Il controllo di qualità in anatomia patologica e negli screening oncologici Torino 9-10 giugno 2008

Il controllo di qualità in anatomia patologica e negli screening oncologici Torino 9-10 giugno 2008 HPV:qualità del test e del percorso diagnostico Massimo Confortini UO Citologia Analitica e Biomolecolare

PROGRAMMI DI SCREENING CARATTERISTICHE DEL METODO Altamente sensibile e specifico Determinazione di un ampio spettro di HPV HR Minime quantità di campione (prelevato in maniera non invasiva) Alta riproducibilità intra/interlaboratorio Possibilità di eseguire molti test Semiautomatico o interamente automatico Costo limitato

SENSIBILITA E SPECIFICITA ANALITICA SENSIBILITA ANALITICA: la proporzione di donne HPV pos correttamente individuate da un test SENSIBILITA CLINICA: la proporzione di donne con malattia (lesioni >= cin2) che sono correttamente identificate da un test HPV

SENSIBILITA E SPECIFICITA CLINICA SPECIFICITA ANALITICA : la proporzione di donne HPV HR negative che sono correttamente identificate da un risultato negativo SPECIFICITA CLINICA: la proporzione di donne senza lesioni >= cin2 che sono che sono correttamente identificate da un risultato negativo

IMMUNOCITOCHIMICA Ricerca di antigeni capsidici, mediante l uso di anticorpi policlonali o monoclonali Valore diagnostico limitato in quanto nelle lesioni HPV-correlate gli antigeni strutturali non sono uniformemente presenti Non consentono una identificazione del genotipo virale

METODI MOLECOLARI 1. IBRIDAZIONE DIRETTA 2. IBRIDAZIONE CON AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE 3. AMPLIFICAZIONE DEL BERSAGLIO

Metodi per la individuazione di HPV DNA Descrizione Sensibilità Caratteristichei Filter ISH Ibridiz su filtro di estratto crudo 10-100 copie /cell Bassa specificità e sensibilità Dot Blot Ibridizz su DNA purificato su filtro 1-10/cell Alta specificità, laborioso Southern Blot Ibrid su DNA digerito su un supporto 0,1-1/cell Specificità molto alta, molto laborioso ISH Ibridizzazione diretta su cellule o tessuti 20/cell Conservazione della morfologia Hybrid Capture II Ibridiz liquida con RNA probes 100/campione Amplificazione del segnale PCR Amplificazione di DNA in vitro 1/campione Amplificazione target

IBRIDAZIONE DIRETTA 1. Southern blot: ottima sensibilità ma laboriosa, costosa e richiede notevoli quantità di materiale 2. Ibridazione in situ :permette di rivelare sequenze di DNA e/o RNA in preparati citologici o istologici preservando la morfologia cellulare ma è di difficile standardizzazione

METODI DI AMPLIFICAZIONE DEL BERSAGLIO Reazione polimerasica a catena:permette l amplificazione del bersaglio di sequenze specifiche di acidi nucleici utilizzando cicli ripetuti di sintesi del DNA

POLYMERASE CHAIN REACTION MY09/MY11: identificano 25 tipi di HPV e generano un frammento di 450bp sulla regione L1 GP5+/GP6+: Generano un frammento di 140bp sulla regione L1, identificando uno spettro di HPV simile, ma non identico, a My09/11 pu-1m/pu2r: identificano HPV ad alto rischio 16,18,31,33,35,45,52,58 ; generano un frammento di 233-268bp sulla regione E6.

HPV L1 general primer sets E6 E2 E5 L1 E7 E1 L2 E4 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 7904 My09/11 GP5+/6+ SPF 10 450 bp 150 bp 65 bp interprimer region

METODI DI IBRIDAZIONE CON AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE Hybrid Capture 2: sono una evoluzione dei metodi di ibridazione diretta e consentono un aumento della sensibilità legate al sistema di rivelazione che utilizza legami multimerici di molecole reporter

HYBRID CAPTURE Ibridizzazione in fase liquida sonda per 13 tipi di HPV HR (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68) sonda per 5 tipi HPV LR (6,11,42,43,44) chemioluminescenza qualitativo e semiquantitativo (RLU)

Digene s Hybrid Capture Technology Denature specimen Hybridize with RNA probe Capture and detect hybrids Luminescence

Current technology for HPV DNA detection of genital infections I test validati in trials di ampie dimensioni e in studi epidemiologici sono HC2 e metodi in PCR basati sull uso di primers consensus (MY09/11 E GP5/6)

PRESENTE PAP TEST Citologia convenzionale Citologia convenzionale+ lettura automatica Citologia in fase liquida Citologia in fase liquida+ lettura automatica Test HPV nelle diagnosi borderline Test HPV nelle diagnosi borderline

Amplicor HPV Test Amplificazione del DNA target con PCR Test qualitativo in vitro Permette la determinazione di HPV in campioni citologici in fase liquida (PresevCyt e SurePath TM) Individua 13 tipi di HPV ad alto rischio: 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59 e 68. Permette la simultanea amplificazione in PCR del DNA HPV target e del gene umano β-globina (controllo interno)

Kappa di concordanza tra HCII e PCR. (per i soli tipi di HPV presenti nella Sonda B) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0,68 0,62 0,65 0,715 0 Peyton** Alts Study* CSPO 2000 STM PC Pcr/HCII HCII/PCR HR - * Risultati di: ALTS study- J Nat Canc Inst 2000 -** Risultati di: Peyton C.L. et al, J Clin Micr 1998 Risultati di: Carozzi et al, Acta Citol, 2001

Quando tipizzare? Tipizzazione tipo-specifica nelle infezioni persistenti Nel follow-up delle lesioni trattate Studi epidemiologici Hpv Survey Studi vaccini

no DNA marker XIII no DNA Pos Ct # 1 # 2 # 3 # 4 # 5 # 6 # 7 # 8 # 9 # 10 450 bp L1 region E6 region 240 bp HPV 6/11 16 18 31 33 35 45 β- globin 5526 7151 5 L1 3 PCR product B oligomeric probes MY11 450 bp 16 18 31 MY09 PCR protocol marker V no DNA

FUTURO PROSSIMO TEST DI SCREENING PRIMARIO HPV Triage CITOLOGIA Triage P16 Triage RNAmessaggero E6/E7 Triage Carica virale Genotipizzazione Colposcopia Colposcopia Colposcopia Colposcopia Colposcopia Controllo citologico

HPV DNA QUANTITATION Melting curves HPV β-globin

INTEGRATION

100 75 Integrated 50 Concomitant 25 Episomial 0 CIN Micro-invasive cancer Invasive cancer J. Clin. Microbiol. 2002; Nagao S. et al Peitsaro et al

p16 ink4 La proteina di E7 inattiva il prodotto del gene del retinoblastoma, che inibisce la trascrizione del gene p16 Quindi nelle cellule displastiche l aumentata espressione degli oncogeni virali potrebbe riflettersi nell incrementata espressione di p16 ink4 Determinabile in ICC

Determinazione di trascritti di RNAm di E6/E7 La determinazione dell RNA messaggero che codifica per gli oncogeni virali E6/E7 con metodiche PCR Real time o NASBA ( Nuclei acid sequence based amplification assay) può rappresentare un più specifico predittore, rispetto al DNA HPV test di infezione progressiva.

Screening 25-64 con HPV DNA Test HPV eseguito con prelievo in STM HPV- HPV+/inconcl. RICHIAMO AL NORMALE INTERVALLO DI SCREENING Citologia negativa Citologia positiva ASCUS+/ Inadeguato tecnico Inadeguato per flogosi Ripete test HPV+ Citologia ad un anno Colposcopia Ripete test HPV+ Citologia a sei mesi

Follow-up HPV + Citologia ad un anno HPV+ Cito ASCUS+ HPV- Cito ASCUS+ HPV- Cito- HPV+ Cito- Colposcopia Ripete ad un anno citologia Rientro nel normale intervallo di screening Ripete ad un anno Cito+HPV

Test molecolare per ricerca HPV hr Punti critici che dovrebbero essere oggetto di valutazione Prelievo Tipo di test Grado di automazione del test Costo del test in termini di reattivi e personale Controlli di qualità Tipologia del laboratorio che esegue i test Specificità del test

Hybrid Capture 2 HPV Tests Specimen Collection Digene Cervical The ThinPrep Sampler Pap Test

Prelievo Sistemi di prelievo e conservazione utilizzati per la citologia in fase liquida sono sistemi utilizzabili per: Ricerca hpv (Preservcyte HC2 10 years) Tipizzazione hpv (Preservcyte PCR 4 Years) Test immunocitochimici ( 56 gg) Valutazione overespressione m-rna

Confronto fra i diversi costi LBC 88 campioni circa 800 per vial + test di conversione che comporta 5 ore lavoro prima di eseguire HC2 STM 88 campioni circa 220 + 2.30 di lavoro per denaturazione prima di eseguire HC2

Prelievo Prelievo in vial per LBC con test molecolare preceduto dalla conversione e successiva eventuale citologia sullo stesso vial Prelievo nella stessa seduta per Test HPV e per Citologia Convenzionale da colorarsi e leggersi solo nel caso di test molecolare positivo

StabilityStability of liquid pap specimens for the detection of High-risk HPV types with Roche Amplicor HPV test 21st International Conference HPV, 2004 Kosarikov and Rita Sun Cervical specimens collected in Surepath preservative fluid remained stable for testing when stored for up to 2 weeks at 2-8 C.

I test molecolari devono essere eseguiti in laboratori qualificati con esperienza di analisi molecolari, con requisiti strutturali che diano ampie garanzie rispetto al rischio di contaminazione e che eseguano almeno 500 test ogni anno.

Individuazione di un laboratorio Training Biomolecolare di riferimento Scelta delle metodologie Standardizzazione procedure preanalitiche ed analitiche Controlli di qualità Identificazione di genotipi controversi