting primary breast cancer - npj Breast Cancer (2015). - Sergei I. Grivennikov, Florian R. Greten, and Michael Karin. Immunity, Inflammation, and Cancer. Cell. 2010; 140(6): 883 899. 2
METODOLOGIA Arruolamento pazienti Nello studio verranno arruolati 100 pazienti affetti da carcinoma del retto e del colon, qualunque sia la sezione interessata (colon ascendente, trasversale, discendente, sigmoideo), che rispondano ai seguenti criteri: 18 anni compiuti; qualunque etnia o razza e senza preferenza di sesso; affetti da tumore allo Stadio I (T1/T2 N0 M0) o Stadio IIA (T3 N0 M0) o Stadio IIB ( T4 N0 M0); non sottoposti a terapia cito riduttiva (chemio o radio terapia). Tutti i pazienti arruolati firmeranno un consenso informato. Isolamento e caratterizzazione immunofenotipica Il campione bioptico sarà sottoposto a dissociazione. La sospensione cellulare così ottenuta contenente cellule tumorali, stromali e gli infiltrati leucocitari sarà filtrata, lavata in PBS 1X e risospesa in Lysing buffer (BD) allo scopo di rimuovere i globuli rossi. Per ciascun paziente verrà raccolto un campione di sangue periferico da utilizzare come controllo. Lo staining (incubazione 30 min, 4 C) sarà effettuato utilizzando anticorpi anti-human (BD Bioscence). Le cellule saranno successivamente lavate due volte in PBS 1X, fissate in 300 ul Cytofix (BD) incubando a 4 C per 20 min e risospese in 500 µl in PBS 1X. Per i campioni che necessitano di staining intracellulare, le cellule saranno permeabilizzate allo scopo di effettuare lo staining per proteine intracellulari. Tutti i campioni così trattati saranno isolati utilizzando il FACSAriaIII cell sorter (BD). Estrazione del DNA Il DNA verrà estratto utilizzando il PureLink Genomic DNA kits (Invitrogen). La qualità del DNA estratto verrà analizzato utilizzando lo spettrofotometro Multiskan Go (ThermoFisher Scientific). Next Generation Sequencing Il DNA estratto sarà quantizzato utilizzando il Qubit (Invitrogen). Per ciascun campione sarà preparata una libreria (utilizzando 10 ng di DNA) utilizzando Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 (Life Technologies) e il pannello Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel. La qualità del DNA sarà valutata utilizzando il sistema BioAnalyzer (Agilent Thecnologies). Le librerie così ottenute saranno sottoposte ad una PCR in emulsione mediante l utilizzo del OneTouch System. I campioni verranno sequenziati utilizzando la piattaforma IonTorrent/Proton. I dati così ottenuti saranno analizzati mediante l applicazione di diversi algoritmi bioinformatici. 3
ARTICOLAZIONE DEL PROGRAMMA DI RICERCA I soggetti affetti da cancro colorettale, una volta reclutati, saranno sottoposti a intervento chirurgico. Verrà prelevato un campione bioptico che sarà consegnato ai nostri laboratori, contestualmente al campione di sangue dello stesso paziente precedentemente prelevato. Allo scopo di caratterizzare e isolare le cellule tumorali e le diverse sottopopolazioni linfocitarie (linfociti T helper, linfociti T citotossici, linfociti Treg), le biopsie tumorali saranno dissociate a fresco allo scopo di ottenere una miscela di cellule monodisperse contenente cellule tumorali, stromali e infiltrati leucocitari. La caratterizzazione delle sottopopolazioni linfocitarie sarà effettuata secondo il pannello mostrato di seguito: LINFOCITI T HELPER CD45 FITC CD3 PE CD4 APC LINFOCITI T CITOTOSSICI CD45 FITC CD3 PE CD8 APCCy5 LINFOCITI T REG CD4 APC CD25 PerCp FOXP3 PECy5 Ogni popolazione linfocitaria sarà positiva per ciascun antigene. Per isolare le cellule tumorali dalle stromali, si utilizzerà il seguente pannello: CELLULE TUMORALI EpCAM mcherry CD45 FITC CK8 (Citocheratina 8) ACPH7 CK18 (Citocheratina 18) ACPH7 CK19 (Citocheratina 19) ACPH7 CK20 (Citocheratina 20) ACPH7 Le cellule negative per i marcatori EpCAM e CD45 identificheranno la popolazione di cellule stromali che sarà eliminata perché non oggetto di studio. Le cellule positive per i marcatori EpCAM, CK8, CK18, CK19 e CK20 e negative per il marcatore CD45 identificheranno la popolazione di cellule tumorali. La procedura di staining sarà eseguita come da protocollo in precedenza illustrato. Le popolazioni cellulari (cellule tumorali e linfociti T CD8, CD4 e Treg), identificate mediante caratterizzazione immunofenotipica, saranno opportunamente isolate mediante cell sorting. Le sottopopolazioni linfocitarie (linfociti T CD8, CD4 e Treg) presenti nei campioni di sangue saranno identificate e isolate utilizzando le stesse metodiche e gli stessi pannelli descritti per l infiltrato linfocitario. Allo scopo di valutare il profilo mutazionale delle sottopopolazioni così ottenute, i campioni saranno analizzati mediante Next Generation Sequencing (NGS) utilizzando il Comprensive Cancer panel. Tale pannello consiste in 16000 coppie di primer in grado di amplificare 409 geni implicati nel processo di cancerogenesi. I dati saranno sottoposti ad analisi bioinformatica. 4
OUTPUT DEL PROGRAMMA L impatto globale dell immunità sugli eventi tumorigenici precoci è molto difficile da comprendere, soprattutto per quanto riguarda le cause che determinano la diversa azione dei leucociti infiltranti il tumore. Recenti studi hanno evidenziato la presenza di alterazioni a carico del microambiente tumorale, suggerendo che queste alterazioni possano favorire la cancerogenesi. In particolare mutazioni somatiche assenti nelle cellule neoplastiche sono state invece riscontrate nei linfociti tumorali infiltranti. Alla luce di queste osservazioni, considerare le cellule del microambiente come un compartimento geneticamente instabile, potrebbe fornire nuovi elementi per comprendere il motivo per il quale la medesima tipologia cellulare in alcuni casi promuova e in altri inibisca la progressione tumorale. In questo studio, mediante sequenziamento di nuova generazione, si cercherà di comprendere se, in soggetti affetti da cancro al colon-retto, i linfociti T infiltranti possano presentare mutazioni somatiche in geni notoriamente coinvolti nel processo di cancerogenesi. In futuro saranno necessari studi funzionali al fine di stabilire eventuali correlazioni tra i linfociti mutati e la progressione tumorale. Tale correlazione potrebbe avere importanti sviluppi sia da un punto di vista terapeutico che prognostico. In conclusione l identificazione di mutazioni somatiche clonali a carico dei linfociti tumorali infiltranti (TIL) potrebbe avere numerose implicazioni sullo sviluppo di nuove terapie che abbiano come target non solo le cellule tumorali ma anche quelle del microambiente. 5