Esercitazioni di Chimica Biologica AA 2005-06 PURIFICAZIONE DI UNA PROTEINA DI FUSIONE GST-CATECOLO 1,2 DIOSSIGENASI Viene utilizzato il pellet cellulare congelato ottenuto dalla crescita di cellule di E. coli BL-21 trasformate con il plasmide pgexisob, (contiene la sequenza che codifica ed esprime una proteina di fusione GST-catecolo 1,2 diossigenasi). DESCRIZIONE DETTAGLIATA SETTIMANA 1: Lisi cellulare tramite sonicazione (4 x15 ) con sonicatore Misonix già in dotazione (in laboratorio di Biochimica). Dato che è disponibile un solo sonicatore verrà effettuata dagli esercitatori. Chiarificazione dell estratto in aliquote (una per ogni gruppo) tramite centrifugazione su minifuge 12000 rpm per 10 minuti (effettuato dagli esercitatori come sopra). Ogni gruppo riceve una aliquota di ESTRATTO GREZZO CHIARIFICATO (EG) (ossia il surnatante della centrifugazione precedente). Gli operatori terranno da parte una aliquota di EG per il dosaggio di proteine (settimana 2) per ciascun gruppo. Montaggio colonnine: verrà illustrato in laboratorio Equilibratura delle colonne di affinità GSTrap preimpaccate (Pharmacia): ogni colonna monta in testa una siringa da 10 ml in plastica che funziona da contenitore per il liquido di lavaggio. Pipettare nella siringa 5 ml di BINDING BUFFER. Inserire MOLTO DELICATAMENTE il pistone della siringa ed esercitare una leggera pressione. Il flusso non deve superare la velocità di 1 ml/minuto, ossia una goccia in uscita dalla colonna (circa 50 µl) ogni 3/4 secondi. Il liquido che esce dalla colonna va raccolto in un becker. ATTENZIONE: non fate entrare aria nella colonna o si danneggia!!! Per questo è meglio lasciare un pochino di liquido nella siringa e non svuotarla completamente. Chiudere la colonna in uscita con il tappino nero e staccare la siringa dalla colonna SENZA MUOVERE IL PISTONE Purificazione del chiarificato su colonne di affinità GSTrap pre-impaccate (Pharmacia): una volta equilibrata la colonna con il BINDING BUFFER (ossia tampone di legame: favorisce l interazione tra la proteina di fusione che contiene la GST e il glutatione-sepharose presente in colonna come matrice di cromatografia) è necessario caricare il campione in colonna. Prelevare il campione (misurare il volume di 1 ml e inserire il dato nella TABELLA B) con una siringa da 2.5 ml. Eliminare le bolle d aria dalla siringa e inserirla (SENZA AGO!!!) in testa alla colonnina. Caricare in colonna ad un flusso se possibile ancora < di 1
ml/min (calcolare circa 6 secondi tra ogni goccia). Durante il caricamento raccogliere il liquido in uscita in provetta tipo eppendorf da 1.5 ml (prepararsi provette numerate da 1 a 15) La raccolta manuale delle frazioni (1 ml/provetta) va effettuata durante il caricamento per raccogliere la frazione del NON LEGATO (NL: provetta 1). Finito il caricamento del campione chiudere la colonna, staccare la siringa e sostituirla con la siringa da 5-10ml contenente BINDING BUFFER. Effettuare il lavaggio ( almeno 8 ml) con il BINDING BUFFER e raccogliere le frazioni in uscita ( 1 ml/provetta, provette 2-9). Chiudere la colonna, staccare la siringa e sostituirla con un altra siringa da 10ml contenente 5 ml di ELUTION BUFFER. Questo tampone contiene glutatione in concentrazione 10 mm e determina l eluizione specifica della glutatione-s-transferasi (GST) che si era legata al glutatione-sepharose e che ora si lega al glutatione libero fatto fluire in colonna e si ritrova quindi nel liquido in uscita. La nostra proteina di fusione, legata alla GST dovrebbe essere eluita specificamente a questo stadio. Raccogliere con attenzione le frazioni in uscita (1 ml/provetta, provette 10-15). Mettere le provette contenenti le frazioni (1-15) in ghiaccio. Chiudere la colonna. Sostituire la siringa in testa alla colonna con una contenente 10 ml di BINDING BUFFER e farlo fluire a 1 ml/min (per ristabilire le condizioni iniziali). Non è necessario conservare il liquido in uscita. Chiudere la colonna e togliere la siringa. La colonna è pulita e pronta per il turno successivo. Le frazioni eluite contengono proteine di vario tipo, la cui presenza e concentrazione può essere stimata leggendo la loro assorbanza a 280 nm in cuvette di quarzo su spettrofotometro. Un gruppo alla volta effettuerà la lettura dei valori di assorbanza delle frazioni, da riportare nella TABELLA A. Riportare i valori della TABELLA A su carta millimetrata in un sistema cartesiano dove x= numero frazione e y=assorbanza a 280 nm. Si disegna così un cromatogramma. Individuare i picchi del cromatogramma nella regione del non legato e scegliere le frazioni di tale picco da etichettare come NLn gruppo/n turno/data, e quelle nella regione dell eluito specifico, da etichettare come CAT-n gruppo/n turno/data. Inserire il volume di NL e di CAT nella tabella B SAGGIO DI ATTIVITÀ ENZIMATICA della catecolo 1,2 diossigenasi tramite produzione del cis,cis muconato rilevabile a 260 nm
(FIGURA 1) 5 6 1 Cat1,2DO CO 4 3 2 O 2 CO Catecolo Acido cis-cis muconico FIGURA 1 in cuvette di quarzo su spettrofotometro Beckmann DU 70 per i campioni prelevati a varie fasi della purificazione (EG, NL e CAT). DOSI PER SAGGIO DI ATTIVITÀ: 930 µl di tampone HEPES 50 mm ph 7.0 20 µl di catecolo 10 mm mettere nella celletta, fare il blank (START) e poi aggiungere 50 µl di campione, mescolare velocemente e avviare il monitoraggio a 260 nm (RUN). La lettura avviene per 10 secondi. INTERPRETAZIONE DEL CROMATOGRAMMA E CONGELAMENTO DELLE FRAZIONI OTTENUTE. TABELLA A Numero frazioni 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ASSORBANZA 280 nm
Cromatogramma Abs 280 nm 3 2,9 2,8 2,7 2,6 2,5 2,4 2,3 2,2 2,1 2 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 frazione
SETTIMANA 2: Allestimento di una curva di taratura con diluizioni crescenti di standard proteico [BSA], incubazione con reattivo di Bradford per il dosaggio proteico e lettura delle frazioni a 595 nm. Estrapolazione della retta e discussione sui risultati della linerizzazione Diluizioni dei campioni proteici ottenuti dalla settimana 1 (aliquote di estratto grezzo, EG, eluito specifico CAT), incubazione con reattivo di Bradford, lettura a 595 nm e applicazione della retta di taratura PER OTTENERE LA CONCENTRAZIONE PROTEICA NELLE VARIE FASI DELLA PURIFICAZIONE. CALCOLO DELL ATTIVITÀ SPECIFICA (attività totale/proteine totali), del FATTORE DI PURIFICAZIONE (attività specifica finale / attività specifica iniziale) e della RESA ( (attività totale finale / attività totale iniziale) x 100) e discussione dei risultati TABELLA B Volume Concentrazione Proteine Attività per Attività Attività Attività Fattore Resa % totale (ml) proteine (mg/ml) totali (mg) 50 µl di campione ( Abs/min) totale ( Abs/ min) specifica ( Abs/min/ mg proteina) specifica ( conc M /min/mg proteina) di purificaz ione EG 1 100 C1,2DO Dosaggio di proteine (metodo di Bradford) Il metodo rileva la presenza delle proteine ssorb il colorante (Coomassie Blu) si lega a residui di aminoacidi basici (es. ssorben) presenti nelle proteine. Si utilizza uno standard a concentrazione nota (solitamente si utilizza come proteina standard la siero albumina bovina o BSA) allestendo una retta di taratura Allestimento di una retta di taratura operativamente si parte da una soluzione a concentrazione 100 µg/ml di BSA e si preparano alcune diluizioni (utilizzare acqua bidistillata come diluente).
es. in questo caso ogni gruppo deve preparare (in provette tipo eppendorf sulle quali si saranno segnati i valori delle concentrazioni di BSA!) 1 ml di ciascuna delle seguenti concentrazioni di BSA: o 1 µg/ml o 2 µg/ml o 5 µg/ml o 7 µg/ml o 10 µg/ml Allestire in tabella 1 uno schema della quantità in µl di soluzione di BSA concentrata e di diluente (acqua) per ciascuna diluizione. Utilizzare la formula C 1 V 1 =C 2 V 2 dove. o C 1 = 100 µg/ml o V 1 = x µl di soluzione di BSA concentrata da prelevare o C 2 = la concentrazione voluta, es. 2 µg/ml o V 2 = 1000 µl per ciascuna diluizione: prelevare 500 µl, trasferirli in una cuvetta in plastica e aggiungere 500 µl del reagente colorante di Bradford. si otterrà una serie di cinque cuvette contenenti gli standard per costruire la retta di calibrazione (ricordarsi a quali concentrazioni corrisponde ciascuna cuvetta!!!) si leggono allo spettrofotometro a 595 nm le intensità di colorazione ottenute (ossia i valori di ssorbenza) dopo 15 di incubazione con il colorante (il colore è stabile per circa 45 ) impostando un grafico dove x=concentrazione in µg/ml e y=ssorbenza i punti sperimentali dovrebbero disporsi a definire una retta, i cui valori di pendenza ed intercetta (con il corrispondente coefficiente di correlazione) verranno estrapolati tramite l uso di una calcolatrice scientifica (metodo dei minimi quadrati) la retta ottenuta (retta di calibrazione) ci permette di ottenere poi i valori di concentrazione dei nostri campioni come descritto qui di seguito. Lettura della concentrazione dei campioni 1. diluire in acqua bidistillata i campioni secondo lo schema qui sotto, preparando almeno 1000 µl di soluzione (NB: diluire 1:10 significa prendere 1 parte di campione da diluire in 10 parti totali, ossia + 9 parti di diluente e non + 10 parti di diluente! E un errore frequente, soprattutto all inizio, fate attenzione!) o frazione EG:1:10000, 1:5000 (diluizioni seriali: intermedia 1:100, 200 ul e poi da questa preparare 1 ml diluendo 1.50 e 1:100) o frazione CAT: per abs 280 da 0 a 0.05 non diluire e 1:4 per abs da 0.05 a 0.25: dil 1:4 e 1:8 per abs da 0.25 a 0.6 dil 1:10 e 1:50 per abs da 0.6 a 1 dil 1:50 e 1:100
per abs oltre 1: dil 1:100 e 1:300 2. Per ciascuna diluizione prelevare 500 µl, trasferirli in cuvetta ed aggiungere 500 µl di colorante di Bradford (come per la retta di taratura!). Si otterranno due cuvette (a diluizione diversa) per ogni campione che verranno anch esse lette allo spettrofotometro a 595 nm. Dopo 15 di incubazione con il colorante (il colore è stabile per circa 45 ) 3. l assorbanza ottenuta verrà correlata ad una concentrazione corrispondente tramite la retta di taratura: l assorbanza (y) corrisponderà ad un valore di x concentrazione dedotto dall equazione della retta. Riportare i valori di x e y nella tabella 2 e disegnare il grafico sull asse cartesiano fornito. 4. ottenuti i valori di concentrazione moltiplicare per il fattore di diluizione per ottenere il valore di concentrazione nei campioni
Gruppo Data Tabella 1 Concentrazione Volume BSA concentrata (µl) Volume di acqua (µl) 1.0 2.0 5.0 7.0 10.0 Tabella 2 Conc. (µg/ml) (x) 1.0 2.0 5.0 7.0 10.0 Assorbanza 595nm (y) Tabella 2 campione (diluizione) 1:.. 1: 1:. EG (diluzione) 1:.. 1: 1:. Assorbanza 595nm (y) Riportare l equazione della retta estrapolata dai dati della tabella 2 y= bx + a Abs 595 =.Conc (µg/ml) +.. b=.. a=.. Coefficiente di correlazione (r o r 2 ) =.
Assorbanza 595 nm 2 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 5 10 15 20 25 Concentrazione (µg/ml) Dosaggio di attività catecolo 1,2 diossigenasica Si misura la produzione di acido cis,cis-muconico che assorbe a 260 nm. Il saggio si effettua in cuvette di quarzo in cui si porranno - 960 µl di tampone HEPES 50 mm ph 7.0-20 µl di una soluzione 10 mm di catecolo (substrato di reazione) - si calibra lo strumento su questo blank e si aggiungono poi - 20 µl di campione da saggiare (EG, NL o CAT) Dopo quest ultima aggiunta la reazione deve partire velocemente e in cuvetta la miscela di reazione deve essere omogenmeea (ben mescolata) per misurare in modo affidabile la velocità di formazione del prodotto. La misurazione verrà ripetuta almeno in doppio per ciascun campione I valori di attività ottenuti devono essere utilizzati per calcolare l attività totale, dopo aver calcolato il valore medio delle prove effettuate su ciascun campione. Inoltre il valore dell attività totale si intende per il volume totale riportato in tabella, mentre il saggio è effettuato su 20 l, quindi moltiplicate opportunamente. Compilazione di una tabella di purificazione e discussione risultati Dopo avere ottenuto i valori di concentrazione di proteine e di attività della catecolo 1,2 diossigenasi in ciascun campione EG, NL e CAT, completare la tabella considerando che la resa% è definita come il rapporto tra la attività totale di ciscun passaggio successivo e quella iniziale moltiplicata per 100, mentre il fattore di purificazione è definito dal rapporto tra l attività specifica del passaggio considerato e quella iniziale.
Valutate i vostri risultati considerando che l ideale per una buona purificazione è avere in pochi passaggi un valore il più alto possibile sia per il fattore di purificazione che per la resa percentuale (perchè? quali sono i limiti? cosa è necessario migliorare?) Per verificare la purezza della proteina di interesse si effettua una elettroforesi in gel SDS-PAGE: per motivi di tempo verrà effettuata dagli esercitatori. Copia dell immagine del gel ottenuto verranno forniti a ciascun gruppo. I risultati dell SDS- PAGE sul campione CAT insieme ad una corsa di proteine a peso molecolare standard dovranno essere utilizzati per calcolare Rf ed estrapolare il peso molecolare della proteina di fusione purificata come illustrato a lezione (vanno inclusi e discussi nella relazione). OK, ora siete (quasi) dei PURIFICATORI DI PROTEINE! (NB: pare che la richiesta sul mercato sia discreta...buona fortuna!)
Esercitazioni di chimica biologica GUIDA ALLA STESURA DELLA RELAZIONE DI LABORATORIO Indicazioni: testo max 1500 parole (indicativamente esporre lo scopo dell esperimento, le metodiche e strategie adottate con la motivazione al loro utilizzo, risultati sperimentali (positivi e negativi) e loro discussione, eventuali conclusioni e commenti) DEVE EMERGERE IN BREVE LA VOSTRA COMPETENZA TEORICA SULLE TECNICHE UTILIZZATE E LA COMPRENSIONE DELLA LORO APPLICAZIONE SPERIMENTALE inserire: Cromatogramma Tabella di purificazione (tabella B del protocollo) con tutti i dati numerici e conversione dei valori di attività da Abs/min in Conc./min (ε 260 per l acido cis, cis muconico = 16000 M -1 cm -1 Retta di taratura utilizzata per il dosaggio di proteine (con valori di a, b, r) Valori di concentrazione proteica ricavati con valore medio e deviazione standard Immagine del gel SDS-PAGE (commento al risultato ottenuto per il proprio campione) Retta di correlazione tra log. MW e Rf per il calcolo del peso molecolare della proteina di fusione estrapolato dall SDS-PAGE (se nel vostro campione non si vede alcuna banda calcolate l Rf di una banda visualizzata in qualsiasi altro gruppo) Calcolo del peso molecolare della proteina di fusione purificata e dell enzima catecolo1,2 diossigenasi soltanto sapendo che la proteina tag GST pesa 29 kdaltons.