Tranquility. Test non invasivo del DNA fetale per trisomie e aneuploidie sessuali. Approfondimento scientifico

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1 Tranquility Test non invasivo del DNA fetale per trisomie e aneuploidie sessuali Approfondimento scientifico

2 Tranquility Approfondimento scientifico Copyright 2015 Genoma SA Tutti i diritti riservati Supervisione medica: Dr. Frederic Amar Supporto medico e scientifico: Thomas Rio Frio, Ph.D. Vuk Dervnja, MD, MSc. Redazione e grafica: Aurelia Gremaud Aurelie Martin Elena Dalle Carbonare Ignacio Sainz Terrones Joao Mourao Jerome Pouzet Eventuali commenti sono benvenuti all indirizzo genoma@genoma.com Tranquility Approfondimento scientifico Tranquility analizza le cellule libere del DNA circolanti nel flusso sanguigno delle donne in gravidanza. Tranquility è in grado di rilevare la presenza delle anomalie cromosomiche più comuni quali la trisomia 21 (sindrome di Down), 18, 13, le aneuploidie sessuali e le microdelezioni. Tranquility è in grado di rilevare anche il sesso del feto. ll DNA libero circolante nel sangue materno viene isolato e sottoposto a sequenziamento massivo in parallelo dell intero genoma, utilizzando un processo di Next Generation Sequencing (NGS). Successivamente, un sofisticato sistema bioinformatico analizza i dati sequenziati. I valori della frazione di DNA fetale sono calcolati e incorporati nel test di validità finale per garantire l affidabilità dei risultati. L elevata precisione di questa analisi produce risultati accurati, disponibili in 5 giorni lavorativi dal ricevimento del campione in laboratorio. Tranquility è l unico test non invasivo del DNA fetale che utilizza un processo certificato CE- IVD per le trisomie 21, 18 e 13 in grado di rilevare anche le aneuploidie dei cromosomi sessuali, le microdelezioni e il sesso del nasciuturo. Tranquility viene eseguito con tecnologie MPS (Sequenziamento Massivo Parallelo), nel Laboratorio di Diagnostica Molecolare ad alta tecnologia della Fondazione Giovanni Paolo II di Campobasso, un presidio di eccellenza per l oncologia, le malattie cardiovascolari e la medicina specialistica, in collaborazione con Genoma Swiss Biotechnology, azienda leader europea nella diagnostica predittiva. Indice Screening prenatale 1 Evoluzione dell analisi prenatale Screening sul DNA fetale libero circolante Screening che non analizzano il DNA...12 Diagnostica invasiva...14 Patologie indagate Trisomie fetali comuni Aneuploidie sessuali Sindromi da microdelezione Tranquility Caratteristiche e performance Processi ad alta tecnologia Pubblicazioni scientifiche YM Dennis Lo et al., Rossa WK Chiu et al., Glenn E Palomaki et al., Mary E Norton et al., Naama Srebnik et al., Jacob A Canick et al., Wybo Dondorp et al., RCOG Scientific Impact Paper,

3 Screening prenatale

4 Evoluzione della medicina prenatale Dai test di screening biochimico all analisi del DNA fetale circolante Prevalenza delle anomalie cromosomiche In una popolazione di di individui Test Prenatali I test prenatali, indirizzati prevalentemente alla diagnosi della trisomia 21 (sindrome di Down), sono iniziati intorno al In principio, venivano utilizzati esclusivamente metodi non invasivi, con bassi livelli di affidabilità; la massima precisione diagnostica è stata raggiunta quando l analisi delle cellule fetali è divenuta possibile grazie alla villocentesi e all amniocentesi. Queste due procedure sono altamente invasive e comportano alcuni rischi per il feto. Inoltre sono fonte di notevole stress per la madre e per l intera famiglia. Dal 2011 è possibile analizzare il DNA fetale libero circolante nel sangue materno grazie a nuovi metodi di sequenziamento genetico pienamente validati, che richiedono soltanto un semplice prelievo di sangue. Un analisi altamente accurata del DNA fetale circolante è possibile a partire dalla decima settimana di gestazione Sindrome di Down 1428/1 milione Sindrome di Jacobs 1000/1 milione Sindrome di Klinefelter 1000/1 milione Sindrome di Turner 400/1 milione Cronologia dei test prenatali non invasivi Dal 1970 ai primi anni 80 Percentuale di trisomie 21 rilevate: inferiore al 35% Dai tardi anni 80 ai primi anni 90 Introduzione dello screening sul siero materno durante il secondo trimestre Percentuale di trisomie 21 rilevate: circa 60% Dai tardi anni 90 ai primi anni 2000 Introduzione di test combinati durante il primo trimestre Percentuale di trisomie 21 rilevate: circa 90% Dal 2011 Introduzione del test sul DNA fetale circolante Percentuale di trisomie 21 rilevate: circa 99% Prevalenza di anomalie cromosomiche La pagina a destra rappresenta un campione di popolazione pari ad 1 milione di neonati. I punti colorati indicano la prevalenza di aneuploidie. La sindrome di Down ha la più alta prevalenza (1/700). L obiettivo dei test prenatali è quello di fornire alle famiglie ed al personale medico informazioni il più possibile complete e precoci sulle eventuali anomalie cromosomiche del feto. Sindrome di Edwards 200/1 milione Trisomia X 100/1 milione Sindrome di Patau 62.5/1 milione 6 / Tranquility Approfondimento Scientifico

5 Screening sul DNA fetale libero circolante L unico metodo non invasivo basato sull analisi del DNA DNA fetale circolante Nel flusso sanguigno di ogni individuo sono presenti piccoli frammenti di materiale genetico, denominati DNA libero circolante. A partire dalla quinta settimana di gestazione, in una donna in stato di gravidanza è presente, oltre al DNA libero circolante di origine materna, anche DNA fetale, in una percentuale compresa tra il 2 ed il 40% (mediamente attorno al 10%). Il DNA fetale libero ha origine dalle cellule placentari, e viene continuamente rilasciato nel flusso sanguigno della madre. La percentuale di DNA fetale (frazione fetale) nel sangue materno aumenta durante il secondo ed il terzo trimestre e scompare dopo il parto. È attualmente possibile analizzare con grande precisione il DNA fetale libero circolante nel sangue materno, quando presente in una percentuale pari ad almeno il 4%. Questo avviene generalmente dopo la decima settimana di gestazione, e rende possibile l analisi del DNA fetale mediante un semplice prelievo di sangue materno. Massima affidabilità I frammenti di DNA libero circolante vengono sequenziati e confrontati con il genoma umano di riferimento. Quando il numero di un determinato cromosoma non corrisponde all atteso, si è in presenza di una aneuploidia. Gli studi sulle gravidanze ad alto rischio di trisomie hanno dimostrato che mediante un analisi del DNA fetale libero circolante nel sangue materno è possibile identificare il 98,9% dei casi, con una percentuale di falsi positivi pari a 0,1%. La presenza di risultati falsi positivi può comportare il ricorso a una procedura invasiva nel caso di una gravidanza con feto sano. I test basati sul sequenziamento del DNA fetale libero circolante nel sangue materno possono potenzialmente ridurre del 95% l applicazione di procedure invasive e gli aborti ad esse correlati. L analisi del DNA fetale circolante combina bassissime percentuali di falsi positivi e falsi negativi con il vantaggio di essere un analisi non invasiva 8 / Tranquility Approfondimento Scientifico

6 Per qualsiasi gravidanza L analisi del DNA fetale circolante è indicata per ogni donna in gravidanza, e può essere eseguita a partire dalla decima settimana di gestazione (per garantire una sufficiente quantità di frazione fetale). I fattori che possono influenzare l affidabilità del test sono mosaicismi confinati alla placenta, la sindrome del vanishing twin (gemello riassorbito), il peso della madre, come evidenziato dal grafico 1, e qualsiasi infezione, neoplasia o altra condizione che richieda trasfusioni di sangue (trattamento con cellule staminali, immunoterapia o trapianto). A tutte le età Un caso di trisomia può verificarsi in qualsiasi gravidanza. Il rischio di un feto affetto da trisomia aumenta considerevolmente con l età della madre, come evidenziato dal grafico 2. Proprio per questo elevato fattore di rischio, alle future madri oltre una certa soglia di età viene generalmente prescritta un analisi invasiva. L analisi del DNA fetale riduce notevolmente i rischi legati alle analisi invasive prescritte di routine. Rischio di trisomia Frazione fetal (%) % 2.5% 2.0% 1.5% 1.0% Peso della madre (Kg) 1 2 Trisomia 21 Sindrome di Down Trisomia 18 L American College of Obstetricians and Gynecologists raccomanda che lo screening prenatale delle aneuploidie sia proposto ad ogni donna in stato di gravidanza, indipendentemente dall età I test sul DNA fetale forniscono risultati accurati e necessitano semplicemente di un prelievo di sangue materno. Possono inoltre essere prescritti senza timore di complicazioni a qualsiasi donna in stato di gravidanza. 0.5% 0.0% Età della madre alla 12e settimana (anni) Trisomia / Tranquility Approfondimento Scientifico

7 Screening non basati sull analisi del DNA Test non invasivi standard FALSI POSITIVI DEL TEST COMBINATO Screening sul siero materno del secondo trimestre (tri-test) Analisi biochimiche Le procedure standard per i test prenatali sono basate sull analisi biochimica: test combinato durante il primo trimestre, e lo screening sul siero materno durante il secondo trimestre (tri-test). Nel caso di esito positivo in uno di questi due test, si raccomanda alla paziente di sottoporsi ad una procedura invasiva per la diagnosi definitiva. A causa delle alte percentuali di risultati falsi negativi, vengono individuati solo il 90% dei casi di trisomia 21. Sono inoltre numerosi i casi in cui, a causa dei numerosi falsi positivi, il test invasivo che ne segue riveli un feto non affetto da anomalie. I test non invasivi standard non individuano più del 10% dei casi di trisomia Tranquility ha una percentuale di falsi negativi inferiore allo 0,1% 19 risultati positivi su 20 al test combinato per la trisomia 21 sono errati (i feti non sono affetti da trisomia 21) Il tri-test può identificare una gravidanza con maggior rischio di trisomia 21 o 18. Il test prevede un prelievo sanguigno tra la quattordicesima e la ventesima settimana + 6 giorni di gestazione (il periodo ideale è tra la quindicesima e la diciassettesima settimana). Il test verifica i livelli ematici di tre proteine (AFP, hcg, estriolo non coniugato ed a volte anche inibina A); i risultati vengono poi incrociati con l età della madre. L esito viene espresso in termini di maggior rischio o basso rischio. Test combinato del primo trimestre (bi-test) Il test combinato abbina l età della madre con gli esiti di un analisi del sangue effettuata tra la nona e la tredicesima settimana di gestazione, e con i dati di un ecografia effettuata tra l undicesima e la tredicesima settimana di gestazione. L analisi del sangue misura i livelli di due diverse proteine presenti nel sangue materno, mentre l ecografia valuta la quantità di fluido presente nell epidermide sulla parte posteriore del collo del bambino (translucenza nucale). I test del primo trimestre dipendono da una serie di fattori che possono rendere inaffidabile il risultato finale. Periodo gestazionale: PAPP-A, free β-hcg dopo 9 settimane Peso elevato: PAPP-A, free β-hcg Gravidanza gemellare: due volte maggiore nel caso di due gemelli, tre volte maggiore nel caso di tre gemelli Diabete Mellito Insulino-Dipendente (IDDM): PAPP-A e free β-hcg in diminuzione Alto numero di gravidanze portate a termine (gravidity/parity): PAPP-A, free β-hcg Gravidanze precedenti: fattore di rischio due o tre volte maggiore, se durante le precedenti gravidanze era stato rilevato un rischio elevato. Test combinato β-hcg (prelievo sanguigno) Nome completo: Beta-gonadotropina corionica umana Origine: Trofoblasto T21: ( MoM: 1,8) PAPP-A (prelievo sanguigno) Nome completo: Proteina plasmatica A assiciata alla gravidanza Origine: Trofoblasto e cellule endometriali decidualizzate T21: ( MoM: 0,4) NT (ecografia) Nome completo: Spessore della translucenza nucale T21: ( MoM: 2-2,5) FALSI NEGATIVI DEL TEST COMBINATO 3-4 casi di trisomia 21 (sindrome di Down) su 20 non vengono rilevati dal test combinato Tri-test AFP (prelievo sanguigno) Nome completo: Alfa-fetoproteina Origine: Sacco vitellino/fegato fetale T21: ( MoM: 0,73) hcg (prelievo sanguigno) Nome completo: Gonadotropina corionica umana Origine: Trofoblasto T21: ( MoM: 2) UE3 (prelievo sanguigno) Nome completo: Estriolo non coniugato Origine: Unità fetoplacentare T21: ( MoM: 0,73) 12 / Tranquility Approfondimento Scientifico Patologie indagate / 13

8 Diagnostica invasiva Villocentesi ed amniocentesi Procedura diagnostica L età avanzata della madre o un test combinato che indichi rischio elevato possono rendere necessaria una procedura invasiva, quale la villocentesi (CVS) o l amniocentesi. Entrambe le metodiche garantiscono risultati affidabili, dal momento che i campioni vengono prelevati rispettivamente Villocentesi Settimane La CVS è un prelievo transaddominale o transcervicale di un campione di villi coriali della placenta. Grazie all analisi citogenetica FISH, entro poche ore dal prelievo sono già disponibili dei risultati preliminari sui cromosomi 21, 18, 13, X ed Y. Parallelamente, viene determinato il cariotipo fetale, mentre l eventuale presenza di anomalie cromosomiche viene confermata entro due settimane. Rischi Emorragie/perdite vaginali Perdite di liquido amniotico Infezioni Corioamnionite Aborto: 0,5% dalla placenta o dal liquido amniotico, che contengono cellule fetali. I campioni sono analizzati con test citogenetici o molecolari. La CVS e l amniocentesi comportano un fattore di rischio di aborto spontaneo, e sono pertanto fonte di ansia e disagio per la madre ed il resto della famiglia. Amniocentesi Settimane L amniocentesi è il prelievo transaddominale di un campione di liquido del sacco amniotico che circonda il feto. Le cellule fetali ottenute sono analizzate secondo le stesse metodiche della villocentesi. Rischi Perdite vaginali transitorie: 1-2% Perdite di liquido amniotico: 1-2% Corioamnionite: < 0.1% Perforazione del feto (raro, se viene utilizzato il sistema di guida ecografica) Aborto: 0,5-1% Inoltre, le metodiche invasive non sono raccomandate nel caso di gravidanze preziose, né in molti casi di fecondazione in vitro e ovodonazione. Un analisi invasiva provoca ansia, e non è consigliabile nel casi di gravidanze preziose Tranquility è un test sicuro e non genera ansia. Grazie alla percentuale di falsi positivi inferiore allo 0,1%, permette di evitare un amniocentesi non necessaria Metodi di analisi L amniocentesi e la villocentesi sono interamente basate su metodologie citogenetiche. Sono metodiche affidabili e praticate da moltissimi anni, tuttavia nessuna delle due può rendere superflui gli altri test o garantire un affidabilità assoluta. Ibridazione Fluorescente In Situ (FISH) Le regioni cromosomiche di interesse vengono marcate con tracciatori fluorescenti. Il microscopio fluorescente permette di visualizzare i cromosomi 21, 18, 13 ed X,Y come punti colorati. Un conteggio dei punti colorati permette di valutare la presenza di aneuploidie cromosomiche. Cariotipo Il cariotipo è la classificazione delle 23 coppie dei cromosomi di una cellula secondo la nomenclatura internazionale. Le cellule fetali contenute nel liquido amniotico vengono coltivate in incubatrice per un periodo tra i 7 ed i 10 giorni. Questo test viene effettuato su cellule ottenute dalle colture derivate dal campione. 14 / Tranquility Approfondimento Scientifico

9 Patologie indagate

10 Trisomie fetali comuni Cause, sintomi e diagnosi Fondamenti genetici I geni sono la mappa su cui si sviluppa l essere umano e forniscono istruzioni sul funzionamento delle cellule. Sono organizzazati in 22 coppie di autosomi più una coppia di cromosomi sessuali. Le trisomie sono il risultato di un numero eccessivo Sindrome di Down La sindrome di Down deve il suo nome al primo medico che la descrisse sistematicamente, John Langdon Down. La sindrome di Down descrive una serie di sintomi fisici e cognitivi provocati da una copia in eccesso, intera o parziale, del cromosoma 21. Trisomia 21 infatti significa che ogni cellula del corpo presenta tre copie del cromosoma 21 invece delle solite due. I cromosomi portano l informazione genetica che istruisce il corpo sul proprio sviluppo e sullo svolgimento di determinate funzioni. I soggetti affetti da sindrome di Down presentano una copia in eccesso, intera o parziale, del cromosoma 21 per un totale di di copie di un cromosoma e influenzano lo sviluppo e la salute del bambino colpito. Le trisomie più comuni sono la trisomia 21 (Sindrome di Down) e le trisomie 13 (sindrome di Patau) e 18 (sindrome di Edwards). profilo facciale piatto piega scimmiesca occipite piatto Tranquility rileva la presenza della trisomia 21 (sindrome di Down) con un livello di sensibilità e specificità pari al 99,9% piega epicantica occhi obliqui verso l alto ponte nasale piatto lingua sporgente divario tra 1 e 2 dito dei piedi 47 cromosomi. Il cromosoma 21 è il più piccolo cromosoma umano, con circa 48 milioni di coppie di basi, e rappresenta dall 1,5 al 2% del DNA delle cellule. Si tratta di una condizione cromosomica che comporta un ritardo nella capacità cognitiva, particolari caratteristiche del viso e scarsa tonicità muscolare (ipotonia) nell infanzia. Questa condizione è prevalentemente provocata dalla trisomia 21. In casi più rari, la sindrome di Down si manifesta quando una parte del cromosoma 21 resta attaccata (traslocata) a un altro cromosoma durante la formazione delle cellule riproduttive (ovuli e spermatozoi) o nelle prime fasi dello sviluppo fetale. Le persone che ne sono affette hanno, oltre alle due copie del cromosoma 21, anche materiale in eccesso attaccato a un altro cromosoma, con il risultato che il soggetto presenta tre copie di materiale genetico derivante dal cromosoma 21. Chi presenta questa anomalia genetica si dice sia affetto da sindrome di Down da traslocazione. La sindrome di Down non si limita a disturbi dello sviluppo cognitivo, ma può intaccare anche altri organi del corpo: Perdita dell udito (fino al 75% di chi è affetto dalla sindrome ne soffre); Apnea ostruttiva del sonno (tra il 50 e il 75%); Infezioni dell orecchio (tra il 50 e il 70%); Patologie oculari (fino al 60%); Malformazioni cardiache fin dalla nascita (50%); Anomalie dell apparato digerente, come blocco intestinale. II soggetti colpiti da sindrome di Down sono più esposti al rischio di sviluppare gravi condizioni patologiche. Tra queste, il reflusso gastroesofageo e la celiachia. Circa il 15% ha una ridotta funzione della ghiandola tiroidea (ipotiroidismo). Il rischio di patologie oculari e problemi dell udito aumenta. Inoltre, una piccola percentuale di bambini affetti dalla sindrome di Down sviluppa una forma tumorale delle cellule del sangue (leucemia). Tutti questi fattori influiscono sulla vita del bambino e della sua famiglia. Normal La sindrome di Down ha un incidenza di 1 caso su 830 neonati. Sebbene possa capitare a donne di qualsiasi età di avere un figlio colpito da questa condizione patologica, le possibilità aumentano con gli anni. I metodi tradizionali per diagnosticare la sindrome di Down in utero sono un esame ultrasonografico (misurazione della translucenza nucale e dell osso nasale),il test combinato, nonché l amniocentesi e la villocentesi. Anormale 18 / Tranquility Approfondimento Scientifico Patologie indagate / 19

11 Sindrome di Edwards La trisomia 18, nota anche come Sindrome di Edwards, è una condizione cromosomica che comporta anomalie in diverse parti del corpo. La maggior parte dei casi di trisomia 18 sono imputabili alla presenza di tre copie del cromosoma 18 nelle cellule del corpo invece delle solite due. Il materiale genetico in eccesso ostacola il corso normale dello sviluppo provocando le caratteristiche tipiche di questa condizione. Circa il 5 percento di chi è affetto da trisomia 18 ha una copia in eccesso del cromosoma 18 solo in alcune cellule del corpo. In questo caso, si parla di trisomia 18 a mosaico. La gravità di questa condizione dipende dal tipo e dal numero di cellule che presentano un cromosoma in eccesso. Lo sviluppo dei soggetti affetti da questa forma di trisomia 18 va quindi da normale a gravemente colpito. In rarissimi casi, una parte del braccio lungo (q) del cromosoma 18 resta attaccato (traslocato) a un altro cromosoma durante la formazione delle cellule riproduttive (ovuli e spermatozoi) o nelle prime fasi dello sviluppo dell embrione. I soggetti colpiti hanno, oltre alle due copie del cromosoma 18, anche materiale in eccesso attaccato a un altro cromosoma. Chi presenta questa anomalia genetica si dice affetto da trisomia 18 parziale. Se solo una parte del braccio q è in tre copie, i segni fisici possono essere meno gravi di quelli che si riscontrano generalmente nella trisomia 18. Se invece tutto il braccio q è in tre copie, i soggetti potrebbero essere altrettanto gravemente colpiti di chi ha tre copie dell intero cromosoma 18. La trisomia 18 spesso comporta una crescita rallentata prima della nascita (ritardo della crescita intrauterina) e peso ridotto al parto. I soggetti colpiti possono soffrire di difetti cardiaci e anomalie di altri organi prima della nascita. Tra le altre caratteristiche della trisomia 18, ricordiamo: testa piccola e di forma anomala, mascella e bocca piccole, pugno chiuso con indice sovrapposto al medio. A causa della presenza di diversi problemi medici potenzialmente letali, molti dei soggetti colpiti muoiono prima della nascita o entro il primo mese di vita. Dal 5 al 10% dei bambini colpiti sopravvivono al primo anno, ma spesso presentano gravi ritardi cognitivi. Nella maggior parte dei casi la trisomia 18 non è ereditaria, ma si manifesta come evento casuale durante la formazione di ovuli e spermatozoi. Un errore che si verifica nella divisione cellulare, noto come non-disgiunzione, comporta lo sviluppo di cellule riproduttive con un numero anomalo di cromosomi. La trisomia 18 ha un incidenza di circa 1 neonato su 5000; è più frequente durante la gravidanza, ma molti feti non sopravvivono al parto. Sebbene possa capitare a donne di qualsiasi età di avere un figlio colpito da questa condizione patologica, le possibilità aumentano con gli anni. I metodi tradizionali per diagnosticare la sindrome di Edwards sono esami ultrasonografici, l amniocentesi e la villocentesi. Sindrome di Patau La trisomia 13, nota anche come sindrome di Patau, è una condizione cromosomica che comporta grave ritardo cognitivo e anomalie fisiche in molte parti del corpo. La maggior parte dei casi di trisomia 13 sono imputabili alla presenza di tre copie del cromosoma 13 nelle cellule invece delle solite due. Il materiale genetico in eccesso ostacola il corso normale dello sviluppo provocando le caratteristiche tipiche di questa condizione. La trisomia 13 si può manifestare anche quando una parte del cromosoma 13 resta attaccato (traslocato) a un altro cromosoma durante la formazione delle cellule riproduttive (ovuli e spermatozoi) o nelle prime fasi dello sviluppo dell embrione. I soggetti colpiti hanno, oltre alle due copie normali del cromosoma 13, anche una copia in eccesso attaccata a un altro cromosoma. Capita raramente che solo una parte del cromosoma 13 sia presente in triplice copia. In questi casi, i segni fisici e i sintomi sono molto diversi da quelli che si riscontrano nei soggetti pienamente colpiti. Solo una piccola percentuale di persone affette da trisomia 13 ha una copia del cromosoma 13 in eccesso soltanto in alcune cellule. In questo caso, si parla di trisomia 13 a mosaico. La gravità di questa condizione dipende dal tipo e dal numero di cellule che presentano un cromosoma in eccesso. Le caratteriste fisiche di questi soggetti spesso sono meno accentuate di quelle di chi presenta una trisomia piena. Nella maggior parte dei casi la trisomia 13 non è ereditaria, ma si manifesta come evento casuale durante la formazione di ovuli e spermatozoi in genitori sani. Un errore che si verifica nella divisione cellulare, noto come nondisgiunzione, comporta lo sviluppo di cellule riproduttive con un numero anomalo di cromosomi. La maggior parte dei feti colpiti da sindrome di Patau (il 64% dal secondo trimestre in poi) vengono abortiti spontaneamente. I bambini tendono a essere piccoli per l età gestazionale. Le anomalie della linea mediana (per es. difetti del cuoio capelluto, seno dermico) sono tipiche. L oloprosencefalia (dovuta alla separazione incompleta del prosencefalo) è piuttosto comune. Tra le anomalie facciali vi sono il labbro leporino e il palato leporino. Comuni sono anche la microftalmia, il coloboma (fessure) dell iride e la displasia retinica. Le arcate sopraccigliari sono poco profonde e le fessure palpebrali risultano oblique. Le orecchie hanno una forma anomala e abbassata, la sordità è piuttosto diffusa. Sul retro del collo sono spesso presenti pieghe di pelle flaccida. Altrettanto diffusi sono i casi di piega palmare trasversale unica (o piega scimmiesca nella mano), polidattilia e unghie iperconvesse. Circa l 80% dei soggetti sono affetti da gravi anomalie congenite cardiovascolari; la destrocardia è molto frequente. Anche i genitali risultano spesso anomali in entrambi i sessi; per i polidattilia maschi si registrano criptorchidismo e anomalie dello scroto mentre per le femmine, casi di utero bicorne. Nella prima infanzia sono frequenti gli episodi di apnea. Il deficit intellettivo è grave. Proprio per la presenza di diverse patologie letali, molti nascituri affetti da trisomia 13 muoiono dopo i primi giorni o settimane di vita. Solo l 8-10% dei pazienti sopravvive oltre l anno, ma in genere con gravi ritardi dell apprendimento. La sopravvivenza a lungo termine ipertelorismo ampio naso piatto labiopalatoschisi orecchie basse interessa soprattutto i casi di mosaicismo. La trisomia 13 ha un incidenza di circa 1 neonato su Sebbene possa capitare a donne di qualsiasi età di avere un figlio colpito da questa condizione patologica, le possibilità aumentano con gli anni. I metodi tradizionali per diagnosticare la sindrome di Patau sono esami ultrasonografici, l amniocentesi e la villocentesi. 20 / Tranquility Approfondimento Scientifico Patologie indagate / 21

12 Aneuploidie sessuali Cause, sintomi e diagnosi Fondamenti genetici Per aneuploidia dei cromosomi sessuali si intende un anomalia numerica relativa al cromosoma X o Y, che comporta l aggiunta o la perdita di un intero cromosoma X o Y. Tra i cariotipi a mosaico più frequenti ricordiamo: 45,X/46XX; 46XX/47,XXX; e 46,XY/47,XXY. La variazione del numero Trisomia XXX La sindrome della tripla X, anche nota come trisomia X o 47,XXX, è caratterizzata dalla presenza di un cromosoma X in eccesso in tutte le cellule della donna. La sindrome della tripla X è provocata dalla presenza di una copia in eccesso del cromosoma X in tutte le cellule della donna. Proprio per questo, le cellule hanno in totale 47 cromosomi (47,XXX) invece dei soliti 46 (46,XX). Nella maggior parte dei casi, la trisomia X è conseguenza della nondisgiunzione in fase di meiosi, anche se la non-disgiunzione postzigotica si verifica circa nel 20% dei casi. Una correlazione con l età avanzata della madre (che è notoriamente dei cromosomi sessuali è una condizione genetica relativamente diffusa che interessa fino a 1 soggetto su 400. Le aneuploidie sessuali sono associate a fenotipi cognitivi e comportamentali caratteristici, anche se il livello di gravità può coprire un ampio spettro. associata alla maggiore probabilità di episodi di non-disgiunzione) si riscontra in circa il 30% dei casi di trisomia X. Il mosaicismo (46,XX/47,XXX,47,XXX/48,XXXX o in combinazioni che comprendono le linee cellulari della sindrome di Turner 45,X) si verifica circa nel 10% dei casi. Si ritiene che il fenotipo della trisomia X sia associato alla sovraespressione dei geni presenti nel cromosoma X che evita la sua disattivazione, ma non sono ancora state stabilite specifiche relazioni genotipo fenotipo. Anche se i soggetti femminili affetti da sindrome della tripla X possono essere più alti della media, questa anomalia cromosomica di solito non comporta caratteristiche fisiche insolite. La maggior parte delle donne colpite hanno uno sviluppo sessuale normale e Tranquility è l unico test che utilizza un processo certificato CE-IVD per le trisomie 21, 18 e 13 che rileva anche le aneuploidie sessuali sono in grado di concepire figli. La sindrome della tripla X comporta maggiori rischi di ritardo dell apprendimento e dell acquisizione delle competenze della parola e del linguaggio. È possibile riscontrare anche ritardi dello sviluppo delle capacità motorie (come stare seduto e camminare), scarso tono muscolare (ipotonia) nonché difficoltà emotive e comportamentali, ma queste caratteristiche variano molto. Nel 10% delle donne interessate si rilevano anche crisi epilettiche e anomalie renali. Questa condizione registra un incidenza di 1 neonato di sesso femminile su Sindrome di Turner La sindrome di Turner è una condizione cromosomica che interessa lo sviluppo dei soggetti femminili. Circa la metà dei soggetti affetti da sindrome di Turner presenta monosomia del cromosoma X, il che significa che tutte le cellule del corpo hanno una sola copia di questo cromosoma sessuale invece delle solite due. La sindrome di Turner si manifesta non solo in totale assenza di uno dei cromosomi sessuali, ma anche se questo è solo parzialmente mancante o alterato. Alcune donne affette da sindrome di Turner presentano un anomalia cromosomica solo in alcune cellule (mosaicismo). La caratteristica più diffusa di questa condizione è la bassa statura, che diventa evidente verso l età di 5 anni. Molto frequente è anche la perdita precoce della funzione ovarica (ipofunzione ovarica o insufficienza ovarica prematura). Inizialmente, le ovaie si sviluppano normalmente, ma le cellule ovariche in genere muoiono prematuramente e la maggior parte del tessuto ovarico si deteriora prima della nascita. Molte ragazze affette dalla sindrome non entrano in pubertà a meno di essere sottoposte a terapia ormonale e la maggior parte non è in grado di procreare. Circa il 30% presenta pieghe di pelle sul collo (collo palmato), attaccatura dei capelli bassa sulla nuca, rigonfiamento e gonfiore (linfedema) delle mani e dei piedi, anomalie scheletriche o problemi renali. Da un statura bassa collo palmato petto carenato deformità del gomito capezzoli distanziati ovaie primitive (sottosviluppate) senza follicoli nevi ipofunzione primaria amenorrea attaccatura dei capelli bassa coartazione aortica scarso sviluppo del seno problemi renali quarto metacarpo accorciato unghie piccole 22 / Tranquility Approfondimento Scientifico Patologie indagate / 23

13 terzo alla metà dei soggetti affetti da sindrome di Turner nasce con difetti cardiaci, come il restringimento della grande arteria che esce dal cuore (coartazione aortica) o anomalie della valvola che collega l aorta al cuore (valvola aortica). Le complicanze derivanti da queste cardiopatie possono rivelarsi letali. La maggior parte dei soggetti femminili affetti da sindrome di Turner ha un intelligenza nella norma. È possibile rilevare ritardi dello sviluppo e dell apprendimento non verbale nonché problemi comportamentali, sebbene tali caratteristiche varino a seconda dei soggetti. Nella maggior parte dei casi, la sindrome di Turner non è ereditaria. Quando è imputabile alla monosomia del cromosoma X in quanto questa alterazione cromosomica si manifesta come evento casuale durante la formazione delle cellule riproduttive (ovuli e spermatozoi) nel genitore della persona colpita. Un errore che si verifica nella divisione cellulare, noto come non-disgiunzione, comporta lo sviluppo di cellule riproduttive con un numero anomalo di cromosomi. Di rado la sindrome di Turner provocata dalla parziale delezione del cromosoma X può essere trasmessa da una generazione all altra. Questa condizione ha un incidenza di 1 neonato di sesso femminile su 2500 in tutto il mondo, ma è molto più frequente nelle gravidanze che non giungono a termine (aborti spontanei e morti endouterine fetali). Sindrome di Jacobs La sindrome di Jacobs (47,XYY) è caratterizzata dalla presenza di una copia in eccesso del cromosoma Y nelle cellule dell uomo. La sindrome di Jacobs (47,XYY) è caratterizzata dalla presenza di una copia in eccesso del cromosoma Y nelle cellule dell uomo. Vista la presenza di un cromosoma Y supplementare, le cellule hanno in totale 47 cromosomi invece dei soliti 46. Non è ancora stato chiarito perché questa copia in eccesso del cromosoma Y comporti una maggiore altezza, problemi dell apprendimento e altre caratteristiche per l uomo. Alcuni soggetti affetti hanno il cromosoma Y in eccesso solo in alcune cellule (mosaicismo). La maggior parte degli uomini affetti ha uno sviluppo sessuale nella norma ed è in grado di procreare. La sindrome 47,XYY comporta un maggior rischio di ritardo dell apprendimento e dell acquisizione delle competenze della parola e del linguaggio. È possibile riscontrare anche ritardi dello sviluppo delle capacità motorie (come stare seduto e camminare), scarso tono muscolare (ipotonia), tremolio delle mani ed altri movimenti involontari (tic motori) nonché difficoltà emotive e comportamentali. Nella maggior parte dei casi, la sindrome 47,XYY non è ereditaria. Questa condizione ha un incidenza di 1 neonato di sesso maschile su Sindrome di Klinefelter La sindrome di Klinefelter (47,XXY) è una condizione cromosomica che interessa lo sviluppo cognitivo e fisico dei soggetti maschili. Nella maggior parte dei casi, la sindrome di Klinefelter è imputabile alla presenza di una copia in eccesso nelle cellule del cromosoma X. Le copie supplementari di geni del cromosoma X interferiscono con lo sviluppo sessuale dell uomo, spesso impedendo ai testicoli di funzionare normalmente e riducendo i livelli di testosterone. La sindrome di Klinefelter e le sue varianti non vengono ereditate; queste alterazioni genetiche in genere si manifestano come eventi casuali durante la formazione delle cellule riproduttive (ovuli e spermatozoi) nel genitore. La maggior parte dei soggetti colpiti presenta le caratteristiche di seguito riportate, anche se alcuni non hanno o hanno pochi sintomi o tratti significativi. In genere, questi soggetti hanno testicoli piccoli che non producono valori di testosterone nella norma. La carenza di testosterone può ritardare o impedire il completamento della pubertà e può provocare sviluppo delle mammelle (ginecomastia), riduzione dei peli su volto e corpo e incapacità di avere figli biologici (infertilità). Alcuni soggetti possono anche avere anomalie genitali, ivi compresa la mancata discesa dei testicoli (criptorchidismo), l apertura dell uretra sulla parte inferiore del pene (ipospadia) o un pene insolitamente piccolo (micropenia). Gli uomini affetti da sindrome di Klinefelter tendono a essere più alti della media. Rispetto agli altri soggetti, gli adulti che presentano questa condizione corrono un maggior rischio di sviluppare tumori della mammella e una patologia infiammatoria cronica nota come lupus erimatoso sistemico. La probabilità che sviluppino queste malattie è simile a quella delle donne nella popolazione generale. I bambini possono presentare ritardi dell apprendimento e dello sviluppo del linguaggio e della parola. Tendono a essere tranquilli, sensibili, mansueti, ma le caratteristiche della personalità variano molto a seconda dei soggetti. Alcuni soggetti che presentano caratteristiche tipiche della sindrome di Klinefelter hanno più di un cromosoma sessuale in eccesso nelle cellule (per esempio 48,XXXY o 49,XXXXY). Tali condizioni, spesso note come varianti della sindrome di Klinefelter, tendono a caratterizzare maggiormente i soggetti e a provocare sintomi più gravi della condizione classica. Oltre a influenzare lo sviluppo sessuale dell uomo, le varianti della sindrome di Klinefelter comportano ritardo cognitivo, caratteristiche facciali distintive, anomalie scheletriche, scarsa coordinazione motoria, gravi disturbi della parola. Più è alto il numero dei cromosomi sessuali in eccesso, più cresce il rischio di problemi di salute. Questa condizione ha un incidenza di 1 neonato di sesso maschile su Ma la maggior parte delle varianti della sindrome di Klinefelter è molto più rara: 1 neonato su o anche meno. statura alta scarsa crescita della barba tendenza a perdere peli del torace fianchi larghi conformazione femminile dei peli pubici micopenis calvizie frontale assente spalle strette sviluppo del seno osteoporosi atrofia testicolare 24 / Tranquility Approfondimento Scientifico Patologie indagate / 25

14 Sindromi da microdelezione Cause, sintomi e diagnosi Fondamenti genetici Per sindromi da microdelezione si intende un gruppo di patologie clinicamente riconoscibili caratterizzate dalla piccola delezione di un segmento cromosomico che comprende più geni, per cui ognuno potenzialmente contribuisce al fenotipo in modo indipendente. Le microdelezioni si Sindrome di DiGeorge La sindrome di DiGeorge, anche nota come sindrome da delezione 22q11.2, è una patologia provocata da un difetto del cromosoma 22. La delezione si verifica verso la metà del cromosoma in una posizione nota come q11.2. Questo comporta lo scarso sviluppo di diversi sistemi del corpo. Tra i sintomi e i tratti distintivi ricordiamo le anomalie cardiache spesso presenti dalla nascita, l apertura sul palato (palato leporino) e le caratteristiche facciali riconoscibili. I soggetti affetti da sindrome da delezione 22q11.2 sono spesso colpiti da ricorrenti infezioni provocate da disturbi del sistema immunitario. Alcuni sviluppano malattie autoimmuni come l artrite reumatoide distinguono per posizione genomica e dimensione. Nella maggior parte dei casi non hanno conseguenze cliniche, ma alcune sono caratterizzate da un fenotipo clinico e comportamentale complesso. e il morbo di Graves in cui il sistema immunitario attacca i tessuti e gli organi del corpo stesso. I soggetti interessati potrebbero sviluppare anche insufficienza respiratoria, anomalie renali, bassi livelli di calcio nel sangue (che può indurre crisi epilettiche), diminuzione delle piastrine (trombocitopenia), significativi disturbi dell alimentazione, problemi gastrointestinali e perdita dell udito. È possibile riscontrare anche tratti distintivi a livello scheletrico, tra cui la statura medio-bassa e, con meno frequenza, anomalie delle ossa della colonna vertebrale. Molti bambini caratterizzati da questa condizione presentano ritardi dello sviluppo, ivi compreso ritardo della crescita e della parola nonché deficit di apprendimento. Una volta cresciuti, questi soggetti corrono maggiori Tranquility è in grado di rilevare le più frequenti microdelezioni che causano sindromi riconoscibili rischi di sviluppare malattie mentali come schizofrenia, depressione, ansia e disturbo bipolare. Inoltre, chi soffre di sindrome da delezione 22q11.2 ha anche maggiori possibilità di essere affetto da sindrome da deficit di attenzione e iperattività (ADHD) nonché da condizioni dello sviluppo come disturbi dello spettro autistico che influenzano la comunicazione e l interazione sociale. Si stima che la sindrome da delezione 22q11.2 interessi 1 soggetto su Questa condizione potrebbe comunque essere anche più frequente in quanto i medici e i ricercatori sospettano che sia sottostimata da un punto di vista diagnostico a causa della variabilità delle sue caratteristiche. È possibile che non venga rilevata in soggetti che presentano sintomi e tratti meno evidenti o che si confonda con altri disturbi dalle caratteristiche simili. L ereditarietà della sindrome da delezione 22q11.2 è considerata autosomica dominante perché la delezione in una copia del cromosoma 22 di tutte le cellule è sufficiente per provocare questa condizione. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, la sindrome non viene ereditata. La delezione si manifesta nella maggior parte dei casi come un evento casuale durante la formazione delle cellule riproduttive (ovuli e spermatozoi) o nelle prime fasi dello sviluppo fetale. In genere, le persone colpite non riscontrano questa condizione nell anamnesi familiare, tuttavia la possono passare ai propri figli. Circa nel 10% dei casi, chi ne è colpito ha ereditato la delezione nel cromosoma 22 da un genitore. Nei casi dove la patologia è ereditata, anche altri familiari potrebbero essere colpiti. Sindrome Cri-du-Chat La sindrome Cri-du-Chat (del grido di gatto), anche nota come 5p- (5p meno), è una condizione cromosomica che si verifica in mancanza di una parte del cromosoma 5. I bambini colpiti hanno spesso un pianto stridulo che ricorda il verso del gatto. Questa patologia è contraddistinta da deficit intellettivo e ritardo dello sviluppo, testa di piccole dimensioni (microcefalia), peso limitato alla nascita e scarso tono muscolare (ipotonia) nell infanzia. I soggetti affetti da sindrome Cri-du-Chat presentano anche caratteristiche facciali ben riconoscibili che comprendono occhi molto distanziati (ipertelorismo), orecchie basse, mascella piccola e faccia rotonda. Alcuni bambini nascono con un difetto cardiaco. La sindrome Cri-du-Chat è provocata dalla delezione della fine del braccio corto (p) del cromosoma 5. Le dimensioni della delezione variano a seconda dei soggetti colpiti; dagli studi emerge che le delezioni più ampie tendono a provocare deficit intellettivi più gravi e maggiore ritardo dello sviluppo rispetto alle delezioni più limitate. Piega dell epicanto ponte nasale piatto orecchie basse piccole lesioni palpebrali naso all insù appiattimento della fossa mediale del labbro superiore (philtrum) micrognatismo I sintomi e i tratti distintivi della sindrome Cri-du-Chat sono probabilmente connessi alla perdita di più geni sul bracco corto del cromosoma 5. I ricercatori ritengono che in particolare la perdita di un gene specifico, CTNND2, comporti il grave deficit intellettivo di alcuni soggetti colpiti. I ricercatori stanno ancora lavorando per stabilire come la perdita di altri geni in questa regione possa contribuire alle caratteristiche tipiche della sindrome. Nella maggior parte dei casi, la sindrome Cri-du-Chat non è 26 / Tranquility Approfondimento Scientifico Patologie indagate / 27

15 ereditaria. La delezione si verifica molto spesso come un evento casuale durante la formazione delle cellule riproduttive (ovuli e spermatozoi) o nelle prime fasi dello sviluppo fetale. Di solito nei soggetti colpiti non si riscontra un anamnesi familiare e solo il 10% circa di chi è affetto da sindrome Cri-du-Chat eredita l anomalia cromosomica da un genitore sano. In questi casi, il genitore è portatore di un riarrangiamento cromosomico noto come traslocazione bilanciata che non comporta acquisizione o perdita di materiale genetico. Di solito le traslocazioni bilanciate non provocano problemi di salute; possono tuttavia sbilanciarsi quando vengono trasmesse alla generazione successiva. I bambini che ereditano una traslocazione non bilanciata possono presentare un riarrangiamento cromosomico con aggiunta o sottrazione di materiale genetico. Ai soggetti affetti da sindrome Cri-du-Chat che ereditano una traslocazione non bilanciata manca il materiale genetico del braccio corto del cromosoma 5, fatto che comporta il deficit intellettivo e i problemi di salute tipici di questa condizione. Si stima che la sindrome Cri-du-Chat si riscontri in 1 bambino su Sindrome di Prader-Willi La sindrome di Prader-Willi è una condizione genetica complessa provocata dalla perdita di funzione dei geni di una particolare regione del cromosoma 15 che interessa diverse parti del corpo. Nell infanzia questa condizione è contraddistinta da scarso tono muscolare (ipotonia), disturbi dell alimentazione, crescita ridotta e ritardo dello sviluppo. Fin da piccoli, questi soggetti hanno un appetito insaziabile che li porta al cronico consumo eccessivo di cibo (iperfagia) e all obesità. Alcuni, in particolare chi ha problemi di obesità, sviluppano anche il diabete mellito di tipo 2 (la forma più comune di diabete). Chi è affetto dalla sindrome di Prader-Willi in genere ha un deficit intellettivo da lieve a medio e disturbi dell apprendimento. I problemi comportamentali sono frequenti, tra cui scoppi d ira, testardaggine e comportamenti compulsivi come la dermatilomania. Si possono verificare anche anomalie del sonno. Tra le altre caratteristiche di questa condizione: la fronte stretta, gli occhi a mandorla e la bocca triangolare, ma anche la bassa statura nonché le mani e i piedi di piccole dimensioni. Alcuni soggetti affetti da sindrome di Prader-Willi hanno la pelle insolitamente pallida e i capelli di colore chiaro. Sia gli uomini che le donne presentano genitali sottosviluppati, la pubertà è ritardata o incompleta e la maggior parte non è in grado di procreare. Generalmente si eredita una copia del cromosoma 15 da ciascun genitore. Alcuni geni vengono attivati solo sulla copia ereditata dal padre (copia paterna). Questa attivazione del gene di origine parentale è causata da un fenomeno detto imprinting genomico. La maggior parte dei casi di sindrome di Prader-Willi (circa il 70%) si verifica quando si cancella nelle cellule un segmento del cromosoma 15 di origine paterna. A chi è affetto da questa alterazione cromosomica mancano alcuni geni critici in questa regione, dato che i geni della copia paterna sono stati cancellati e i geni della copia materna sono disattivati. Nel 25% dei casi, il soggetto colpito ha due copie del cromosoma 15 ereditato dalla madre (copie materne) invece di una copia da ogni genitore. Questo fenomeno è noto come disomia uniparentale materna. In casi rari, la sindrome di Prader-Willi può essere provocata anche da un riarrangiamento cromosomico noto come traslocazione o da una mutazione o altro difetto che disattiva i geni del cromosoma 15 paterno. È probabile che i tratti caratteristici della sindrome di Prader-Willi derivino dalla perdita di funzione di diversi geni del cromosoma 15. Tra questi, ci sono geni che forniscono istruzioni per realizzare molecole note come small nucleolar RNA (snornas). Queste molecole svolgono una varietà di funzioni, tra cui contribuire a regolare altri tipi di molecole RNA (le molecole RNA svolgono ruoli fondamentali nella produzione delle proteine e in altre attività cellulari). Dagli studi emerge che la perdita di un determinato gruppo di geni snorna, noto come cluster SNORD116, possa svolgere un ruolo importante nell insorgenza dei sintomi e dei tratti caratteristici della sindrome. Tuttavia non è stato ancora chiarito come l assenza del cluster SNORD116 possa contribuire al deficit intellettivo, ai problemi comportamentali e alle caratteristiche fisiche tipiche della patologia. In alcuni soggetti affetti da sindrome di Prader-Willi, la perdita di un gene noto come OCA2 è all origine di una pelle insolitamente pallida e capelli di color chiaro. Il gene OCA2 è situato in quel segmento del cromosoma 15 che spesso risulta cancellato nei soggetti affetti da questa condizione. Tuttavia, la sua perdita non comporta l insorgenza di altri sintomi o tratti distintivi della sindrome di Prader-Willi. La proteina prodotta da questo gene è quella che contribuisce a determinare la colorazione (pigmentazione) della pelle, dei capelli e degli occhi. Nella maggior parte dei casi, la sindrome di Prader-Willi non è ereditaria, soprattutto quando all origine c è la delezione del cromosoma 15 di origine paterna o la disomia uniparentale materna. Queste alterazioni genetiche si manifestano come eventi casuali durante la formazione delle cellule riproduttive (ovuli e spermatozoi) o nella prima fase dello sviluppo embrionico. Di solito nei soggetti colpiti non si riscontra un anamnesi familiare. Secondo le stime, la sindrome di Prader-Willi colpisce 1 persona su in tutto il mondo. 28 / Tranquility Approfondimento Scientifico Patologie indagate / 29

16 Tranquility

17 Caratteristiche e performance Tranquility, il test prenatale non invasivo più completo Un processo consolidato per risultati affidabili Tranquility analizza il DNA fetale libero circolante nel sangue materno. Il quantitativo di DNA fetale presente nel flusso sanguigno materno a partire dalla 10a settimana di gestazione (12a per le gravidanze gemellari) è sufficiente per effettuare il test e ottenere risultati affidabili. Il campione di sangue viene ricevuto dai laboratori della Fondazione Giovanni Paolo II di Campobasso e i frammenti di DNA libero circolante vengono estratti dal sangue materno, purificati e infine analizzati con il metodo di sequenziamento massivo in parallelo del genoma basato sull uso della tecnologia NGS (Next Generation Sequencing). I dati del sequenziamento sono infine analizzati con avanzati mezzi bioinformatici per fornire risultati chiari e accurati. Tranquility si attiene ai più severi standard qualitativi e rispetta le leggi e direttive dell Unione Europea. Il test è certificato CE-IVD* per il rilevamento delle trisomie 21, 18 e 13. Aneuploidie cromosomiche Normalmente, ogni cromosoma ha due copie. Quando il rapporto di un cromosoma è diverso da 1:1, si verifica un aneuploidia cromosomica, che può generare una patologia nel nascituro. Le più comuni sono: Trisomia 21 Trisomia 18 Trisomia 13 Aneuploidie dei cromosomi sessuali (X,Y) Microdelezioni L analisi del genoma può evidenziare la delezione di alcune parti dei cromosomi. Le delezioni possono interessare uno o più geni contigui e portare all insorgenza di patologie. Tra le più frequenti clinicamente riconosciute: Sindrome di Angelman Sindrome di Cri-Du-Chat Sindrome di DiGeorge Sindrome di Prader-Willi Sindrome da microdelezione 2q33.1 Sesso del feto La combinazione cromosomica XY determina il sesso maschile, quello femminile è determinato dalla combinazione XX. Il sesso del feto sarà riportato se consentito dalla normativa vigente. Il sequenziamento dell intero genoma e le tecniche bioinformatiche d avanguardia garantiscono l assoluta affidabilità dei test per tutte le patologie indagate * Tranquility utilizza prodotti e processi a marchio CE-IVD 32 / Tranquility Approfondimento Scientifico

18 Massima accuratezza Dalla 10 a * settimana di gestazione, l analisi effettuata con Tranquility sui frammenti di DNA liberi circolanti nel sangue materno genera risultati di assoluta affidabilità. La frazione fetale viene calcolata e inserita nell algoritmo, riducendo così al minimo le probabilità di falsi positivi o falsi negativi. Questa accuratezza è di primaria importanza per il medico e per il paziente. Alta sensibilità > 99,9% Questo valore esprime la capacità di Tranquility di evitare falsi negativi. Questi si verificano quando il risultato del test è negativo (nessuna anomalia rilevata), mentre invece il feto presenta l anomalia indagata. Alta specificità > 99,9% L inserimento nell algoritmo del calcolo della frazione fetale porta la probabilità di falsi positivi e falsi negativi prossima allo 0% Screening completo del DNA libero circolante Gravidanze singole Il referto del test Tranquility riporta l eventuale rilevazione di un aneuploidia cromosomica o/e di microdelezioni. Il referto riporterà anche il sesso del feto, se richiesto, e se la normativa vigente lo consente. Gravidanze Gemellari Il referto del test Tranquility riporterà l eventuale rilevazione delle trisomie 21, 18 o 13 in almeno uno dei feti. Qualora sia stato richiesto di conoscere il sesso dei bambini, e se consentito dalla normativa vigente rilevante, sarà specificata la presenza di due feti di sesso femminile oppure la presenza di almeno uno di sesso maschile. Frazione Fetale Sarà altresì misurata e riportata la frazione fetale. La sua incorporazione nell algoritmo rafforza le performance analitiche. Questo valore esprime la capacità di Tranquility di evitare falsi positivi. I falsi positivi inducono a esami invasivi rischiosi e non necessari, mentre il feto non presenta l anomalia indagata. Trisomie 21, 18, 13 (CE-IVD*) In caso di Risultato coerente con due copie del cromosoma, questo vuol dire che è stato individuato il numero atteso di copie di cromosomi. Aneuploidie sessuali** In caso di Risultato coerente con due cromosomi sessuali, questo vuol dire che è stato individuato il numero atteso di copie dei cromosomi. Microdelezioni** Se sono state individuate una o più microdelezioni, nel referto saranno precisate la posizione sul genoma e le dimensioni della microdelezione. Trisomia N Sensibilità N. di casi 95% IC 1 Specificità N. di casi 95% IC 1 T > 99.9% 43/ % - 100% > 99.9% 394/ % - 100% T > 99.9% 10/ % % > 99.9% 427/ % - 100% T > 99.9% 5/5 35.9% - 100% > 99.9% 432/ % - 100% In caso di Risultato coerente con una trisomia, questo vuol dire che il test ha individuato tre copie di uno dei cromosomi indici di trisomia. In caso di Risultato coerente con un aneuploidia dei cromosomi sessuali, questo vuol dire che il test ha individuato un alterazione nel numero dei cromosomi indici di un aneuploidia sessuale. Il tipo di aneuploidia sarà specificato: XXY, XXX, X o XYY. 1 IC - Intervallo di confidenza Dati disponibili nel sito * Tranquility utilizza prodotti e processi a marchio CE-IVD **Solo per le gravidanze singole 34 / Tranquility Approfondimento Scientifico Tranquility / 35

19 G C T C G G A G G G T C C T A C G C C C A C G G A A T C T C G C T G A T T G C T A G C A C A G C A Processi ad alta tecnologia Sequenziamento massivo in parallelo dell intero genoma L intero processo di Tranquility è conforme alle direttive CE-IVD per le trisomie 21, 18 e 13 Una procedura ottimizzata Tranquility utilizza una procedura automatizzata per assicurare la coerenza e la riproducibilità dei risultati. La Fondazione Giovanni Paolo II ha optato per il metodo di sequenziamento massivo in parallelo dell intero genoma per l elevata precisione dei risultati, il basso tasso di errori degli esami e la capacità di fornire dettagli analitici. Purificazione dei frammenti di DNA estratti dal sangue materno Preparazione dei frammenti di DNA per costituire una libreria ad hoc Adattatore sequenziamento Indice Molecolare + Adattatore sequenziamento Immobilizzazione della libreria sul supporto del sequenziamento Sequenziamento della libreria tramite NGS (Next- Generation Sequencing) Analisi delle informazioni di sequenziamento tramite bioinformatica CGATTTAACT GCTAAATTGC ACCACGAT TGGAGCTA 36 / Tranquility Approfondimento Scientifico

20 A Purificazione dei frammenti di DNA estratti dal sangue materno B Preparazione dei frammenti di DNA per costituire una libreria ad hoc Il DNA viene recuperato dal sangue e, dopo centrifugazione, i frammenti liberi sono estratti dal plasma. Il materiale cellulare e proteico è sottoposto a lisi mentre il DNA viene recuperato con perle magnetiche cui si lega in modo selettivo. Il DNA è successivamente purificato e sottoposto a eluizione per ottenere un campione della massima qualità. Tramite un sistema robotico chiuso ad alta capacità di produzione, si possono trattare fino a 96 campioni al giorno con il massimo quantitativo di frammenti di DNA genomico recuperato. Questo sistema consente di evitare gli errori manuali e garantire la coerenza dei risultati. Assicura inoltre la totale tracciabilità per tutta la procedura di purificazione e analisi. Una volta contrassegnati e amplificati, i frammenti di DNA purificati vengono a costituire una libreria di sequenziamento. La preparazione della libreria è automatizzata per migliorare l efficienza e la riproducibilità del processo. I frammenti di DNA sono saldati alle estremità per smussarle e gli adattatori di sequenziamento sono legati su entrambi i lati. Ogni adattatore contiene un indice molecolare ad hoc per il campione che consentirà il riconoscimento delle sue specifiche sequenze. Il campione è purificato e arricchito secondo la costruzione del giusto sequenziamento. Tutti i frammenti preparati costituiscono la libreria di sequenziamento, che è ad hoc per i singoli soggetti e facilmente identificabile grazie all indice molecolare. 38 / Tranquility Approfondimento Scientifico Tranquility / 39

21 C Immobilizzazione della libreria sul supporto di sequenziamento Una volta pronta, la libreria viene caricata sul supporto di sequenziamento. Tale supporto presenta milioni di piccoli vani, dotati ciascuno di un proprio sensore. Ognuno di questi riceverà una perla magnetica su cui sarà stato immobilizzato un frammento di DNA della libreria. Questa operazione di manipolazione è molto delicata e l automazione consente di ottenere sempre risultati di alta qualità. D Sequenziamento della libreria tramite NGS (Next Generation Sequencing) Il DNA è composto da miliardi di basi chimiche: nucleotidi (A, T, C e G). Sequenziamento vuol dire stabilire l ordine esatto di tali basi in un determinato segmento di DNA. Tranquility si avvale della tecnologia Next Generation Sequencing per effettuare il simultaneo sequenziamento di milioni di frammenti. Ogni vano del supporto, che contiene una perla carica di frammenti di DNA, è dotato di un sensore (1). C G T A A T H + Sensing Layer Sensing Plate OH A H + G C T A A G C A T C T ph V TCGTACC... C G T A A T OH OH T T H + H + G A C T A A G C A T C T 1 2 Le basi vengono fatte passare una dopo l altra attraverso il supporto. Quando una risulta complementare rispetto a un altra per aggiungere un frammento, viene incorporata nel filamento di DNA in costruzione. Viene allora rilasciato un protone (H+) che induce un cambiamento nel potenziale rilevato dal sensore (2). La lettura del segnale (3) porta alla determinazione della sequenza di ogni frammento preso dalla libreria. v Signal Proc. Bases A (AA) (TTT) (AA) v Signal Proc. A T T Sequence:...AATCTTCTGAATTTCTGCAA Flow 40 / Tranquility Approfondimento Scientifico Tranquility / 41

22 E Analisi delle informazioni di sequenziamento tramite bioinformatica L algoritmo confronta i frammenti sequenziati con il genoma di riferimento (1) e valuta statisticamente il numero dei cromosomi presenti nel feto (2) per stabilire l eventuale presenza di aneuploidie. ACCACGAT GGA CTGG CGATTTAACT ACCACGATTTAACTGGA Frammenti di DNA sequenziati Genoma di riferimento 1 La piattaforma bioinformatica InKaryo garantisce una assoluta accuratezza dei risultati Grazie al conteggio della frazione fetale e al suo inserimento nell algoritmo, Tranquility registra ottimi livelli di performance analitica. 2 Si rileva la presenza di aneuploidie quando si riscontrano numeri di frammenti superiori alle aspettative VS. VS. VS La tecnologia Next Generation Sequencing (NGS) offre le indagini più complete nei tempi più ridotti, con un accuratezza prossima al 99% 42 / Tranquility Approfondimento Scientifico

23 Pubblicazioni scientifiche

24 Pubblicazioni scientifiche Test prenatale del DNA fetale libero, un approccio rivoluzionario Lancet, 1997 Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum Un cambiamento epocale nella diagnostica prenatale Come affermano i principali medici e ricercatori, i test prenatali non invasivi (NIPT) che si basano sul DNA fetale libero circolante nel plasma della futura madre hanno determinato una rivoluzione nella diagnostica prenatale. Diversi studi clinici hanno dimostrato l efficacia dei test prenatali non invasivi (NIPT) per l identificazione delle sindromi di Down, Edwards e Patau nelle gravidanze a rischio. L alta specificità e sensibilità di Tranquility garantiscono a medici e pazienti la possibilità di effettuare uno screening non invasivo altamente affidabile e tempestivo Y. M. Dennis Lo, Noemi Corbetta, Paul F. Chamberlain, Vik Rai, Ian L. Sargent, James S. Wainscoat Abstract Background: The potential use of plasma and serum for molecular diagnosis has generated interest. Tumour DNA has been found in the plasma and serum of cancer patients, and molecular analysis has been done on this material. We investigated the equivalent condition in pregnancy - that is, whether fetal DNA is present in maternal plasma and serum. Methods: We used a rapid-boiling method to extract DNA from plasma and serum. DNA from plasma, serum, and nucleated blood cells from 43 pregnant women underwent a sensitive Y-PCR assay to detect circulating male fetal DNA from women bearing male fetuses. Findings: Fetus-derived Y sequences were detected in 24 (80%) of the 30 maternal plasma samples, and in 21 (70%) of the 30 maternal serum samples, from women bearing male fetuses. These results were obtained with only 10 microl of the samples. When DNA from nucleated blood cells extracted from a similar volume of blood was used, only five (17%) of the 30 samples gave a positive Y signal. None of the 13 women bearing female fetuses, and none of the ten non-pregnant control women, had positive results for plasma, serum or nucleated blood cells. Interpretation: Our finding of circulating fetal DNA in maternal plasma may have implications for non-invasive prenatal diagnosis, and for improving our understanding of the fetomaternal relationship. 46 / Tranquility Approfondimento Scientifico Pubblicazioni scientifiche / 47

25 British Medical Journal, 2011 Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study Rossa W.K. Chiu, Ranjit Akolekar, Yama W.L. Zheng, Tak Y. Leung, et al. If referrals for amniocentesis or chorionic villus sampling were based on the sequencing test results, about 98% of the invasive diagnostic procedures could be avoided. Abstract Objectives: To validate the clinical efficacy and practical feasibility of massively parallel maternal plasma DNA sequencing to screen for fetal trisomy 21 among high-risk pregnancies clinically indicated for amniocentesis or chorionic villus sampling. Design: Diagnostic accuracy validated against full karyotyping, using prospectively collected or archived maternal plasma samples. Setting: Prenatal diagnostic units in Hong Kong, United Kingdom, and the Netherlands. Participants: 753 pregnant women at high risk for fetal trisomy 21 who underwent definitive diagnosis by full karyotyping, of whom 86 had a fetus with trisomy 21. Intervention: Multiplexed massively parallel sequencing of DNA molecules in maternal plasma according to two protocols with different levels of sample throughput: 2-plex and 8-plex sequencing. Main outcome measures: Proportion of DNA molecules that originated from chromosome 21. A trisomy 21 fetus was diagnosed when the z score for the proportion of chromosome 21 DNA molecules was >3. Diagnostic sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value were calculated for trisomy 21detection. Results: Results were available from 753 pregnancies with the 8-plex sequencing protocol and from 314 pregnancies with the 2-plex protocol. The performance of the 2-plex protocol was superior to that of the 8-plex protocol. With the 2-plex protocol, trisomy 21 fetuses were detected at 100% sensitivity and 97.9% specificity, which resulted in a positive predictive value of 96.6% and negative predictive value of 100%. The 8-plex protocol detected 79.1% of the trisomy 21 fetuses and 98.9% specificity, giving a positive predictive value of 91.9% and negative predictive value of 96.9%. Conclusion: Multiplexed maternal plasma DNA sequencing analysis could be used to rule out fetal trisomy 21 among high-risk pregnancies. If referrals for amniocentesis or chorionic villus sampling were based on the sequencing test results, about 98% of the invasive diagnostic procedures could be avoided. 48 / Tranquility Approfondimento Scientifico

26 Genetics in Medicine, 2012 American Journal of Obstetrics & Gynecology, 2012 DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study Non-Invasive Chromosomal Evaluation (NICE) Study: results of a multicenter prospective cohort study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18 Glenn E. Palomaki, Cosmin Deciu, Edward M. Kloza, et al. Mary E. Norton, Herb Brar, Jonathan Weiss, et al. Abstract Abstract Purpose: To determine whether maternal plasma cell free DNA sequencing can effectively identify trisomy 18 and 13. Methods: Sixty-two pregnancies with trisomy 18 and 12 with trisomy 13 were selected from a cohort of 4,664 pregnancies along with matched euploid controls (including 212 additional Down syndrome and matched controls already reported), and their samples tested using a laboratory-developed, next-generation sequencing test. Interpretation of the results for chromosome 18 and 13 included adjustment for CG content bias. Results: Among the 99.1% of samples interpreted (1,971/1,988), observed trisomy 18 and 13 detection rates were 100% (59/59) and 91.7% (11/12) at falsepositive rates of 0.28% and 0.97%, respectively. Among the 17 samples without an interpretation, three were trisomy 18. If z-score cutoffs for trisomy 18 and 13 were raised slightly, the overall false-positive rates for the three aneuploidies could be as low as 0.1% (2/1,688) at an overall detection rate of 98.9% (280/283) for common aneuploidies. An independent academic laboratory confirmed performance in a subset. Conclusion: Among high-risk pregnancies, sequencing circulating cell free DNA detects nearly all cases of Down syndrome, trisomy 18, and trisomy 13, at a low false-positive rate. This can potentially reduce invasive diagnostic procedures and related fetal losses by 95%. Evidence supports clinical testing for these aneuploidies. Objective: We sought to evaluate performance of a noninvasive prenatal test for fetal trisomy 21 (T21) and trisomy 18 (T18). Study design: A multicenter cohort study was performed whereby cellfree DNA from maternal plasma was analyzed. Chromosomeselective sequencing on chromosomes 21 and 18 was performed with reporting of an aneuploidy risk (High Risk or Low Risk for each subject. Results: Of the 81 T21 cases, all were classified as High Risk for T21 and there was 1 false-positive result among the 2888 normal cases, for a sensitivity of 100% (95% confidence interval [CI], %) and a false-positive rate of 0.03% (95% CI, %). Of the 38 T18 cases, 37 were classified as High Risk and there were 2 false-positive results among the 2888 normal cases, for a sensitivity of 97.4% (95% CI, %) and a false-positive rate of 0.07% (95% CI, %). Conclusion: Chromosome selective sequencing of cell-free DNA and application of an individualized risk algorithm is effective in the detection of fetal T21 and T / Tranquility Approfondimento Scientifico Pubblicazioni scientifiche / 51

27 Human Reproduction, 2013 Physician recommendation for invasive prenatal testing: the case of the precious baby Tranquility is risk-free for both expecting mother and fetus, and it is suitable for any kind of pregnancy Naama Srebnik, Talya Miron-Shatz, Jonathan J. Rolison, Yaniv Hanochand Avi Tsafrir Abstract Study question: Do clinicians manage pregnancies conceived by assisted reproductive technologies (ART) differently from spontaneous pregnancies? Summary answer: Clinicians decisions about prenatal testing during pregnancy depend, at least partially, on the method of conception. What is known already: Research thus far has shown that patients decisions regarding prenatal screening are different in ART pregnancies compared with spontaneous ones, such that ARTpregnancies maybe consideredmore valuable or precious than pregnancies conceived without treatment. Study design, size and duration: In this cross-sectional study, preformed during the year 2011, 163 obstetricians and gynecologists in Israel completed an anonymous online questionnaire. Participants, setting,methods: Clinicians were randomly assigned to readone oftwoversions of a vignette describing the case of a pregnant woman. The twoversions differed only with regard to the method of conception (ART; n ¼ 78 versus spontaneous; n ¼ 85). Clinicians were asked to provide their recommendations regarding amniocentesis. Main results and the role of chance: The response rate among all clinicians invited to complete the questionnaire was 16.7%. Of the 85 clinicians presented with the spontaneous pregnancy scenario, 37 (43.5%) recommended amniocentesis. In contrast, of the 78 clinicians presented with the ART pregnancy scenario, only 15 (19.2% recommended the test Clinicianswere 3.2 (95% confidence interval [CI]: ) times more likely to recommend amniocentesis for a spontaneous pregnancy than for an ART pregnancy. Limitations and reasons for caution: The study is limited by a low response rate, the relatively small sample and the hypothetical nature of the decision, as clinician recommendations may have differed in an actual clinical setting. Wider implications of the findings: Our findings show that fertility history and use of ART may affect clinicians recommendations regarding amniocentesis following receipt of screening test results. This raises the question of how subjective factors influence clinicians decisions regarding other aspects of pregnancy management. 52 / Tranquility Approfondimento Scientifico

28 Prenatal Diagnosis, 2013 European Journal of Human Genetics, 2015 The impact of maternal plasma DNA fetal fraction on Next Generation Sequencing tests for common fetal aneuploidies Jacob A. Canick, Glenn E. Palomaki, Edward M. Kloza, Geralyn M. Lambert-Messerlian and James E. Haddow Non-invasive prenatal testing for aneuploidy and beyond: challenges of responsible innovation in prenatal screening. Summary and recommendations Wybo Dondorp, Guido de Wert, Diana W Bianchi et al., on behalf of the European Society of Human Genetics (ESHG) and the American Society of Human Genetics (ASHG) Abstract Abstract Maternal plasma contains circulating cell-free DNA fragments originating from both the mother and the placenta. The proportion derived from the placenta is known as the fetal fraction. When measured between 10 and 20 gestational weeks, the average fetal fraction in the maternal plasma is 10% to 15% but can range from under 3% to over 30%. Screening performance using next-generation sequencing of circulating cell-free DNA is better with increasing fetal fraction and, generally, samples whose values are less than 3% or 4% are unsuitable. Three examples of the clinical impact of fetal fraction are discussed. First, the distribution of test results for Down syndrome pregnancies improves as fetal fraction increases, and this can be exploited in reporting patient results. Second, the strongest factor associated with fetal fraction is maternal weight; the false negative rate and rate of low fetal fractions are highest for women with high maternal weights. Third, in a mosaic, the degree of mosaicism will impact the performance of the test because it will reduce the effective fetal fraction. By understanding these aspects of the role of fetal fraction in maternal plasma DNA testing for aneuploidy, we can better appreciate the power and the limitations of this impressive new methodology. In the past few years, professional bodies and policy authorities have recommended offering NIPT for common aneuploidies to women who belong to a higher risk group, either based on maternal age or a positive combined first trimester screening test (cfts). With recent publications suggesting equally good test performance in lowerrisk populations, and depending on the health care setting, different scenarios for NIPT-based screening for common autosomal aneuploidies are possible, including NIPT as an alternative first-tier test. The greater accuracy and lower invasive follow-up testing rate that can thus be achieved, has the potential of helping prenatal screening better achieve its aim, provided that balanced pre-test information and non-directive counseling are available as part of the screening offer. Concerns have been raised that as a result of these same features (greater accuracy and lower invasive follow-up testing rate), prenatal screening may increasingly be regarded both by professionals and pregnant women as a routine procedure that as such would not require much reflection. This may have the consequence that women or couples are insufficiently prepared for the possible eventual diagnosis of a fetus with a serious disorder. Avoiding such routinisation effects may well be the greatest ethical challenge of NIPT-based prenatal screening. 54 / Tranquility Approfondimento Scientifico Pubblicazioni scientifiche / 55

29 Royal College of Obstetricians and Gynaecologists, 2014 Non-invasive Prenatal Testing for Chromosomal Abnormality using Maternal Plasma DNA Scientific Impact Paper No. 15 March 2014 Opinion NIPT using maternal plasma DNA is available for several conditions. Obstetricians have used NIPT to guide management of women who are RhD-negative and whose fetuses are at risk of HDFN for many years and guidelines should already reflect this change in practice. Fetal sex determination for clinical indications in pregnancies at high sex-linked genetic risk is also established practice. Testing for aneuploidy and especially Down syndrome by maternal plasma MPS is now available commercially but while the test result is much more accurate than existing screening strategies, it is still not a diagnostic assay. Hence, the term non-invasive testing is currently used. Detection of Down syndrome by maternal plasma DNA testing will alter the way that prenatal diagnosis and screening is delivered in the UK, both in the NHS and the private sector. It will have significant implications for some existing services such that clinical biochemistry serum screening laboratories and cytogenetic and molecular genetics laboratories can expect a fall in the number of samples. Since women are already accessing these tests, all obstetricians should have knowledge of the counselling issues involved. In addition, major NHS health policy decisions are required. In time, this technology is likely to become the primary screen for chromosomal abnormalities in pregnancy. This will enhance the information available to pregnant women while greatly reducing the loss of uncomplicated pregnancies as a result of miscarriage caused by unnecessary invasive procedures. In time, this technology is likely to become the primary screen for chromosomal abnormalities in pregnancy. This will enhance the information available to pregnant women while greatly reducing the loss of uncomplicated pregnancies as a result of miscarriage caused by unnecessary invasive procedures 56 / Tranquility Approfondimento Scientifico

30 Tranquility Il test prenatale non invasivo più completo Trisomie 21, 18, 13 (dispositivo certificato CE-IVD) Aneuploidie dei cromosomi sessuali (XY) Microdelezioni Rilevamento del sesso del feto Calcolo della frazione fetale per garantire risultati affidabili Adatto anche per parti gemellari e derivanti da procreazione medicalmente assistita con ovodonazione Tecnologia e professionalità Tranquility si basa sul metodo di sequenziamento massivo in parallelo dell intero genoma basato sull uso della tecnologia Next Generation Sequencing (NGS) che garantisce la massima completezza dell indagine. Il test viene eseguito con tecnologie NGS (Sequenziamento di Nuova Generazione), nel laboratorio della Fondazione di Ricerca e Cura Giovanni Paolo II a Campobasso, un ente altamente specializzato, in collaborazione con Genoma Swiss Biotechnology, azienda leader europea nella diagnostica predittiva. Le competenze della Fondazione sull NGS e la piattaforma bioinformatica utilizzata (InKayro) consentono di garantire la massima performance analitica. Affidabile e accurato Tranquility garantisce il miglior tasso di individuazione delle patologie e il minor numero di falsi negativi di tutti i test analoghi disponibili sul mercato. La frazione fetale è calcolata per garantire l affidabilità dei risultati. La sensibilità alla sindrome di Down è pari al >99,9%. Standard qualitativi Tranquility si attiene ai più severi standard qualitativi e rispetta le direttive dell Unione Europea. Tutto il processo di indagine delle trisomie (raccolta dei campioni, preparazione, sequenziamento, analisi bioinformatica e refertazione) è conforme alla Direttiva Europea Dispositivi medico-diagnostici in vitro 98/79/ CE. Il kit di Tranquility è dotato di un sistema di isolamento termico con gel pack, per una migliore protezione dei campioni. Il test è effettuato in Europa, quindi non sono previsti trasporti intercontinentali. Evita i rischi dell amniocentesi Tranquility non comporta rischi né per il feto né per la gestante. Richiede un unico prelievo di sangue materno e riduce tutti i rischi connessi agli esami invasivi. Pratico e conveniente Il test può essere effettuato in qualsiasi giorno della settimana, a partire dalla 10 a settimana di gestazione. I risultati sono consegnati entro 5 giorni lavorativi dalla ricezione del campione in laboratorio. Il prezzo accessibile di Tranquility rispecchia l impegno assunto dalla Fondazione Giovanni Paolo II di Campobasso per diffondere la medicina predittiva in Europa.

31 Bibliografia di riferimento Kloza EM, Haddow PK, Halliday JV, O Brien BM, Lambert-Messerlian GM and Palomaki GE, Evaluation of Patient Education Materials: The Example of Circulating cell free DNA Testing for Aneuploid, Journal of Genetic Counselling, 2015;24(2): Royal College of Obstetricians & Gynaecologists, Non-invasive Prenatal Testing for Chromosomal Abnormality using Maternal Plasma DNA, Scientific Impact Paper No.15, 2014 Canick, JA, Palomaki GE, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM and Haddow JE, The impact of maternal plasma DNA fetal fraction on next generation sequencing tests for common feral aneuploidies, Prenatal Diagnosis, 2013;33(7): Benn P, Borell A, Chiu R, Cuckle H, Dugoff L, Faas B, Gross S, Johnson J, Maymon R, Norton M, Odibo A, Schielen P, Spencer K, Huang T, Wright D and Yaron Y, Position Statement from the Aneuploidy Screening Committee on Behalf of the Board of the International Society for Prenatal Diagnosis, Prenatal Diagnosis, 2013;33(7): Gregg AR, Gross SJ, Best RG, Monaghan KG, Bajaj K, Skotko BG, Thompson BH and Watson MS for The Noninvasive Prenatal Screening Work Group of the American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG statement on noninvasive prenatal screening for fetal aneuploidy, Genetics in Medicine, 2013;15: Devers PL, Cronister A, Ormond KE, Facio F, Brasington CK and Flodman P, Noninvasive prenatal testing/noninvasive prenatal diagnosis: the position of the National Society of Genetic Counselors, Journal of Genetic Counseling, 2013;22: American College of Obstetricians and Gynecologists Committee on Genetics, Committee Opinion No. 545: noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy, Obstetrics & Gynecology, 2012;120: Norton ME, et al., Non-Invasive Chromosomal Evaluation (NICE) Study: results of a multicenter prospective cohort study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18, American Journal of Obstetrics & Gynecology, 2012;207 Palomaki GE, et al., DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study, Genetics in Medicine, 2012;14(3): Rabinowitz JD, et al., Presented data at National Society of Genetic Counselors Annual Education Conference 2012, 2012, ASHG Abstract Chiu RWK, Akolekar R, Zheng YWL, Leung TY, Sun H, Chan KCA, Lun FMF, Go ATJI, Lau ET, To WWK, Leung WC, Tang RYK, Au- Yeung SKC, Lam H, Kung YY, Zhang X, van Vugt JMG, Minekawa R, Tang MHY, Wang J, Oudejans CBM, Lau TK, Nicolaides KH, Lo YMD, Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study, BMJ, 2011;342:c7401 Rossa W.K. Chiu, Ranjit Akolekar, Yama W.L. Zheng, Tak Y. Leung, et al. Noninvasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study. BMJ. 2011; 342: c7401. ACOG Committee on Practice Bulletins, ACOG Practice Bulletin No. 77: screening for fetal chromosomal abnormalities, Obstetrics & Gynecology, 2007;109(1): Graham JM, Smith s recognizable patterns of human malformation, Saunders, Philadelphia, 2007 Nicolaides KH, Nuchal translucency and other first-trimester sonographic markers of chromosomal abnormalities, American Journal of Obstetrics and Gynecology, 2004;191:45-67 Pertl B, Bianchi DW, Fetal DNA in maternal plasma: emerging clinical applications, Obstetrics & Gynecology, 2001;98(3): CEMAT Group, Randomised trial to assess safety and fetal outcome of early and mid-trimester amniocentesis, Lancet, 1998;351: Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, Rai V, Sargent IL, Redman CW and Wainscoat JS, Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum, Lancet, 1997;350: Sundberg K, Bang J, Smidt-Jensen S, et al, Randomised study of risk of fetal loss related to early amniocentesis versus chorionic villus sampling, Lancet 1997;350: Foster UG, Jackson L, Limb defects and chorionic villus sampling; results from an international registry , Lancet, 1996;347: Firth HV, Boyd PA, Chamberlain PF, MacKenzie IZ, Morriss-Kay GM, Huson SM, Analysis of limb reduction defects in babies exposed to chorion villus sampling. Lancet, 1994;343: Simpson JL, Elias S, Isolating fetal cells in maternal circulation for prenatal diagnosis, Prenatal Diagnosis,1994;14: Nicolaides KH, Brizot M, Patel F, Snijders R, Comparison of chorionic villus sampling and amniocentesis for fetal karyotyping at weeks gestation, Lancet,1994;344: Ganshirt-Ahlert D, Borjesson-Stoll R, Burschyk M, Dohr A, Garritsen HSP, Helmer L, Miny P, Velasco M, Walde C, Patterson D, Teng N, Bhat NM, Bieber MM and Holzgreve W, Detection of fetal trisomies 21 and 18 from maternal blood using triple gradient and magnetic cell sorting, American Journal of Reproductive Immunology, 1993;30: Ammala P, Hiilesmaa VK, Liukkonen S, Saisto T, Teramo K and Von Koskull H, Randomized trial comparing first trimester transcervical chorionic villus sampling and second trimester amniocentesis, Prenatal Diagnosis, 1993;13: Bianchi DV, Mahr A, Zickwolf GK, House TW, Flint AF and Klinger KV, Detection of fetal cells with 47XY,+21 karyotype in maternal peripheral blood, Human Genetics, 1992;90: Smidt-Jensen S, Permin M, Philip J, Lundsteen C, Zachary JM, Fowler SE and Gruning K, Randomised comparison of amniocentesis and transabdominal and transcervical chorionic villus sampling, Lancet,1992;340: European study: MRC working party on the evaluation of chorion villus sampling, Lancet, 1991;337: Firth HV, Boyd PA, Chamberlain P, MacKenzie IZ, Lindenbaum RH and Huson SM, Severe limb abnormalities after chorion villous sampling at days gestation, Lancet,1991;337: Canadian Collaborative CVS Amniocentesis Clinical Trial Group, Multicentre randomised clinical trial of chorion villus sampling and amniocentesis, Lancet, 1989;i:1 6 Froster-Iskenius UG and Baird PA, Limb reduction defects in over one million consecutive live births, Teratology, 1989;39: Ager RP and Oliver RW, In The Risks of Mid-trimester Amniocentesis, Being a Comparative, Analytical Review of the Major Clinical Studies, Salford University, 1986 Tabor A, Philip J, Madsen M, Bang J, Obel EB and Norgaard-Pedersen B, Randomised controlled trial of genetic amniocentesis in 4,606 low-risk women, Lancet, 1986;i: Nicolaides KH, Sebire NJ, Snijders RJM, Ximenes RLS, The week scan, sonoworld.com/client/fetus/html/11-14week/chapter-01/chapter-01-final.htm, 2001 U.S. National Library of Medicine, Genetics Home Reference - Down Syndrome, condition/downsyndrome U.S. National Library of Medicine, Genetics Home Reference - Trisomy 18, trisomy-18 U.S. National Library of Medicine. Genetics Home Reference -Trisomy trisomy-13 Center for Academic Resource & Training in Anthropogeny, Genomics - Sex Chromosome Aneuploidies, anthropogeny.org/moca/topics/sexchromosome-aneuploidies 60 / Tranquility Approfondimento Scientifico Tranquility Approfondimento Scientifico / 61

32 Esonero di responsabilità Sarà cura del medico curante utilizzare le informazioni qui contenute per guidare la scelta del paziente anche consigliando, qualora lo si ritenga opportuno, una specifica consulenza genetica o ulteriori test diagnostici quali l amniocentesi o la villocentesi. Ogni test diagnostico deve essere interpretato alla luce di tutti i dati clinici disponibili. Il test di screening per le trisomie 21, 18 e 13 è stato certificato CE-IVD. Come per qualsiasi test medico, esiste sempre una possibilità di errore nell analisi del campione. Sono state, tuttavia, prese significative misure per evitare tali errori. Limitazioni del test Questo test è stato ideato per analizzare aneuploidie ed è stato convalidato per i cromosomi 21, 18, 13, X e Y. Il test è validato per gravidanze singole o gemellari con età gestazionale di, rispettivamente, almeno 10 e 12 settimane. É raccomandata la consulenza genetica di un esperto prima e dopo aver effettuato il test. I risultati non escludono la possibilità che la gravidanza possa essere interessata da altre anomalie cromosomiche o genetiche, malformazioni congenite o altre complicazioni. Questo test non è stato ideato per identificare gravidanze a rischio di malformazioni del tubo neurale. Quando in una gravidanza gemellare viene rilevata un aneuploidia, lo stato di ciascun feto non può essere determinato. Nelle gravidanze gemellari, qualora sia stato richiesto di conoscere il sesso dei bambini, se consentito dalla normativa vigente, il risultato del test riporterà se è stato rilevato almeno un maschio o se entrambi I feti sono di sesso femminile. Il numero limitato di dati disponibili per le gravidanze gemellari preclude il calcolo delle prestazioni. Un risultato negativo non esclude del tutto la presenza della trisomia 21, della trisomia 18, della trisomia 13, e delle aneuploidie dei cromosomi sessuali. Esiste una limitata possibilità che i risultati del test possano non rispecchiare i cromosomi del feto, ma le modifiche cromosomiche della placenta (mosaicismo confinato alla placenta) o della madre (mosaicismo cromosomico). É possibile ottenere un risultato falso positivo in caso di vanishing twin (gemello riassorbito), in questo caso il risultato non dipende dalla performance del test, ma dalla presenza di DNA del gemello riassorbito nel sangue materno. Risultati quali Aneuploidia Rilevata o Microdelezione Rilevata sono da considerarsi positivi e dovrebbe, quindi, essere consigliato alla paziente di ricorrere a procedure prenatali invasive di conferma, quali ad esempio la villocentesi e l amniocentesi, al fine di ottenere una diagnosi definitiva. Fondazione di Ricerca e Cura Giovanni Paolo II La Fondazione di Ricerca e Cura Giovanni Paolo II è un presidio d eccellenza per l oncologia, le malattie cardiovascolari e la medicina specialistica. Classificato quale Ente di Ricerca di alta specializzazione, la Fondazione è anche sede accademica dell Università Cattolica del Sacro Cuore con diversi corsi di laurea e di perfezionamento attivi. La ricerca scientifica, specialmente all interno dei moderni laboratori, è uno degli ambiti caratterizzanti l eccellenza della Fondazione che si distingue per aver portato a conclusione diversi progetti pluriennali di ricerca di base, clinica ed epidemiologica ed è particolarmente attiva nella ricerca sulle malattie cardiovascolari e oncologiche in ambito traslazionale. Molipharma Molipharma è una azienda spin off dell Università Cattolica del Sacro Cuore, impegnata a condurre progetti di ricerca volti alla sviluppo di innovativi farmaci e diagnostici, con riferimento particolare all ambito della ginecologia oncologica e della medicina predittiva e personalizzata. L elevata specializzazione del team di ricercatori e la dotazione di strumenti ad elevato livello tecnologico all interno dei propri laboratori ubicati anche presso la Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli di Roma, ne fanno una eccellenza nazionale nel settore biotech. 62 / Tranquility Approfondimento Scientifico