ddpcr per la diagnosi prenatale di aneuploidie
Rilevazione della presenza di trisomia 21 per la diagnosi prenatale Il sangue materno contiene circa il 10% di DNA fetale Il grado di sovra-espressione dipende dalla concentrazione di DNA fetale frazionata nel cfdna (DNA fetale circolante, delle cellule fetali). Ad esempio, la percentuale teorica di chr21 nel genoma del feto con trisomia 21 (T21) dovrebbe essere 0,6. Quando si analizza un campione di plasma materno contenente almeno 3% DNA fetale. Per valutare la presenza di altre aneuploidie fetali relative ai cromosomi 18, 13 ed ai cromosomi sessuali (X e Y). Ratio= 50 (chr21 positive) 100 (50 chr1 + 50 chr21 positive) = 0,5 Ratio= 75 (chr21 positive) 125 (50 chr1 + 75 chr21 positive) = 0,6 Limiti della metodica: uno è rappresentato dalla presenza di mosaicismi a bassa percentuale e dalla possibilità che la quantità di DNA fetale circolante non sia sufficiente ad ottenere un risultato
Tipizzazione allelica di varianti genetiche e mutazioni geniche rare: il gene CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) CFTR
Applicazioni della droplet digital PCR Quantificazione assoluta: studi di biomarcatori nel cancro e variazione del numero di copie (droplet digitale PCR su fluidi biologici e biopsie) Individuazione di mutazioni rare: misura vari gradi di mutazioni tumorali, rilevare bersagli di DNA rari, evidenzia le variazioni del numero di copie con sensibilità e risoluzione superiore ad altre tecniche. Presenza di varianti genetiche per malattie rare ereditarie come CFTR, beta-talassemia, etc (haplotyping) Le analisi di linkage Analisi di espressione genica: per ottenere misure affidabili e riproducibili su mrna poco abbondanti e mirna. Rilevamento di agenti infettanti poco rappresentati, diluiti: per quantificare piccole variazioni di molecole di DNA o RNA per il rilevamento e monitoraggio di agenti patogeni (genoma virale nel DNA umano) Next Generation Sequencing: eseguire il controllo della qualità e quantificazione assoluta di librerie NGS senza l'uso di una curva standard La quantificazione ultrasensibile di Eventi di Genome Editing Analisi su singola cellula Monitoraggio ambientale: testare un'ampia varietà di campioni ambientali come suolo e acqua Rilevamento di allergeni negli alimenti: analisi degli alimenti Effettuare la valutazione di routine per la presenza di organismi geneticamente modificati (OGM)
Tecniche omiche Per tecnologie omiche si intendono quelle applicazioni biotecnologiche che hanno un potere d indagine molecolare esteso all intero potenziale codificante della cellula la genomica, che studia tutti i geni di un organismo (NGS; SNP-array) la trascrittomica, si occupa dell'espressione dei geni negli mrna di un intero organismo o di un particolare organo, tessuto o cellula, in momento dello sviluppo dell'organismo o in particolari condizioni ambientali (microarrays: gene expression array; mirprofiling) la proteomica, si occupa dell'insieme di tutte le proteine di un organismo, tessuto o cellula, con l'obbiettivo di determinarne la sequenza aminoacidica, la funzione, la struttura tridimensionale e le sue interazioni. la metabolomica, è una branca della biochimica che si occupa del metabolismo, individuando ad esempio la quantità di diversi metaboliti con raffinate tecniche biochimiche quali la gascromatografia, nonché specifici saggi di attività enzimatica. Sul microchip possono essere immobilizzati: anticorpi, proteine purificate, lisati cellulari la biologia sistemica, si pone quindi come obiettivo lo studio delle interazioni tra le molecole di un intero organismo, considerandolo nella sua totalità, a differenza della tradizionale biologia molecolare che parte dallo studio di singole interazioni. Questa scienza interseca idealmente i dati di genomica, trascrittomica, proteomica e metabolomica.
Tecniche omiche per lo studio di malattie genetiche: microarray CGH (Comparative Genomic Hybridization) Il principio su cui si basa la tecnica dell array CGH è la comparazione quantitativa del DNA in esame estratto dalle cellule fetali (diagnosi prenatale) o dal prelievo ematico del soggetto (diagnosi post-natale) e del DNA genomico di riferimento proveniente da un soggetto sano (reference DNA). L ibridazione genomica comparativa su microarray CGH è una tecnica sviluppata per identificare anomalie cromosomiche di tipo numerico (aneuploidie) a carico dei 22 autosomi (cromosomi dal nr. 1 al nr. 22) e dei cromosomi sessuali (X e Y), o anche variazioni del numero di copie (CNV) del contenuto di piccole porzioni cromosomiche, come duplicazioni/amplificazioni (presenza di copie in eccesso di segmenti di DNA), o delezioni (perdite di porzioni di genoma). Queste anomalie del DNA possono essere la causa di diverse patologie quali, ad esempio, sindromi malformative, ritardo mentale, autismo, epilessia e tumori.
Microarray CGH (Comparative Genomic Hybridization) DNA sano DNA malato 5 3 Gene A Gene B Tanto più è elevato il numero di sonde maggiore è l'efficacia dell'array nell'identificazione delle variazioni del numero di copie. corrispondenti a piccole porzione di ciascun cromosoma. Il potere risolutivo della piattaforma utilizzata può variare in funzione della densità e della tipologia delle sonde utilizzate; attualmente per scopi diagnostici vengono impiegati array tra 1 Mb e 100 kb. 3 5 Gene A Gene B Il DNA da analizzare e il DNA reference sono marcati con differenti molecole fluorescenti, vengono mescolati in parti uguali e fatti incubare (ibridazione) su un microarray, costituito da un supporto di vetro la cui superficie è coperta di frammenti di DNA, costituiti da oligonucleotidi o sonde di maggiori dimensioni. Ognuno di queste sonde rappresenta una specifica regione del genoma umano, fino a ricomprendere l intero assetto cromosomico umano. Al termine della suddetta incubazione, sia il DNA in esame che quello di controllo si legheranno alle sonde presenti sull array.
Microarray GCH (Comparative Genomic Hybridization) Il risultato sarà l emissione di due distinti segnali fluorescenti relativi ai due differenti DNA marcati, le cui intensità saranno misurante a seguito di lettura degli arrays mediante un apposito strumento (scanner). Sull immagine ottenuta verrà poi effettuata l analisi comparativa tra le intensità di fluorescenza emesse dai due DNA, la relativa elaborazione dei dati mediante un apposito software evidenzierà eventuali variazioni del numero di copie del DNA in analisi rispetto al DNA reerence. In caso di assetto cromosomico normale, il rapporto tra le due emissioni è bilanciato (1:1). Qualora vi siano nel DNA in esame (fetale) delle delezioni (assenza di un cromosoma o parte di esso), il rapporto tra quest ultimo ed il DNA di controllo sarà di 1:2 (monosomia completa o parziale). Nel caso di duplicazioni (presenza di un cromosoma soprannumerario o parte di esso) il rapporto tra il DNA embrionale e quello di controllo sarà di 2:1 (trisomia completa o parziale).
Indicazioni all uso della tecnica array-cgh L array-cgh viene prevalentemente utilizzata per la diagnosi di fenotipi complessi associati a ritardo mentale di grado variabile. Questo tecnica anche trova impiego anche come tecnica di routine nella diagnosi prenatale, ed è particolarmente indicata per pazienti con feto i cui segni ecografici sono riconducibili ad una patologia cromosomica, il cui cariotipo è però risultato normale. In questi casi, l array-cgh rappresenta una procedura ideale di approfondimento diagnostico di secondo livello, eseguita per integrare l analisi citogenetica prenatale, al fine di definire più accuratamente eventuali anomalie cromosomiche precedentemente identificate o per rivelare microriarrangiamenti non evidenziabili con l'indagine del cariotipo fetale. L'integrazione dell'analisi citogenetica convenzionale con l'array-cgh incrementa notevolmente le possibilità di determinare le cause della patologia riscontrata nel feto ed eventualmente permette di definire più accuratamente il rischio di ricorrenza. Le principali indicazioni per l impiego dell array-cgh quale tecnica di approfondimento diagnostico in diagnosi prenatale sono le seguenti: difetti dello sviluppo fetale evidenziati tramite ecografia; anomalie cromosomiche (riarrangiamenti sbilanciati, riarrangiamenti apparentemente bilanciati de novo e cromosomi marcatori) individuate attraverso l analisi citogenetica prenatale. Particolare importanza riveste questa applicazione pre-natale nell esame del liquido amniotico o dei villi coriali in quanto con una sola determinazione è possibile rilevare circa 100 patologie non diagnosticabili diversamente, che provocano ritardo mentale e patologie correlate nel bambino.. I limiti di tale tecnica in ambito prenatale sono rappresentati dall impossibilità di identificare riarrangiamenti cromosomici bilanciati e mosaicismi con una linea cellulare scarsamente rappresentata (inferiore al 10%). E importante sottolineare la necessità che questa tecnica sia utilizzata da laboratori dotati di provata competenza di genetica molecolare, nonché di esperienza nella interpretazione dei risultati prodotti dalla array-cgh.
I vantaggi della tecnica array-cgh 1 2 3 4 FISH La citogenetica tradizionale, pur utilissima nell individuare un gran numero di anomalie cromosomiche, numeriche e strutturali, è necessariamente limitata nelle sue possibilità diagnostiche dal potere di risoluzione del microscopio. Il maggiore progresso degli ultimi anni, nel campo della citogenetica, e rappresentato dallo sviluppo della tecnica FISH (Fluorescence In Situ Hybridization), una metodologia citochimica che consente di individuare specifiche sequenze di DNA a livello cromosomico. Il principio su cui si basa è l appaiamento tra una sonda marcata (frammento di DNA specifico per la regione d interesse contenente nucleotidi modificati) ed il DNA cromosomico del soggetto in studio, fissato su un vetrino. Tale tecnica permette di identificare marcatori cromosomici, di visualizzare traslocazioni bilanciate e non bilanciate, duplicazioni e riarrangiamenti cromosomici. La FISH, nonostante sia di grande applicazione nella diagnosi clinica odierna, è necessariamente limitata dal fatto di essere una tecnica di "indagine mirata": la sua applicazione consente solo di poter individuare mutazioni specifiche a livello di precisi loci cromosomici. Con l impiego della tecnica array-cgh si è grado di valutare la presenza di eventuali anomalie cromosomiche a livello dell intero genoma in un unico esperimento, senza sapere in anticipo cosa cercare. Rispetto ad altre metodiche d indagine, come l'esame tradizionale del cariotipo, l'analisi del genoma basata su array ha una risoluzione molto più elevata (100 volte). Ciò consente di evidenziare anomalie del DNA che normalmente non potrebbero essere rilevate, incrementando notevolmente le possibilità di raggiungere una diagnosi certa. Inoltre, l'array-cgh permette di definire esattamente la regione genomica alterata e quindi anche i geni in essa contenuti, migliorando la comprensione delle relazioni esistenti tra variazioni del numero di copie e patologia.
Trascrittomica e utilizzo di microarray Oggi è possibile analizzare l espressione di tutti i geni di una cellula, tessuto, etc.. contemporaneamente grazie ai microarray o biochip. Si tratta di piccole lastre di vetro o plastica delle dimensioni di un chip di computer, su cui sono immobilizzate migliaia di sonde molecolari ognuna corrispondente ad una singola sequenza genica, all interno di micropozzetti da 50 µm. Oggi sono disponibili set di microarray che coprono tutta la porzione codificante del genoma umano (90 milioni di sonde).
Trascrittomica e utilizzo di microarray Microarray o biochip: Il chip ha una superficie di vetro o silicone piccole sonde di DNA o RNA ancorate alla superficie (10-20 copie, fino a centinaia di migliaia) ciascun gene occupa una determinata posizione sul Chip (spot) il campione in analisi viene amplificato per PCR il campione da analizzare viene marcato con una molecola fluorescente il campione viene caricato sul chip tutti i geni espressi nel campione in analisi ibridizzano con le rispettive sonde specifiche sul chip contemporaneamente la fluorescenza in ciascuno spot del chip, corrispondente a ciascun gene viene rilevata come segnale ed analizzata da un sistema di elaborazione dati Detection Due biochip, uno per l analisi del genoma umano e uno per quella del genoma del topo.
Tipi di microarray 1. cdna arrays 2. Oligonucleotidi arrays
Trascrittomica e utilizzo di microarray Un applicazione dei microarray è l analisi dell espressione differenziale di geni in due popolazioni cellulari. 1. l mrna è estratto da cellule di controllo (ad es. cellule di un individuo sano) e dal campione sperimentale (es. cellule tumorali). 2. l mrna viene convertito in cdna e marcato con sonde fluorescenti di diverso colore per i controlli (ad es. verde) e i campioni (ad es. rosso).
3. i cdna vengono ibridati al microarray. L illuminazione al laser rivelerà segnali rossi o verdi in corrispondenza dei geni espressi solo in ciascuna delle due popolazioni, e gialle (rosso+verde) per quelli espressi in entrambe. Trascrittomica e utilizzo di microarray
https://www.youtube.com/watch?v=9u-9mlozoz8 Trascrittomica e utilizzo di microarray
Trascrittomica: analisi dei geni espressi in cellule trattate/controllo; sane/patologiche
Trascrittomica: analisi dei geni espressi in diversi tessuti
Trascrittomica: effetti dell inquinamento ambientale sull espressione genica
Trascrittomica: analisi dei geni espressi in cellule neoplastiche di diversi pazienti RNA RNA RNA RNA RNA Geni comunemente espressi
Trascrittomica: analisi dei dati di espressione genica Heatmap, o comparazione quantitativa: Il lettore di fluorescenza compara il livello relativo ai due segnali (rosso-verde) geni espressi egualmente nei due campioni hanno livelli uguali delle due fluorescenze e il loro un rapporto sarà pari a 1 rapporti superiori o inferiori riflettono un espressione differenziale nei due campioni L operatore definisce un soglia di «differenza», un cut-off, secondo il quale valori superiori a tale valore definiscono un espressione differenziale nei due campioni (esempio=2.ma arbitrario) I geni sono riportati più volte sul chip, quindi più spot per ogni gene Oppure ciascun campione almeno in triplicato, per dare valenza statistica, e determinare se le differenze siano quindi significative Utilizzo di analisi statistiche
Trascrittomica: analisi dei dati di espressione genica Il test t è un test statistico di tipo parametrico con lo scopo di verificare se il valore medio di una distribuzione si discosta significativamente da un certo valore di riferimento. p = P( X E x E ) Utilizzo di analisi statistiche (non solo il p value<0,05 o p<0,001) più complicate come metodo SAM (che considera anche la frequenza di eventi falsi positivi e falsi negativi) p value ci dice se i dati osservati sono statisticamente significativi. Se ho un p<0.05, la discrepanza viene detta statisticamente significativa. Se 0.01 p<0.05, molto significativa. Se 0.001 p<0.01 e p<0.001, estremamente significativa
Trascrittomica: problematiche Si assume che ciascun passaggio (estrazione RNA, reazione di retrotrascrizione, PCR, marcatura, ibridazione) abbia la stessa efficienza per ogni gene e per ciascun campione La ripetizione del campione elimina variazioni casuali, ma non eventuali errori sistematici: ad es. gene non amplificato bene per PCR a causa di una competizione dei primers su altri bersagli La stessa concentrazione definita per ciascun mrna bersaglio non indica il livello di trascrizione di quel gene, ma sarà influenzata dalla velocità di sintesi e di degradazione del trascritto stesso, dalla sua stabilità (esempio mrna poco trascritti, ma molto stabili possono essere presenti a livelli più alti rispetto a trascritti meno stabili) Dati da validare con altre tecniche, come RT-PCR quantitativa su singoli geni specifici Verificare la sua traduzione in proteina: proteomica e mediante studi di Biologia sistemica
Biologia sistemica
Trascrittomica: limiti Vengono analizzati i trascritti, ovvero gli mrnas aventi sequenza nota, dei quali risulta possibile quindi costruire le sequenze probe Non possono essere identificate variazioni nella struttura secondaria nell mrna Non possono essere identificate isoforme di uno stesso mrna Non è un metodo di valutazione assoluta, bensì comparativa Problematiche superate con l RNA-sequencing
RNA-Sequencing 5 -pre-adenylated RNA-Sequencing, che è stato introdotto come un nuovo modo per l'analisi di espressione genica, si riferisce al sequenziamento della miscela di trascritti (RNA) che sono stati inizialmente convertito in cdna mediante trascrizione inversa. RNA-Sequencing ha portato a molte applicazioni e alla produzione di nuovi dati: per esempio, trovare nuovi siti di splicing alternativo, identificando nuove giunzioni esone/introne; studiare la regolazione genica mediante RNA antisenso; studiare l espressione intragenica e di ''piccoli RNA'' (microrna e altri RNAnon codificanti).
RNA-Sequencing using epcr http://www.geospiza.com/finchtalk/uploaded_imag es/plates-and-slides-718301.png
Genome transcriptome assembly and quantification nuovi RNA Trascritti con variazioni di splicing
*RPKM (reads per kilobase per million mapped reads) RNA-Sequencing
Goals of Transcriptoma sequencing vs. gene expression microarray Microarrays Metodica affidabile, utilizzata da decenni Elevato numero di campioni analizzabili Facilmente automatizzabile Analisi dei dati lineare Basso costo RNA sequencing Fornisce una visione più completa del trascrittoma Indipendente dalla conoscenza della sequenza sensibilità modulabili Può rilevare variazioni strutturali, isoforme, fusioni geniche e variazioni di splicing Tecnologia veramente digitalizzata, dati assoluti di espressione genica