Precedente figlio affetto da anomalia cromosomica Genitori portatori di anomalia strutturale dei cromosomi

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1 LINEE GUIDA PER LA CITOGENETICA Dicembre 2005

2 INDICAZIONI ALL ANALISI Età materna >/= 35 anni Precedente figlio affetto da anomalia cromosomica Genitori portatori di anomalia strutturale dei cromosomi geneticamente bilanciata Genitori con riscontro citogenetico di mosaicismo cellulare Anomalie fetali osservate in ecografia Test biochimici indicanti un aumento del rischio cromosomico Malattia genetica Situazioni particolari devono essere valutate singolarmente con appropriata consulenza multidisciplinare che valuti i rischi generici del caso in oggetto ed i rischi connessi con il prelievo di cellule fetali Il completamento dell iter diagnostico può richiedere l estensione degli esami ai genitori i

3 ANALISI DI CELLULE DA LIQUIDO AMNIOTICO Per ogni liquido amniotico vanno allestite non meno di tre colture primarie, da mantenere in due diversi incubatori E buona norma usare due diversi tipi di terreno o due lotti diversi dello stesso terreno, per eliminare i rischi di contaminazione delle colture e/o scarsa crescita cellulare l

4 ANALISI DI CELLULE DA LIQUIDO AMNIOTICO Lo studio del cariotipo va eseguito analizzando cellule l provenienti tida un minimo di due colture primarie Per il metodo in fiasca vanno esaminate almeno 16 cellule derivanti da due colture indipendenti ed in cui sia cresciuto un minimo di 10 colonie in totale Per il metodo in situ vanno esaminate almeno 10 metafasi, una per colonia, provenienti da 2 o più colture indipendenti

5 ANALISI DI CELLULE DA LIQUIDO AMNIOTICO Indipendentemente dal metodo di coltura utilizzato devono essere analizzate almeno 4 metafasi, con un livello ll di risoluzione i non inferiore i alle 320 bande per il riconoscimento degli omologhi e con ricostruzione del cariotipo, di cui 2 su stampa fotografica o con sistema di analisi dell immagine In caso di mosaicismo è necessario aumentare il numero di In caso di mosaicismo è necessario aumentare il numero di metafasi/colonie analizzate esaminando altre colture ed eseguire un cariotipo per ogni linea cellulare trovata

6 ANALISI DI CELLULE DA LIQUIDO AMNIOTICO In caso di scarso bandeggio e scarsa crescita cellulare l è responsabilità di chi firma il referto dare le adeguate spiegazioni sui limiti del referto Si consiglia di non processare tutte le colture allestite per la diagnosi ma mantenere in vitro come riserva una piccola aliquota di cellule da utilizzare per ulteriori indagini. Ciò evita laripetizione del prelievo

7 ANALISI DA CELLULE DI VILLO CORIALE L analisi citogenetica dei villi coriali può essere eseguita Con metodo diretto Le cellule del citotrofoblasto, che sono in divisione spontanea, v engono analizzate dopo una breve incubazione Con metodo della coltura Il villo viene disgregato g con tecniche meccaniche o enzimatiche per permettere il rilascio di cellule dal mesenchima Queste proliferano in coltura e vengono utilizzate dopo circa una settimana di coltura Per una diagnosi affidabile è opportuno utilizzare entrambe le metodiche

8 ANALISI DA CELLULE DI VILLO CORIALE Per una diagnosi affidabile è opportuno utilizzare entrambe le metodiche Possono, infatti, verificarsi situazioni di discrepanza tra Il cariotipo osservato da metafasi ottenute con metodo diretto e quello osservato in metafase ottenute con metodo da coltura Il cariotipo osservato su villo coriale e quello osservato su altri tessuti fetali Se la quantità di villo coriale è inferiore a 10 mg, insufficiente per entrambe le metodiche, è preferibile optare per il metodo diretto perché esclude il rischio di analizzare cellule di origine materna

9 ANALISI DA CELLULE DI VILLO CORIALE MODALITA DI ANALISI (METODO SINGOLO) Nell analisi del cariotipo si contano almeno 16 metafasi e analizzando 4 metafasi per riconoscimento degli omologhi e ricostruzione cariotipo, di cui due su stampa fotografica o con analisi di immagine L eventuale presenza di un mosaico richiede l esecuzione di almeno un cariotipo per linea cellulare Nel caso del metodo da coltura si consiglia di analizzare metafasi provenientidapiùaree più aree dicrescita ottenute daalmenoduealmeno due colture indipendenti

10 ANALISI DA CELLULE DI VILLO CORIALE MODALITA DI ANALISI (COMBINAZIONE DEI METODI) Per l analisi del cariotipo vanno analizzate 4 metafasi, con un livello di risoluzione non inferiore alle 320 bande, mediante l appaiamento degli omologhi, 2 di queste con ricostruzione del cariogramma su stampa fotografica o con sistema di analisi di immagine Per la definizione del cariotipo si devono analizzare in totale almeno 16 metafasi provenienti idi dai preparati con entrambe le metodiche L eventuale presenza diunmosaico richiede l esecuzione dialmenoun L eventuale presenza di un mosaico richiede l esecuzione di almeno un cariotipo per linea cellulare ed il confronto dei risultati ottenuti con entrambe le metodiche

11 ANALISI DI CELLULE DA SANGUE FETALE L indagine citogenetica prenatale su sangue fetale viene eseguita solo in presenza di particolari iindicazioni i i Riscontro tardivo di condizioniad alto rischio di anaomalia cromosomica Malformazione fetale evidenziata ecograficamente Controllo dimosaicismo cromosomico e/o anomalie Controllo di mosaicismo cromosomico e/o anomalie strutturali riscontrati su amniociti o su cellulee di villi coriali

12 ANALISI DI CELLULE DA SANGUE FETALE Per l analisi del cariotipo del feto vanno contate almeno 16 metafasi, 4 devonoessere essere analizzate con appaiamento degliomologhi, due delle quali con ricostruzione del cariotipo su stampa fotografica o con sistema di analisi computerizzata. Nel caso di controllo di mosaicismo precedentemente riscontrato su amniociti o cellule di villi coriali devono essere contate almeno 100 cellule Se il numero di metafasi analizzabili non fosse elevato, per la diagnosi citogenetica si dovrebbe fare riferimento alla tabella di esclusione di mosaicismo cromosomico ed al relativo grado di confidenza (Hook 1977) La risoluzione del bandeggio non può essere inferiore a 550 bande

13 MOSAICISMO IN DIAGNOSI PRENATALE Ilmosaicismocromosomico cromosomico rappresenta unodeiprincipaliproblemi problemi diagnostici nella determinazione del cariotipo fetale sia da villi coriali che da liquido amniotico Mosaicismo fetale vero Mosaicismo confinato allaplacenta (CPM) Pseudomosaicismo Possono avere origine da Errore mitotico postzigotico precoce in un embrione diploide normale Un fenomeno di ricostituzione della disomia da un concepimento trisomico

14 MOSAICISMO IN DIAGNOSI PRENATALE VILLI CORIALI Il mosaicismo cromosomico può presentarsi in tre distinte situazioni I. L anomalia cromosomica a mosaico risulta presente solo nel citotrofoblasto, cioè osservata nelle metafasi ottenute con il metodo diretto e non in quello da coltura II. Ilcariotipo anomalo a mosaico siosserva solo nellacomponente mesenchimale del villo, indagabile con il metodo colturale e non nel citotrofoblasto III. La line a cellulare anomala è presente sia nel citotrofoblasto che nel mesenchima

15 MOSAICISMO IN DIAGNOSI PRENATALE VILLI CORIALI Ilriconoscimento diunacondizionedimosaicismoneivillicoriali nei coriali richiede generalmente una conferma nel secondo trimestre Nel caso in cui la linea cellulare anomala sia confermata si è in presenza di un mosaicismo vero, nel caso contrario si ha un CPM o un mosaicismo a basso livello non evidenziato Differenze nel cariotipo delle diverse componenti nell unità fetoplacentare vengono osservate nell 1 2% dei prelievi di villi coriali

16 MOSAICISMO IN DIAGNOSI PRENATALE LIQUIDO AMNIOTICO Si possono evidenziare tre livelli di mosaicismo I. Presenza di singola cellula con anomalia numerica e strutturale osservabile con una frequenza che varia dal 2,5 a 7 % nelle colture di amniociti II. Due o più cellule con la stessa alterazione provenienti da una coltura in fiasca oppure singola colonia o più colonie anomale osservate in una singola coltura in situ. Si è stimata una frequenza pari allo 0,7 1,1% III. Più metafasi o colonie osservate in almeno due preparati provenienti da due colture in fiasca diverse o da due colture in situ indipendenti

17 MOSAICISMO IN DIAGNOSI PRENATALE LIQUIDO AMNIOTICO I livelli I e II sono comunemente definiti come pseudomosaicismo Il livello III mosaicismo fetale vero La condizione di mosaicismo fetale vero osservata in prelievi di liquido amniotico è un fenomeno raro

18 DISOMIA UNI-PARENTALE (UPD) E l ereditarietà di due cromosomi omologhi da un solo genitore E causata generalmente da eventi di non disgiunzione, seguiti da meccanismi di correzione di trisomie o monosomie E associata, sembrerebbe, all età materna e può venire individuata inizialmente in forma di trisomia a mosaico durante la diagnosi prenatale, tl sia nel caso di prelievi i di villi coriali iliche nel caso di liquido amniotico Traslocazioni Robertsoniane e cromosomi marcatori soprannumerari sembrano associate ad un rischio aumentato di UPD

19 DISOMIA UNI-PARENTALE (UPD) INDICAZIONI PER LO STUDIO DI UPD Estensione dell indagine citogenetica a più tessuti fetali nei casi di osservato mosaicismo per escludere un mosaicismo fetale vero Esecuzione del test in tutti i casi in cui sia evidenziata la presenza Trisomia a mosaico per il cromosoma 15, in quanto è stata dimostrata la correlazione tra UPD materna e paterna e l espressione di fenotipi patologici come sindrome di Prader Willi e la sindrome di Angelman Trisomia a mosaico per i cromosomi 7, 11 e 14 per la provata esistenza di regioni di questi cromosomi sottoposte all imprinting correlata alla manifestazione di fenotipi patologici Traslocazione coinvolgente i cromosomi 14 e 15

20 REFERTAZIONE 1. L intero referto deve essere scritto su carta intestata del laboratorio in cui è stata eseguita l analisi 2. Deve essere riportata la data del prelievo e di arrivo in laboratorio del campione 3. La data del referto deve essere quella in cui si chiude e si firma l analisi. li i NO referti preliminari i i 4. Identificazione del paziente con cognome, nome, data di nascita e numero di accettazione, codice paziente nel laboratorio 5. Indicare il tipo di tessuto 6. L indicazione i all analisi li i può essere facoltativa ti 7. Il cariotipo fetale deve essere scritto secondo ISCN 95 e sue successive modifiche

21 REFERTAZIONE 8. La formula del cariotipo sia normale che patologico deve essere accompagnata da una descrizione comprensibile anche ai non specialisti 9. Il referto deve contenere una descrizione dei metodi utilizzati. In particolare per analisi su villi coriali va chiaramente indicato l eventuale utilizzo di entrambe le metodiche (diretta o coltura) 10. Va segnalato il numero di colonie, aree, metafasi e il numero delle colture indipendenti analizzate. Per i villi coriali deve essere specificare la provenienza del preparato. Il numero delle metafasi è facoltativo 11. Ogni analisi va firmato dallo specialista responsabile diretto dell analisi, con nome stampato.