SEPARAZIONE DELLE SUBUNITA' DELLA RIBULOSIO-1,5-DIFOSFATO CARBOSSILASI DA FOGLIE DI CARCIOFO. Cardinali A.,Miceli A.,Pacoda D. e Gallerani R. Centro di Biologia,Laboratorio di Chimica Biologica,Universita' di Lecce. Sezione di Bari INTRODUZIONE In precedenti note e' stata descritta la purificazione e caratterizzazione della ~ibulksio-1.5-difosfato carbossilasi (E.C.4.1.1.39) (RuBisCo) estratta da foglie di carciofo (1,2). All'analisi elettroforetica condotta in condizioni denaturanti la proteina ha rivelato un ''pattern" simile a quello di proteine omologhe estratte da altre piante superiori,(tabacco (3i.spinaci.(4),granturco 15) ). Essa risulta infatti costituita da due subunita' di peso molecolare 51.000 (L) e 14.300 (S) daltons rispettivamente e,sulla base della stima del peso molecolare della proteina nativa (2),e' stato possibile ipotizzare,analogamente a quanto trovato in altri sistemi vegetali,una stechiometria del numero delle subunita' presenti nella proteina oligomerica del tipo ISS8. Allo scopo di studiare la struttura primaria delle singole subunita',esse sono state separate a livello preparativo in condizioni altamente denaturanti. I risultati ottenuti e l'analisi delle curve di titolazione dei gruppi sulfidrilici descritta nella nota successiva,suggeriscono che nella proteina nativa esistano tra le diverse sbbunita, interazioni partico- ii \ larmente forti. MATERIALI E METODI. 565 Boii. Soc. It. Biol. Spcr., 1986, n. 5, Vol. LXII
La RuBisCo veniva purificata da foglie di carciofo seguendo la metodica descritta da Miceli et a. Una adeguata quantita' di proteina purificata era incubata con mercaptoetanolo (ridistillato) e sodio dodecilsolfato ad una concentrazione finale rispettivamente di 0.2 M e?%,a 55.c 60 minuti. per Fig.I:Profilo di eluizione della colonna di SephadexG-75. Circa 25 mg. di proteina purificata, venivano denaturati secondo quanto descritto in Materiali e metodi.nell'inserto e' riportata 1'SDS gel elettroforesi delle subunita' separate. A=Subunita' grande il);b=subunita' piccola (SI. I markers usati corrispondono a quelli descritti da Pacoda et al.(21.
Dopo l'incubazione la miscela ottenuta era frazionata usando una colonna di Sephadex G-75 12.5~84 cm) equilibrata ed eluita ad una velocita' di 30 ml/ora,con tris-hc1 50 mm ph 8.5 J contenente l'l%'di SDS. Le frazioni aventi una cs.tdnhioae a 280 nm maggiore di 0.25 erano sottoposte a SDS gel-elettroforesi per evidenziare il tipo di proteine in esse contenute. RISULTATI Per dissociare nelle subunita' che la compongono la RuBisCo purificata da foglie di carciofo, e' stato necessario utilizzare condizioni di denaturazione particolarmente drastiche mai P impiegate in nessun altro sistema vegetale. Nella fig.1 e' riportato il cromatogramma della separazione delle due subunita' effettuata su colonna di Sephadex G-75. In esso e' possibile rilevare due picchi simmetrici completamente separati,corrispondenti rispettivamente alle subunita' ad alto e basso peso molecolare (fraz.66-78 e 89-101 rispettivamente). La posizione di eluizione delle due proteine e la loro caratterizzazione elettroforetica confermano la loro natura. E' interessante ricordare che altre metodiche riportate in letteratura per separare le subunita' di proteine omologhe non hanno dato risultati altrettanto positivi. In particolare, u- tilizzando condizioni di denaturazione meno drastiche(6) si rilevavano fenomeni di riassociazione tra le subunita' ad alto peso molecolare come dimostrato dal1 'analisi elettroforetica (non riportata) delle frazioni ottenute dopo cromatografia su Sephadex G-75 della proteina purificata (Fig.2). Le frazioni 76-94 si rilevavano infatti costituite esclusivamente da subunita' grandi evidentemente associate in poliaggregati di
diversa complessita' a giudicare dalla posizione di. eluizione dalla colonna di Sephadex G-75. Questi risultati sono stati interpretati ammettendo l.esi- syenza di interazioni particolarmente forti tra le subunita' della RuBisCo di carciofo.esse spiegherebbero la necessita'di usare condizioni di denaturazione particolarmente drastiche ed un'alta velocita' di renaturazione dell'enzima con possibile formazione di poliaggregati che non rifletterebbero la costituzione dell'enzima nativo. L D E 280 nm ' 10-.- W m ~11.1. i50 Fig.2: Separazione delle subunita' della RuBisCo di carciofo secondo Akazawa et a1.(6). Circa 25 mg. di proteina purificata,venivano incubati per ere ore a 37'C in presenza di rnercaptoetanolo 2% e SDS 2%. Dopo incubazione le proteine venivano fràzionate su una colonna di Sephadex G-75 equilibreta con tris-hc1 25 mm ph 9,mercaptoetanolo 2% e SDS 2%. CONCLUSIONI E' stata elaborata una metodica che consente di dissociare e separare le subunita' che compongono la RuBisCo di foglie di carciofo a livello preparativo. Le condizioni di denatu- ra~ione~particolarmente drastiche,suggeriscono l'esistenza esse di interazioni di particolari ed insolita intensita'. I tra