CARATTERIZZAZIONE DELLE INTERAZIONI Costante di legame Concentrazione delle due specie Interazione Competizione con altre proteine Cofattori Compartimentazione cellulare Fattori che influenzano l interazione l (forza ionica, ph )
Quali sono le conseguenze dell interazione tra le due proteine? k on k off Dipende anche dalle caratteristiche dell interazione
Le costanti di Equilibrio e Cinetiche sono correlate k on A + B AB k off Velocità di associazione: d[ab] dt = k. on [A]. [B] Velocità di dissociazione: d[ab] dt = k. off [AB] All equilibrio: Velocità di Associazione = Velocità di Dissociazione k. on [A]. [B] = k. off [AB] Le costanti di Equilibrio: K A = [AB] [A]. [B] k K D = [A]. [B] = on = [AB] k off Koff k on
Costanti Cinetiche Costante cinetica di Associazione k on Costante cinetica di Dissociazione k off Definizione k on A + B AB k off AB A + B Unità di misura Significato [M - 1 s - 1 ] Velocità di formazione del complesso Quantità di AB formata al secondo,, in una soluzione 1 M di A e B [s - 1 ] Stabilità del complesso Frazione di complesso AB che decade al secondo Valori tipici 10-3 10 7 10-1 10-6
COSTANTI DI EQUILIBRIO Costante di Dissociazione all Equilibrio K D Costante di Associazione all Equilibrio K A Definizione [A]. [B] [AB] k = off kon on [AB] k = on [A]. [ B] k off Unità di misura Significato [M] Tendenza alla Dissociazione Bassa K D = alta affinità [M - 1 ] Tendenza alla Associazione Alta K A = alta affinità Valori tipici 10-5 10-12 10 5 10 10 12
SPERIMENTALMENTE. [PL] K D [P] x [L] [P] TOT = [P] + [PL] [P] TOT - [PL] = [P] K D = [P] x [L] [PL] K D = [P] TOT [L] [PL] - [PL] [L] K D [PL] = [P] TOT [L] - [PL] [L] K D [PL] + [PL] [L] = [P] TOT [L] [P] TOT [PL] = [P] TOT K D + [L] [L]
Se [PL] è direttamente proporzionale al cambiamento di un segnale rilevabile (risonanza plasmonica di superficie, spettroscopico/spettrofluorimetrico, area ) abbiamo: [PL] = [P] TOT K D + [L] [L] S = S max K D + [ L ] [ L ] Segnale S Concentrazione
Tutti i metodi che permettono di monitorare la formazione di un complesso sono accettabili!! Ogni tipo di interazione viene sempre analizzata secondo la stessa sa logica. Es: : interazione farmaco-recettore recettore
Gel filtrazione Il volume di eluizione di una proteina o di un complesso proteico dipende dal suo raggio di Stokes
k on k off ABS 280 nm K D = [ P ] x [ L ] [ PL ] 0 30 ml
Si ripetono gli esperimenti con concentrazione differenti di proteine ABS 280 nm 0 30 ml 0 30 ml ABS 280 nm ABS 280 nm ABS 280 nm 0 30 ml 0 30 ml
K D = [ P ] x [ L ] [ PL ] Area Concentrazione
SAGGI IMMUNOLOGICI Proteine immobilizzate su supporto Si aggiunge il ligando a differenti concentrazioni Tempo di incubazione Lavaggi Si aggiunge un anticorpo Si rivela il segnale. Segnale K d Concentrazione Ligando
ULTRACENTRIFUGA ANALITICA (AUC) rotore speciale (due celle: cella analitica e cella di bilanciamento) sistema ottico (che permette di osservare il materiale biologico mentre sedimenta) Il sistema ottico sfrutta il principio secondo cui la luce viene deviata quando passa attraverso una soluzione con zone a diversa densità e viene rifratta nel punto di demarcazione tra queste zone.
Quali informazioni possono essere ottenute da esperimenti di AUC: Coefficiente di sedimentazione Massa molecolare relativa Purezza di una particella Forma delle particelle INTERAZIONI FRA BIOMOLECOLE 2 APPROCCI SPERIMENTALI: Velocità di sedimentazione Sedimentazione all equilibrio
VELOCITÀ DI SEDIMENTAZIONE Sottoponendo una soluzione, contenente un determinato soluto, ad un elevato campo centrifugo si otterrà un movimento radiale (rispetto all asse di rotazione) delle particelle di soluto FRONTE DI SEDIMENTAZIONE (fra solvente puro e soluzione contenente il materiale sedimentante) Lo spostamento del FRONTE DI SEDIMENTAZIONE nel tempo, monitorato mediante il sistema ottico, permette di definire il COEFFICIENTE DI SEDIMENTAZIONE (s). Da tale valore è possibile risalire alla MASSA MOLECOLARE RELATIVA (M r ). METODO NON PRECISISSIMO; il valore dovrebbe essere corretto tenendo conto delle variazioni di viscosità e di temperatura
SEDIMENTAZIONE ALL EQUILIBRIO Ad una determinata velocità di rotazione (campo centrifugo), dopo un determinato tempo, si raggiunge una situazione di equilibrio a cui c non si osserva più migrazione del soluto. LA MASSA MOLECOLARE RELATIVA È FUNZIONE DELLA POSIZIONE RADIALE Permette di stimare l abbondanza l relativa di complessi proteici
Di solito: SEDIMENTAZIONE ALL EQUILIBRIO A BASSA VELOCITÀ (tempi molto lunghi; da giorni a settimane.) L analisi delle differenze di velocità di sedimentazione con AUC, variando concentrazione e velocità di centrifugazione o prima e dopo trattamento con agenti denaturanti, fornisce informazioni: Variazioni conformazionali Formazione di complessi Proteina-proteina Proteina-substrato Proteina-ligando costanti associazione/dissociazione
Tecniche spettroscopiche Fotometria Fluorescenza CD Ligth scattering
Cambiamento nell intensit intensità del picco Intensità Lunghezza d onda Intensità Spostamento del picco Lunghezza d onda
Light scattering Peso molecolare K D Concentrazione proteica Radiazione incidente Radiazione riflessa Risalire al peso molecolare Si possono ricavare informazioni sul raggio idrodinamico di particelle in sospensione
Light Scattering (LS) Il LS è una tecnica di spettroscopia ottica, che, attraverso lo studio della diffusione di determinate lunghezze d'onda, permette di avere informazioni su forma, dimensioni e dinamica delle particelle. Lo studio della radiazione diffusa (scattering), infatti, poiché le caratteristiche della radiazione diffusa dipendono dai gradi traslazionali e rotazionali delle molecole nel mezzo in esame, permette di risalire ire al coefficiente di diffusione. In particolare, il LS si usa per studiare un sistema costituito da particelle (polimeri, macromolecole, proteine, nanocapsule,, ecc.) che si muovono in un fluido sospendente in concentrazione molto bassa.
A ANALITA Biacore Assay Surface preparation B LIGANDO Analysis Cycle Con: Flusso del tampone, salto di ph; Sali; agenti denaturanti, detergenti... Permette di: Riutilizzare la superficie biospecifica Usare minime quantità di ligando Sample injection Regeneration Evaluation Generazione dei dati desiderati
Equilibrio e Cinetica con Biacore konon A + B AB koffoff A B ANALITA LIGANDO A è l analita in soluzione CONCENTRAZIONE NOTA E COSTANTE (grazie al flusso continuo) AB è il complesso CONCENTRAZIONE MISURATA DIRETTAMENTE ed espressa in R o RU B è il ligando sulla superficie La CONCENTRAZIONE TOTALE può essere espressa in RU e rappresenta la massima capacità legante Rmaxmax Rmax-R rappresenta il ligando libero
SENSOGRAMMA La velocità con cui cambia il segnale R, permette di determinare i valori di d k on e k off
Informazioni in un sensogramma K D è la concentrazione di ANALITA a cui si ha il 50% di saturazione
ANALISI DELL AFFINITÀ 1. Quanto è FORTE il legame all equilibrio? DETERMINAZIONE dei valori delle costanti di affinità all equilibrio (associazione e di dissociazione). Plot Req against C Steady state model Concentration at 50% saturation is K D
Analisi di Specificità Sovrapposizione dei sensogrammi ottenuti dall interazione di diverse lectine con tiroglobulina immobilizzata.
STESSA AFFINITA MA CINETICA DIFFERENTE I 4 composti hanno la stessa affinità: : K D = 10 nm = 10-8 M Le costanti cinetiche di binding variano fino a 4 ordini di grandezza Concentration = 100 nm Concentration = 1000 nm 1035 k on k off 1035 Tutti i siti di legame sono occupati Response M -1 s -1 s -1 10 6 10-2 10 5 10-3 10 4 10-4 10 3 10-5 Time I composti con una bassa velocità di dissociazione, occupano il target più a lungo. Time
Flexibility in Assay Design Multiple assay formats providing complementary data Direct measurement Direct Binding Assay (DBA) Indirect measurement Surface competition assay (SCA) Inhibition in solution assay (ISA)