Spettroscopia Ultravioletta/Visibile

Spettroscopia Ultravioletta/Visibile

Spettro elettromagnetico La radiazione elettromagnetica è caratterizzata da due grandezze λ e ν c (velocità della luce) = λ ν Intervallo di tutte le possibili radiazioni elettromagnetiche. Ad un onda elettromagnetica è associato un preciso valore di E = h x ν. 10 5 10 3 10 1 10-1 10-3 10-5 10-7 E (kj/mol) 10-8 10-6 10-4 10-2 1 10 2 10 4 cm Raggi gamma Raggi X UV IR Microonde Onde radio Spettro visibile Ultravioletto Visibile 200 400 800 nm VIOLETTO ROSSO 400 500 600 700 nm UV: Transizioni elettroniche Lontano (10-200 nm) Vis: Transizioni elettroniche (400-800 nm) Vicino (200-400 nm)

Principi di Spettroscopia UV/Visibile Transizioni elettroniche Il campo e.m. alternato causa un oscillazione degli elettroni di legame attorno allo loro posizione di equilibrio. Quando la frequenza della radiazione assume un energia corrispondente alla DE di due livelli energetici propri della molecola si ha un forte scambio di energia ed un salto elettronico. DE = hn = hc E UV/Vis stato elettronico fondamentale stato elettronico eccitato Ogni transizione richiede un energia determinata (quantizzata) ed è quindi provocata da una radiazione UV/Vis di lunghezza d onda ben definita.

Transizioni elettroniche E s* p* livelli di antilegame p s livelli di legame 120 180 240 300 nm E, n

Transizioni elettroniche E s* p* Ogni transizione richiede un energia determinata (quantizzata) ed è quindi provocata da una radiazione UV/Vis di lunghezza d onda ben definita. p s La lunghezza d onda necessaria alle diverse transizioni è tanto maggiore quanto minore è il dislivello di energia 120 180 240 300 nm E, n

Transizioni elettroniche E s* p* p s s* 110-160 nm p p* 160-255 nm s 120 180 240 300 nm E, n

Transizioni elettroniche E s* p* n livelli di antilegame livelli di non legame p s livelli di legame 120 180 240 300 nm E, n

Transizioni elettroniche E s* p* n n s* 160-270 nm livelli di non legame p s n p* 270-330 nm 120 180 240 300 nm E, n

MISURA DELL ASSORBIMENTO UV-VIS

Spettrofotometro UV/Vis Spettrometro a doppio raggio: l assorbimento dovuto ad una cella di riferimento (solo solvente) viene sottratto all assorbimento della cella contenente il campione.

MISURA DELL ASSORBIMENTO La sorgente di energia ed i materiali con cui sono costruiti il mezzo disperdente ed il rivelatore devono essere appropriati per l intervallo di lunghezze d onda analizzate Per le misure UV le celle ed i componenti ottici sono costruiti in quarzo e devono essere trasparenti alle radiazioni utilizzate Nella pratica quotidiana di laboratorio gli spettri UV o VIS vengono determinati in soluzione; come solventi vengono generalmente scelti etanolo, esano, acqua o diossano I solventi impiegati devono essere otticamente puri e il più possibile trasparenti alla radiazione; generalmente, per le transizioni di media intensità (e = 1000-10000) la concentrazione del soluto è dell ordine di 10-4 moli/l, mentre sarà ovviamente più alta se si vogliono osservare transizioni di più bassa intensità

MISURA DELL ASSORBIMENTO Solvente Limite di trasparenza (nm) H 2 O 195 n-esano 201 Etanolo 95% 205 Se possibile, impiegare solventi non polari, in quanto interazioni forti fra solventi polari e soluti comportano la perdita della struttura fine e quindi una perdita di informazione utile. La lunghezza d onda a cui avviene la transizione è influenzata in maniera marcata dal solvente nel quale la lettura viene effettuata.

EFFETTO DEL SOLVENTE L effetto della solvatazione dipende dalla polarità del solvente, dal tipo di cromoforo e infine dal tipo di transizione Transizioni p p* Nello stato eccitato separazione di carica polarizzazione della molecola stabilizzazione per interazione dipolo-dipolo In solventi polari energia assorb. (nm) DE = hn d++ stato elettronico eccitato d+ d- - d- stato elettronico fondamentale LUMO HOMO Nello stato eccitato, varia la distribuzione totale di carica, aumenta la polarizzazione della molecola e di conseguenza aumenta la sua stabilizzazione per interazione dipolo-dipolo con il solvente. Lo stato eccitato viene stabilizzata in misura maggiore rispetto allo stato fondamentale da un solvente polare, questo determina una diminuzione dell energia necessaria per fare avvenire la transizione

EFFETTO DEL SOLVENTE L effetto della solvatazione dipende dalla polarità del solvente, dal tipo di cromoforo e infine dal tipo di transizione Transizioni n p* Nello stato fondamentale stabilizzazione per interazione dipolo-dipolo In solventi polari protici energia assorb. (nm) p* DE = hn n d+ stato elettronico eccitato d+ d- d- LUMO HOMO stato elettronico fondamentale Essendo di tipo radicalico ed interessando soprattutto l eteroatomo non aumentano la polarizzazione della molecola nello stato eccitato. Lo stato fondamentale è più stabilizzato perché i doppietti liberi formano legami idrogeno col solvente meglio che nello stato eccitato (doppietti perturbati). Il passaggio da solventi non polari a solventi protici sposta l assorbimento a λ minori.

MISURA DELL ASSORBIMENTO Solvente Limite di trasparenza (nm) Alcani perfluorati Pentano Esano Cicloesano Trasparenti fino al lontano UV Fino a 195 Acetonitrile Fino a 200 Etere etilico Fino a 210 CH 2 Cl 2 CHCl 3 CCl 4 Benzene(*) Toluene THF (*) cancerogeno 220 240 260 Oltre 280

MISURA DELL ASSORBIMENTO Cellette Zona dello spettro Quarzo 200-400 nm Vetro o plastica 400-800 nm Le migliori cellette hanno finestre che sono normali alla direzione del raggio incidente al fine di minimizzare gli errori dovuti a perdite durante la riflessione L efficienza di una celletta dipende drasticamente dal modo in cui viene usata e conservata Impronte digitali, grasso o altri depositi alterano marcatamente le caratteristiche di trasmissione Dopo lavaggio, non devono mai essere seccate per riscaldamento il che provocherebbe una alterazione del cammino ottico

APPLICAZIONI DELLA SPETTROFOTOMETRIA UV Ampia applicabilità Numerose specie inorganiche, organiche e biochimiche assorbono radiazione visibile o ultravioletta anche successivamente a conversione chimica Alta sensibilità I limiti di rilevabilità tipici per analisi spettrofotometriche variano da 10-4 a 10-7 M Selettività da moderata ad alta Se si individua una alla quale solo l analita assorbe le separazioni preliminari non sono più necessarie Buona accuratezza Gli errori relativi in concentrazioni vanno dall 1 al 5% Facilità e convenienza I metodi sono prontamente automatizzabili

Spettrofotometria UV ANALISI QUALITATIVA ANALISI QUANTITATIVA

Spettrofotometria UV ANALISI QUALITATIVA Lo spettro di assorbimento molecolare ottenuto nell UV dipende dalla struttura elettronica della molecola che assorbe. In generale gli spettri UV/Visibile non sono particolarmente adatti all analisi qualitativa poiché in genere sono poco dettagliati rispetto a IR e NMR e quindi possono essere poco usati per l identificazione delle molecole. Questo tipo di spettri sono utili per escludere la presenza di particolari strutture (come doppi legami coniugati o anelli benzenici) nella molecola in esame. Alcune informazioni relative alla struttura del composto in esame possono comunque essere dedotte dall analisi di uno spettro UV/Vis.

e = assorbanza specifica di una soluzione a concentrazione molare unitaria, ad una certa. e = A/C Spettri UV-Visibile e Le bande di assorbimento UV/Vis sono caratterizzate da: lunghezza d onda del massimo di assorbimento ( max ); coefficiente di estinzione molare e. max Poiché i valori di e dei cromofori più comuni variano tra 10 e 10 5, in alcuni casi è preferibile utilizzare una scala logaritmica (log e). Lunghezza d onda in nm ( )

Caratteristiche delle transizioni più comuni Transizione Legame Nome max (nm) e s s* p p* (non coniugati) p p* (aromatici e coniugati) p p* (aromatici) C-H, C-C, C-X C=C, C=X C=C, C=X C=C, C=X - < 160 elevata L assorbimento E (etilenica) a molto 180 basse 230 (s s* n s*) di idrocarburi ed 2 10 3-10 4 alcoli permette di impiegarli come K (di solventi coniugazione) in UV/Vis. 220-750 > 10 4 B (benzenoide) ~ 270 10 2-10 3 n s* C-X R (radicalica) ~ 160-270 10 2-10 3 Assorbimento a più alte al diminuire dell elettronegatività di X; nei derivati C-X, per X = O ~180, N ~190, S ~215, Cl 173, Br 208, I 259. n p* C=X R (radicalica) ~ 270-330 ~ 10 2

Cromofori e auxocromi Cromofori: gruppi di atomi nella molecola (>C=O, >C=C<, fenile, ecc.), responsabili dell assorbimento di radiazione UV/Vis. e Auxocromi (cromofori ausiliari): gruppi che presentano un piccolo assorbimento UV, ma che causano effetti significativi sull assorbimento (sia λ max che ε) dei cromofori a cui sono legati. I gruppi auxocromi sono atomi che hanno uno o più doppietti liberi (es. -OH, -OR, -NR 2, -SH, -SR, - Alogeno). Uno spettro UV può avere più di una banda perché: Lunghezza d onda in nm ( ) contiene più di un cromoforo un solo cromoforo può generare più di una transizione

ASSORBIMENTO DA PARTE DI COMPOSTI ORGANICI Cromofori Gruppi funzionali organici insaturi che assorbono nella regione UV o Visibile (i.e. C=O; -C=C-; Ph) Posizione e intensità del picco possono servire come guida grossolana alla identificazione (attenzione all effetto del solvente) La coniugazione tra due (o più) cromofori tende a provocare spostamenti verso più elevate dei massimi di picco NO 2 NO 2 NO 2 NO 2 O 2 N NO 2 OH OH OH Aumenta coniugazione Intensità cromoforo

Cromofori e auxocromi La posizione del massimo di assorbimento di ogni cromoforo dipende sia dalla struttura del resto della molecola sia dall ambiente in cui questa si trova: Effetto BATOCROMICO (o red shift) è lo spostamento a lunghezze d onda MAGGIORI di lambda max. Questo effetto è causato dalla presenza vicino al gruppo cromoforo di particolari gruppi funzionali (batocromi). Un esempio è costituito da un doppio legame in alfa ad un gruppo carbossilico, la delocalizzazione degli elettroni π determina una diminuzione dei dislivelli energetici fra orbitali (ΔE più piccolo lambda maggiori) e batocromico max

Cromofori e auxocromi La posizione del massimo di assorbimento di ogni cromoforo dipende sia dalla struttura del resto della molecola sia dall ambiente in cui questa si trova: Effetto IPSOCROMO (o blue shift) è lo spostamento a lunghezze d onda MINORI di lambda max, causato da gruppi ipsocromi. Per esempio in ambiente acido l anilina si protona (ione anilinio), il doppietto elettronico di non legame dell N partecipa quindi in misura minore alla delocalizzazione con il sistema π dell anello aromatico. Al crescere dell acidità lo spettro mostra quindi uno spostamento verso lambda minori. (ΔE più grande lambda minori) e ipsocromico batocromico

Effetto del ph sull assorbimento aromatico OH O - ione fenato Mappa del potenziale elettrostatico base 270 nm (e 1.450) 287 nm (e 2.600) NH 2 NH 3 + ione anilinio H + 280 nm (e 1.430) 254 nm (e 160)

Il valore di e dipende da quattro fattori: 1. Probabilità della transizione elettronica; 2. Variazione del momento di dipolo che essa comporta; 3. Natura del solvente 4. Tipi di sostituenti. Cromofori e auxocromi Effetto ipercromico. Aumenta il valore di ε sia a causa dell'aumentata probabilità di transizione, sia a causa dell'aumento della superficie del cromoforo. Effetto ipocromico. Consiste nell'abbassamento del valore di ε dovuto a cause opposte alle precedenti. e ipercromico e max ipocromico

Cromofori comuni: alcheni p p* max 165 nm e 15.000 p* p E La presenza di gruppi alchilici sul doppio legame fa spostare il massimo di assorbimento a λ più alte.

Coniugazione Quando due o più cromofori sono presenti nella stessa molecola e sono separati tra loro da un solo legame semplice prendono il nome di cromofori coniugati: la loro caratteristica è la sovrapposizione degli orbitali π su porzioni più estese della molecola che includono anche i legami semplici intercalati tra i due legami doppi. In questo caso l assorbimento avviene a lunghezze d onda più elevate (minore energia) e con maggiore intensità. La coniugazione abbassa l energia della transizione p p*

Alcheni coniugati es. 1,3-butadiene antileganti p p* max 217 nm E e 21.000 leganti

Alcheni coniugati CH 2 E H 2 C CH 2 CH 2 H 2 C H 2 C p* p max 175 e 15.000 217 21.000 258 35.000 Coniugazione più estesa: assorbimento a lunghezze d onda maggiori assorbimento più intenso

Vitamina A e b-carotene I polieni con più di 8 doppi legami coniugati presentano un fortissimo massimo di assorbimento nella regione visibile. CH CH 3 CH 3 3 H 3 C H 3 C OH CH 3 CH 3 CH 3 H 3 C max 325 nm e 52.000 CH 3 max 460 nm CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 e 139.000 5 doppi legami 11 doppi legami

ASSORBIMENTO DA PARTE DI COMPOSTI ORGANICI Se aumenta la possibilità di spostamento elettronico diminuisce l energia necessaria per l eccitazione con il conseguente aumento del valore di verso la regione del visibile. Infatti, i sistemi altamente coniugati sono colorati. OH HO O O - - O3 S N N COO - O 2 N Nero Eriocromo T Fenolftaleina Il salto energetico da un orbitale di legame ad uno di antilegame è minore nel sistema coniugato dato che il livello energetico dell orbitale occupato con più alta energia (HOMO) aumenta e quello dell orbitale non occupato (LUMO) diminuisce

Cromofori comuni: composti carbonilici n p* max 290 nm e < 30 proibita p p* max 170 nm e 100 permessa p* n p E

Cromofori carbonilici 1 Composto struttura λ max nm (solvente) Acetaldeide 293 (esano) 12 H 3 C O CH O Acetone H C 279 (esano) 15 3 C ε Acetone C H 3 CH 3 O C 264 (acqua) Butenale H 2 C CH 3 O CH CH 207 (etanolo) 328 12.000 20 (E)-pent-3-en-2-one O CH C H 3 C CH CH 3 221 (etanolo) 312 12.000 40

Regole di Woodward-Fieser per i dieni Valore di base per sistema: aciclico trans 217 nm omoanulare 253 nm eteroanulare 214 nm Sommare per: gruppo alchilico o residuo di anello 5 nm ulteriore doppio legame coniugato 30 nm doppio legame esociclico 5 nm gruppo auxocromo: -O-CO-R 0 nm -OR 6 nm -SR 30 nm -Cl, -Br 5 nm -N(R) 2 60 nm

Calcolo del max per dieni coniugati valore base 214 + 3 residui alchilici 15 + 1 doppio legame esociclico 5 234 valore base 253 + 2 residui alchilici 10 263 Osservato : 233 263

Esercitazioni Valore base 214 doppio leg. esociclico 5 4 residui alchilici 20 * Totale 239 HOOC Sperimentale 238 Acido abietico

Regole di Woodward-Fieser per i carbonili coniugati Valori di base (in nm) per: anelli a 6 termini 215 anelli a 5 termini 202 C=C-C(X)=O X = H 207 X = R 215 X = OH 193 X = OR 193 Sommare per: Ulteriore doppio legame coniugato 30 doppio legame esociclico 5 Gruppo alchilico o residuo di anello a 10 b 12 g d 18

Calcolo della max per composti carbonilici a b-insaturi CH 3 O valore base 215 ulteriore doppio leg. 30 2 residui alchilici g d 36 281 osservato 281 nm, e 20.800

Esercitazioni H 3 C H HO O O Valore base 215 Ulteriore doppio leg. 30 1 residuo OR in g 17 H C CH 3 1 residuo alch. in d 18 Totale 280 Sperimentale (EtOH) 284

Calcolo della max per composti carbonilici a b-insaturi valore base 215 CH 3CH3 ulteriore doppio leg. 30 H 3 C O 2 residui alchilici a b 22 3 residui alchilici g d 54 CH 3 CH 3 CH 3 321 osservato 278 nm, e = 4.500

log e Cromofori aromatici E e ~ 56.000 K e ~ 7.900 Bande di assorbimento: da medie a forti; presentano una struttura fine caratteristica. B e ~ 250 R>300 Sostituenti: fanno spostare a più alte la banda a 256 nm; influenzano notevolmente l intensità di assorbimento.

Cromofori aromatici Composto struttura max (nm) e Benzene 184 204 256 60.000 7.900 200 Toluene CH 3 208 261 8.000 300 Clorobenzene Anisolo Cl OCH 3 216 265 220 287 8.000 240 8.000 2600 auxocromi Stirene CH 2 244 282 12.000 450 O Acetofenone CH 3 244 280 12.600 1.600 estensione coniugazione Nitrobenzene O N + O - 251 280 330 9.000 1.000 130

Effetto dei sostituenti sull assorbimento aromatico La banda a 256 nm è sensibile alla densità elettronica dell anello O OH H 3 C O H 3 C O Fenolo =270 nm e= 1450 Anisolo =287 nm e= 2600 Fenilacetato =258 nm e= 250 Densità elettronica λ max ε

Spettrofotometria UV ANALISI QUANTITATIVA Esiste una relazione di proporzionalità diretta fra la concentrazione di una specie in soluzione e l assorbimento di una radiazione ad una data lunghezza d onda (legge di Beer). Perché la legge di Beer possa essere sfruttata per l analisi quantitativa devono essere rispettate due condizioni: 1. La specie in soluzione deve assorbire in modo rilevabile nell intervallo spettrale dello strumento (in pratica deve possedere un cromoforo) 2. La relazione tra assorbanza (A) e lunghezza d onda (l) di assorbimento deve essere lineare.

Analisi Quantitativa I 0 I campione Trasmittanza T = I I 0 Assorbanza A = log I I 0 = log T 1

Legge di Lambert-Beer La legge di Beer per radiazioni sostanzialmente monocromatiche assume la forma: A = e c l e coefficiente di estinzione molare c concentrazione molare (moli/l) l lunghezza della cella (cm) e = M A c l M peso molecolare c concentrazione in grammi per litro (g/l) l lunghezza della cella (cm)

Legge di Lambert-Beer Nell analisi farmaceutica: A = A (1%, 1 cm) c l A (1%, 1cm) assorbanza di una soluzione 1% p/v (1g/100ml) in una cella di 1 cm c concentrazione del campione in g/100ml l lunghezza della cella (cm)

Legge di Lambert-Beer A 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 A = e c l inclinazione = e 0,0 1 2 3 4 5 conc (moli/l) La legge di Lambert-Beer è applicabile solo a soluzioni diluite; nelle soluzioni concentrate le particelle si influenzano a vicenda perturbando la propria distribuzione di carica e alterando l assorbimento della radiazione, con il risultato che la proporzionalità tra A e C non è più lineare.

Legge di Lambert-Beer A 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 C 2 C 3 C 4 C 1 2 3 4 5 conc (moli/l)

Legge di Lambert-Beer A 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 A misurata C x 0,0 1 2 3 4 5 C x conc (moli/l)