Controllo dell espressione genica negli eucarioti

Differenze della regolazione genica fra procarioti ed eucarioti Dimensione e complessità del genoma Compartimentazione del genoma Organizzazione strutturale del genoma Stabilità dell mrna Modificazione post-traduzionale delle proteine Turnover delle proteine

La regolazione dell espressione genica Nei procarioti: un espressione genica selettiva permette alle cellule di risparmiare energia La regolazione avviene prevalentemente a livello trascrizionale Negli eucarioti: l espressione genica selettiva permette alle cellule di svolgere ruoli specializzati La regolazione avviene a vari livelli

La regolazione dell espressione genica negli eucarioti

ESPRESSIONE DEL GENOMA UMANO NELLE CELLULE DIFFERENZIATE Tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso corredo genomico (~40000 geni) L espressione genica tessuto specifica determina il fenotipo morfo-funzionale dei tipi cellulari e tissutali In ogni cellula differenziata ed in ogni particolare momento dello sviluppo è attivo solo un sottoinsieme di geni

Restrizione spaziale e temporale dell espressione genica Geni housekeeping (costitutivi) Geni con espressione ristretta nello spazio Espressione in più organi/tessuti diversi Stesso ruolo in più tessuti Il gene codifica per diverse isoforme (promotori alternativi e/o splicing alternativo tessuto specifico) Espressione specifica per tessuto, linea o tipo cellulare Espressione solo in singole cellule Distribuzione intracellulare o extracellulare Geni con espressione ristretta nel tempo Stadio di sviluppo Stadio di differenziamento Momento del ciclo cellulare Espressione inducibile da parte di fattori ambientali o extracellulari

Proteine che regolano la trascrizione Componenti del macchinario generale RNA polimerasi e proteine necessarie per il riconoscimento del promotore: 5 fattori generali (TFIIB/D/E/F/H) Fattori di trascrizione Coattivatori e corepressori stabiliscono interazioni proteina-proteina senza legarsi direttamente al DNA

FATTORI DI TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI ( trans-acting factors = fattori che agiscono in trans ) Possono essere distinti in: - Fattori generali - Fattori a monte - Fattori inducibili attivatori

FATTORI DI TRASCRIZIONE I fattori di trascrizione sono PROTEINE. In generale, sono in grado di diffondere nelle cellule e interagire con elementi bersaglio che si trovano in punti specifici della molecola di DNA ( trans-acting factors ) Hanno una struttura modulare composta da differenti domini legame al DNA transattivazione dimerizzazione legame al ligando

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Esempio di promotore eucariotico fattori generali e fattori a monte -100-80 -60-40 -20 1 20 box (modulo) CAAT GC TATA sequenza GGCCAATCT GGGCGG TATAAA Fattori proteici che legano CTF Sp1 Fattori generali (Pol II)

Gal4 Controllo combinatorio

Meccanismi molecolari del controllo trascrizionale negli eucarioti La concentrazione e l attività di attivatori e repressori regolano la struttura della cromatina (acetilazione-deacetilazione degli istoni diverso posizionamento dei nucleosomi) e l assemblaggio del complesso di inizio Attivazione per reclutamento del complesso di trascrizione Attivazione per alterazione della struttura della cromatina

Attivazione per reclutamento del complesso di trascrizione Le proteine regolative aiutano il reclutamento e l assemblaggio del complesso di inizio

Interazione con la RNApol mediata dal legame con altre proteine Attivazione trascrizionale per interazione diretta TAF- fattori associati alle TATA binding protein (TBP) Attivazione trascrizionale mediata

Attivazione per alterazione della cromatina Chromatin modulation proteins to induce transcription

Enzimi che regolano la struttura della cromatina Histone modifiers, DNA metiltrasferasi e Chromatin remodelers Histone modifiers Non alterano la posizione dei nucleosomi ma generano segnali (histone code) che sono letti da vari fattori. Chromatin remodelers Utilizzano ATP per rimodellare la struttura cromatiana, spostando I nucleosomi e rendendo leggibili sequenze di DNA regolatorie Agiscono come complessi multiproteici permettendo un controllo fine sulla attività rimodellante

Modifiche covalenti degli istoni

Modifiche covalenti degli istoni Modifiche apportate da specifici fattori proteici (writers) e rimosse da altri specifici fattori proteici (erasers) Le modifiche vengono lette da appositi fattori (readers) Acetilazione e metilazione delle lisine delle code istoniche (H3 e H4) sono coinvolte nel controllo e la regolazione della trascrizione H4K16ac -> favorisce la trascrizione H3K4me3 -> attivazione trascrizionale H3K27me3 -> inattivazione trascrizionale H3K9me-> inattivazione trascrizionale (eterocromatizzazione) La fosforilazione degli istoni è coinvolta in altri processi nucleari H2A.X (S139) -> riparo del DNA H3 (S10) -> stabilità cromosomi e divisione cellulare H2B (S14) -> apoptosi

Modifiche covalenti degli istoni H4K16ac H3K9me

RUOLO DELL ACETILAZIONE ISTONICA HAT HDAC Decondensa la fibra da 30nm Favorisce l accesso dei fattori di trascrizione sulla cromatina Agisce come segnale per il legame di proteine non istoniche

EFFETTI DELL ACETILAZIONE ISTONICA Regolazione della trascrizione mediata dalla acetilazione istonica L acetilazione istonica: richiama ulteriori fattori proteici attrae direttamente TFIID Bromodominio = lega istoni acetilati Cromodominio = lega istoni metilati

Acetilazione al promotore

Metilazione degli istoni H3K4me3 H4K27me3

Diversi tipi di struttura di ordine superiore dipendono dalla concentrazione locale e dalla combinazione di nucleosomi modificati differenzialmente In pratica le modificazioni istoniche servono a definire particolari stati della cromatina.

Metilazione del DNA

Metilazione del DNA La metilazione del DNA comporta l aggiunta di un gruppo metile in posizione 5 della citosina. La metilazione avviene a livello di regioni ricche in CpG (CpG island) che si trovano spesso nei promotori. La metilazione ha un ruolo importante nell espressione genica La 5-aza-citosina, analogo della citosina che non può essere metilato, è utilizzato nella terapia anticancro

La DNA (5-citosina)-metiltransferasi (DNMT) è responsabile della metilazione alla posizione C5 della citosina presente nelle isole CpG Le DNMT sono costituite da un dominio C-terminale catalitico ed un dominio N- terminale regolativo. La metilazione è mantenuta nel corso della divisione cellulare (DNMT1 e 2) o può essere introdotta ex novo (DNMT3)

Metilazione del DNA La metilazione del DNA è principalmente localizzata in regioni del genoma che includono elementi ripetitivi e trasposoni. Le CpG islands che si trovano nei promotori di geni housekeeping sono ipometilate e quindi trascrizionalmente attive. Alterazioni nel pattern di metilazione del DNA modificano il livelli di espressione e la stabilità genomica modificando la struttura della cromatina. La metilazione costituisce il principale sistema di riprogrammazione epigenetica Ondate di metilazione ex novo e di demetilazione avvengono durante la gametogenesi e durante lo sviluppo embrionale La metilazione degli istoni è collegata allo stato di metilazione del DNA circostante.

Metilazione e silenziamento La metilazione del DNA generalmente inibisce l espressione genica o direttamente bloccando il legame di attivatori trascrizionali, o legando delle metil-cpg-binding proteins che reclutano complessi co-repressori

transcriptional repressor MeCP2 co-repressor Sin3 Histone Deacetylase RPD3 Deacetilazione della cromatina Transcriptional Silencing X-chromosome Inactivation 5 me 3..pGpCp..5 5 me 5..pCpGp..3 5meC CpG La metilazione del DNA è presente nei geni repressi e nel cromosoma X-inattivo 5meC CpG La metilazione è mantenuta durante la replicazione grazie all azione delle metilasi sul DNA emimetilato 5meC La 5-metilcitosina nelle CpG è specificamente dal repressore trascrizionale MeCP2 (MethylC-binding Protein-2) MeCP2 a sua volta recluta Sin3 e RPD3 che possiede attività istone-deacetilasi + + CpG methylation Hypo-acetylated repressed chromatin fiber

Metilazione e silenziamento La metilazione H3K9 richiama HP1 che si lega attraverso il suo cromodomino e a sua volta richiama la DNMT che metila le CpG portando alla inattivazione del DNA

Rimodellamento della cromatina

Regolazione della cromatina Lo stato funzionale della cromatina è il risultato delle modificazioni covalenti a carico di istoni e DNA che ne alterano il grado di condensazione e quindi l esposizione di sequenze di DNA a fattori proteici in grado di legarsi in maniera specifica. Un ulteriore meccanismo di controllo funzionale è rappresentato dalla attività di specifici enzimi in grado di modificare il grado di condensazione di regioni cromatiniche. Fattori di rimodellamento

Fattori di rimodellamento Fattori proteici che utilizzano ATP per riarrangiare l organizzazione nucleosomiale della cromatina La famiglia più conosciuta è quella dei fattori Swi/Snf Sono presenti diversi complessi di rimodellamento Legame a domini di attivazione e decondensano la regione cromatinica Legame a domini di repressione e condensazione della regione di cromatina

Rimodellamento della cromatina Scivolamento dei nucleosomi: cambiamento della posizione di un nucleosoma sul DNA Nucleosomi rimodellati: il DNA diventa più accessibile ma gli istoni rimangono attaccati Spostamento dei nucleosomi: dissociazione completa di DNA e istoni Sostituzione di nucleosomi: sostituzione di un istone del nucleosoma con una variante istonica

Rimodellamento della cromatina

Sostituzione di un istone con una variante La variante istonica H2A.Z è molto presente nei geni attivi adiacenti a regioni represse, impedendo la diffusione della eterocromatina

Rimodellamento della cromatina Modello two-step dell azione chromatin remodeling di SWI/SNF e RSC. (A) Il complesso remodeling si lega alla cromatina in maniera ATP indipendente (B) L aggiunta di ATP porta ad un cambiamento conformazionale nel nucleosoma come conseguenza di una alterazione nelle interazioni istoni-dna (C) Questa alterazione porta al remodeling della cromatina che può avvenire sia mentre il complesso è legato o persistere dopo il suo rilascio (da chiarire) Il remodeling porta al trasferimento dell ottamero istonico su un differente segmento di DNA (effetto trans) oppure allo slittamento dell ottamero su un tratto adiacente di DNA (effetto cis) La conseguenza del remodeling dipende dalla posizione del nucleosoma nella regione promotore e può portare sia ad attivazione che repressione della trascrizione.

Rimodellamento della cromatina Targeting del complesso SWI/SNF I complessi di remodeling sono diretti sui siti cromatinici attraverso l interazione con fattori trascrizionali di regolazione. Due modelli son possibili: Il fattore si lega al DNA e funziona da ancoraggio per il complesso di remodeling Il fattore si lega al complesso di remodeling e favorisce la sua interazione sito specifica con il DNA

Regolazione della cromatina Targeting del complesso SWI/SNF La metilazione dell istone H3 (H3K27me3) operata dal complesso EZH2 ( writer ) PRC2 porta al silenziamento genico tramite il richiamo di DNA metilasi DNMT) e istone deacetilasi (HDAC). Il complesso PRC1 (complesso polycomb) riconosce il segnale H3K27me3 tramite i cromodomini della subunità polycomb (HPC).

Ordine di reclutamento dei complessi di modificazione A: prima della formazione del complesso di preinizio B: dopo la formazione del complesso di preinizio

Attivazione per rimodellamento della cromatina

Repressori La trascrizione eucariotica è regolata da attivatori e repressori I repressori sono funzionalmente inversi agli attivatori Molti repressori sono costituiti da due domini: un DNA-binding domain e un repressor domain

Meccanismo di azione dei repressori

Isolatori e enhancers

Gli elementi isolatori (boundary elements) aiutano a coordinare la regolazione dell espressione genica Gli enhancer sono costituiti da sequenze specifiche che regolano la trascrizione attraverso l'associazione con diverse proteine.

Enhanceosoma

L attivazione o la repressione trascrizionale è il risultato dell assemblaggio transiente di specifici complessi proteici che possono portare sia al reclutamento della RNApolII sia a modifiche della cromatina (modifiche istoni e DNA) e al suo rimodellamento

EPIGENETICA Modificazioni del DNA e della cromatina che influenzano il genoma e l espressione genica senza alterare il DNA stesso L epigenoma determina se un gene è acceso o spento in ogni singola cellula attraverso un segnale di espressione genica L epigenoma può essere ereditato per generazioni oppure cambiare (plasticità dell epigenoma) Esempi di fenomeni epigenetici sono Inattivazione del cromosoma X Differenziamento cellulare Imprinting genomico Silenziamento dei trasposoni

IMPRINTING GENOMICO Meccanismo epigenetico alla base dell osservazione che l attività di alcuni geni dipende dalla loro origine parentale. E causato da modificazioni della cromatina, come la metilazione delle C, che alterano l espressione di un gene ma non la sua sequenza Riguarda un piccolo numero di geni (~80) che mantengono la memoria o impronta della loro origine gametica e si esprimono in modo differenziale a seconda che siano ereditati dal padre o dalla madre (espressione monoallelica). Presente solo nei mammiferi (legato al benefici del maschio nel silenziare i propri geni che conservano risorse materne a spese del feto e i benefici per la femmina nel silenziare i prpri geni che attribuiscono risorse al feto a spese della madre) L imprinting è legato al silenziamento allele specifico di uno dei due segmenti cromosomici parentali. Nel caso di un gene con imprinting materno è attivo l allele paterno e viceversa L imprinting è riprogrammato nella linea germinale attraverso demetilazione del DNA e successiva metilazione specifica nelle cellule gametiche maschili e femminili

ICR = regioni di controllo dell imprinting Alterazione della struttura cromatinica a livello del promotore il silenziamento di UBE3A paterno L RNA antisenso provoca il silenziamento di IGF2R paterno CTCF si lega solo a a ICR non metilate agendo da isolatore e bloccando l effetto dell enhancher (silenziamento IGF2 materno) Espressione differenziale di un trascritto di RNA antisenso Blocco di un enhancer da parte di un isolatore

Inattivazione del cromosoma X L antisenso Tsix bilancia XIST fino a che i livelli di XIST non aumentano all inizio del differenziamento portando all inattivazione di uno dei due cromosoma X. L altro resta attivo grazie ai livelli di Tsix Il trascritto non tradotto di XIST riveste il cromosoma X e richiama fattori (esempio policomb) che modificano lo stato della cromatina (metilazione DNA e H3, deacetilazione di H4, fattori di rimodellamento)

TRASPORTO NUCLEO-CITOPLASMA

Sequenze segnale Import nucleare: -Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val- Export nucleare: -Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Gly-Leu-Asp-Ile- Import nei mitocondri: + H 3 N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro- Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu- Import nei peroxisomi: -Ser-Lys-Leu-COO - Import nell ER: + H 3 N-Met -Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Try-Ala- Thr-Glu-Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-Val-Phe-Gln- Ritenzione ER: -Lys-Asp-Glu-Leu-COO -

TRASPORTO NUCLEARE Il complesso del poro nucleare (NPC) Ha una massa ~125 mda nei vertebrati Contiene circa 50 proteine differenti (nucleoporine) e si estende nella duplice membrana del nuclear envelope (NE) e funziona come canale per il passaggio di molecole tra il citosol ed il nucleo E costituito da un core anulare centrale a simmetria ottagonale da cui si espandono fibrille di 50-100 nm dirette verso il nucleoplasma ed il citoplasma Il NPC è ancorato al NE mediante la lamina nucleare, una struttura fibrosa dello spessore di 15 nm costituita da lamine ed altre proteine, situata sotto la membrana interna Più del 50% delle nucleoporine contiene il motivo ripetuto Phe-Gly (FG repeat)

I RECETTORI DEL TRASPORTO Il trasporto nucleo-citoplasma avviene tramite il NPC I cargo (proteine, RNA o entrambi) si legano a dei trasportatori sia direttamente attraverso dei segnali di localizzazione nucleare (NLS) o di export nucleare (NES) sia attraverso adattatori proteici. NLS Semplice (SV40) Bipartito (Nucleoplasmin) PKKKRKV KRPAATKKAGQAKKKKKL Specifici recettori dediti al trasporto riconoscono questi segnali (karyopherins, PTACs, importins, transportins and Ran-binding proteins) I recettori sono generalmente proteine acide che condividono la capacità di legare componenti del NPC e contengono un dominio N-terminale RanGTPbinding ed un dominio C-terminale cargo-binding In particolare, le proteine con un NLS semplice o bipartito sono trasportate con la β-importin attraverso l adattatore intermedio α-importin

Ran è mantenuto come: RUOLO DI RAN RanGTP nel nucleo Ran GTP-GDP exchange factor (RanGEF o RCC1) RanGDP nel citoplasma RanGTPase activating protein (RanGAP) RanBP1 ed i domini BP1- like delle fibrille citosoliche del NPC agiscono come coattivatori di RanGAP Gli import receptors legano i cargo in maniera RanGTP-indipendente e rilasciano i cargo in presenza di RanGTP, che è accumulato nel nucleo attraverso l azione di RanGEF. In maniera opposta gli export receptors legano i cargo in presenza di RanGTP mentre il rilascio dei cargo stessi richiede l idrolisi del GTP da parte di Ran che si accumula nel citosol come RanGDP. Quindi, l idrolisi del GTP da parte di Ran permette l accumulo dei cargo nel nucleo o nel citosol contro un gradiente di concentrazione

Il ciclo di Ran

Import-export nucleare

Import adapters Adattatori di trasporto: Importin- : trasportatore Ran-dipentente Importin- : riconosce NLS tramite ARM (armadillo repeat motif) e importin- tramite il dominio IBB (importin- binding) Snurportin: riconosce gli UsnRNPs (splicosomal ribonucleoproteins containing the UsnRNAs) maturati nel citosol che presentano un m 3 G-cap assente nelle particelle immature (m 7 G-cap) Alcune proteine (SREBP-2 e PTHrP) possono essere direttamente trasportate da importin-β senza bisogno di un adattatore Transportin: riconosce il segnale (M9) presente su molte RNA-binding proteins

TRASPORTO NUCLEARE A) Nuclear import di RanGDP mediato da NTF2 B) Nuclear import dei cargo contenenti NLS mediante l eterodimero importin-α:importinβ (Imp-α Imp-β). Non è rappresentato il nuclear import mediato direttamente da importin-β o altre proteine della famiglia importin-β C) Nuclear export che opera il riciclo di importin-β (RanGTP dipendente) e importin-α (CAS dipendente) D) Nuclear export dei cargo contenenti NES mediato da Crm1. RanGAP è ancorato al lato citosolico del NPC mentre RanGEF è legato alla cromatina Nel modello sono rappresentati solo gli elementi essenziali, mentre i fattori accessori non sono rappresentati